浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略

摘要

动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术。近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生命科学、生物医药学等多个学科的研究和生产领域，成为广泛采用的技术手段，许多生物技术科学研究都离不开细胞培养。本文从细胞培养的基本操作方法入手，介绍了动物细胞体外培养的主要影响因素，以及对细胞实验室无菌环境的防控策略。

关键词：细胞体外培养；影响因素；无菌环境；防控策略

目录

摘要 ................................................................................................................................................... I 1引言 .. (1)

2基础理论概述 (1)

2.1细胞培养的概念 (1)

2.2原代细胞培养的概念 (1)

2.3传代细胞培养 (2)

3影响细胞体外培养的因素 (2)

3.1细胞分离方法 (2)

3.1.1直接分离法 (3)

3.1.2酶消化法 (3)

3.2细胞培养温度 (3)

3.3细胞培养基的成分 (3)

3.3.1天然培养基 (3)

3.3.2合成培养基 (3)

3.4接种密度 (4)

3.5培养基的pH值 (4)

3.6细胞的冻存与复苏 (4)

3.6.1细胞冻存 (4)

3.6.2细胞复苏 (5)

4细胞实验室无菌环境的防控策略 (5)

4.1无菌室的彻底消毒 (5)

4.2培养用品的清洗和消毒灭菌 (6)

4.2.1清洗 (6)

4.2.2消毒灭菌 (6)

4.3培养试剂的分装与保存 (7)

4.4对操作者的要求 (7)

5结语 (8)

参考文献 (9)

致谢 (10)

浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略

1引言

细胞体外培养技术由于具有简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测实验结果，以及方便控制培养产物等优点，在医药领域已成为研究发病机理和筛选药物的重要手段，在分子生物学领域，利用细胞培养技术，结合细胞融合、细胞杂交以及转基因技术，进行基因重组、组织构建，成为分子遗传和组织工程研究者的重要研究工具，利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分。

近年来，分子生物学和分子遗传学获得巨大进展，培养细胞技术被广泛应用于该领域的研究，这些培养的细胞已成为基因工程、遗传工程、体细胞克隆、转基因动物、生物制药、干细胞、微生物学、细胞生物学、遗传学、病毒学、免疫学等学科研究的有力工具和重要途径。

2基础理论概述

2.1细胞培养的概念

细胞培养是指将细胞从机体中取出，人工模拟机体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等的研究工作，是维持细胞结构和功能的体外培养方法。2.2原代细胞培养的概念

原代培养是指取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养，这是细胞培养的最初和必经阶段。培养方法包括：单层细胞培养和悬浮培养。

(1)单层细胞培养：将取下的组织块无菌剪切后，用0.25%胰酶消化，使细胞分离，再用无菌Hanks液或0.85%NaCl溶液洗涤后，置培养皿或培养瓶中培养。

(2)悬浮培养：悬浮培养的细胞多取材于血液或体腔液，一般采用离心法分

离细胞，低速500-1000r/min，离心5-10min即可。培养时，只要取适当浓度的细胞悬液接种于完全培养液中，细胞就能增殖。

2.3传代细胞培养

传代细胞培养是指细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中，即当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养。根据原代培养物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系或细胞株。这些细胞一般可顺利传40-