紫杉醇的大规模培养及其影响因素

课程名称细胞工程

课题紫杉醇的大规模培养及其影响因素学院酿酒与食品工程学院专业生物工程姓名

学号

指导老师老师

紫杉醇的大规模培养及其影响因素

钟坤1

酿酒与食品工程学院生工112班

摘要：紫杉醇是一个从红豆杉植物中提取的对多种癌症都具有较好疗效的天然药物。近几年植物细胞培养生产紫杉醇的尝试性研究不断有突破性进展，综合当今研究报告，对利用植物细胞培养大规模生产紫杉醇过程及其影响因素作一定的分析与概述。

关键字：紫杉醇、细胞培养、红豆杉、影响因素

紫杉醇是一种复杂的天然的抗癌药物，属于二萜生物碱，其基本结构由浆果赤霉素Ⅲ和连接其13位碳上一苯丙氨酸衍生物构成。1982年紫杉醇开始在临床上进行试验，1989年完成II期临床，1990年进行Ⅲ期临床，1992年12月29日美国正式批准用于晚期卵巢癌、肺癌、子宫癌的治疗。它是经认证、目前最好的天然抗癌药物之一，可广泛用于肺鳞癌、肺腺癌、乳腺癌、睾丸胚胎癌、卵巢癌、恶性胸腺癌、胆囊癌、食道癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、膀胱癌、生殖细胞癌、头颈癌等肿瘤的治疗，特别是晚期卵巢癌的治疗。1995年中国医学科学院药物研究所研制的国产紫杉醇原料(从云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和美丽红豆杉五种植物中提取，纯度达98％以上)、据估算，从1000~2000棵稀有的紫杉树皮中只能提取lkg紫杉醇，而对l例病人制各充足的药物需3～4棵百年的老红豆杉树。由于红豆杉属植物中紫杉醇的含量极低，远远不能满足市场的要求。为了解决紫杉醇供需之间的尖锐矛盾，多年来，科学家在寻找及扩大紫杉醇药源途径方面做了大量工作，紫杉醇的全合成已取得成功，但皆因路线长，收率低等原因目前无法实现工业化．化学半合成是一条扩大紫杉醇来源的较好途径，国外已用半合成法生产紫杉醇，但化学半合成所用前体巴卡亭III和10一去乙酰巴卡亭III等仍要依赖于从红豆杉属植物中提取，限制了它的应用，利用植物细胞培养技术生产紫杉醇是一种大有前途的途径。

用植物细胞培养与紫杉醇的生产的原因

植物组织细胞培养被认为是紫杉醇的一个有希望的长期资源。这是因为(1)

不破坏资源。尽管红豆杉植物的数量很少,但作为细胞培养的起始原料只需极少量,建立起组织培养后就不再需要红豆杉植物材料了,可一代代在全人工的控制下繁殖下去。还保护了红豆杉资源和维持了生态平衡。(2)不需要栽培,它不受地区、季节、病虫害及其它自然因子的影响。(3)细胞悬浮培养具有相对较快的增殖速率。(4)高产细胞株可通过从高产植物建立并筛选获得。(5)培养物为较均一的细胞,容易进行大规模培养。(6)可以通过改变培养基成分等进行培养条件的人为控制来得到理想的产量。

1 愈伤组织诱导及培养

红豆杉属木本、裸子植物,愈伤组织诱导比较困难,生长较缓慢。现在,已从各种不同的红豆杉的不同的外植体如:针叶、幼茎、树皮、形成层、种胚、假种皮等诱导出愈伤组织其中以幼茎为最好的来源,而外植体中的紫杉醇并不影响愈伤组织的诱导。愈伤组织的诱导和培养的最适培养基是改良B5培养基,愈伤组织培养也大多采用B5培养基。利用农杆菌转化紫杉外植体得到转化的愈伤组织表现出更快的生长速度,而且也能合成紫杉醇,甚至其紫杉醇含量超过了非转化的愈伤组织。实验中,往往是通过改变植物激素(KT、2, 4-D、GA3、NAA、IBA等)的种类和加入量来促进紫杉愈伤组织的生长。激素的浓度一般为0. 1-1. 0毫克/升。过高的激素浓度反而会抑制愈伤组织的生长。

一般情况下,两周左右愈伤组织可以从外植体上长出，在开始的30～40天,愈伤组织生长迅速,然后其生长速度变慢。如果不进行继代培养, 50天左右愈伤组织会褐化,直至死亡。新诱导的愈伤组织至少15～25天要进行继代。培养初期,即使继代,愈伤组织也易分泌橙红色色素或发生褐化,使生长速度减慢,甚至死亡。这是愈伤组织分泌的酚氧化成醌类物质造成的。在培养基中加入还原剂如:半胱氨酸、维生素C、脱落酸等,或吸收酚类的物质如:聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、活性炭等,可以减少致死现象,保持愈伤组织的生长活性，但是由于吸附剂对营养物质和激素的吸收,较高浓度的吸附剂会部分地抑制愈伤组织的生长。愈伤组织在培养初期生长较快,但随后的6～12个月里,其生长速度减慢,并持续1～2年。光照也会抑制愈伤组织的生长。

2.摇瓶液体悬浮培养

只有当愈伤组织经过长时期固体培养,表现出相当的生理稳定性后,才能进

行悬浮培养。同时,摇瓶培养也是生物反应器培养的基础,只有摇瓶培养生长良好,生理、遗传特性稳定,紫杉醇合成能力相对较高并且稳定的细胞系才能用于进一步的放大培养。植物细胞从固体培养向悬浮培养过渡,需要有一个适应过程。在此过程中，使紫杉细胞悬浮培养的颗粒比较均匀,生长良好。驯化过程在25℃进行暗培养。每个300毫升的三角瓶装100毫升培养液,摇床旋转速度145 rpm,定期用0. 76×0. 76的不锈钢筛网对细胞进行过滤,并换成新鲜培养液，可以说,植物细胞培养的放大操作过程完全是微生物培养过程的移植。因此,在对悬浮培养进行研究时,研究者们不可避免地沿用了微生物培养研究的思路。研究工作包括对细胞培养培养基组成的改良,细胞培养过程中的物理条件如:温度、接种量、光照强度等,化学条件如: pH值等的改变以使细胞达到最大的生长率和产物合成。紫杉细胞液体培养也大都选用改良B5培养基。当然,植物细胞具有其特殊的生理特性,研究方法也必然有相当特异性如:培养基的组成要考虑到植物激素种类,浓度对其生长和产物合成的影响,细胞聚团的生理特性,二氧化碳、乙烯对植物细胞的特殊意义等等。植物细胞液体培养过程需要一个最小的接种量,低于这个接种量,植物细胞生长减慢甚至停止。紫杉细胞培养接种量不应低于每升70克细胞(鲜重),接种量低于每升50克细胞时,生长停止。接种量在每升80-110克细胞,其生长速度没有明显差异。而且不同浓度糖对紫杉细胞紫杉醇合成的影响,发现果糖是紫杉醇合成的最适碳源,而且利用高浓度糖来进行培养也是可行的。植物细胞具有很强的pH自我调节能力。在pH 3. 0～7. 0下培养,到21天收获时,紫杉细胞生长量基本相当。但比较起来, pH 5. 0对紫杉细胞生长更为适宜芳香羟酸和氨基酸的加入对细胞紫杉醇合成的影响。利用芳香族氨基酸和芳香羟酸刺激紫杉细胞合成紫杉醇显示,丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸、N-苯甲酰甘氨酸、苯甲酸等的加入都不同程度地刺激了紫杉醇的合成,而其中,苯甲酸和酪氨酸的作用最大。紫杉醇的合成主要发生在细胞生长后期,即静止期,表现出非生长偶联特征。因此,紫杉醇合成促进物的加入也应是在生长基本结束的第26天。但这些物质的加入浓度过高时(如10 ppm)会使悬浮细胞褐化,不利于其生长和紫杉醇的合成。对此,可能有5条原因所导致。一是碳源的多条次级代谢途径:二是次级代谢物合成关键酶的低活性(包括酶表达水平和酶活水平);三是细胞内缺乏次级代谢物的合适的储存位点和运输机制;四是产物的进一步代谢、分解和利用;五是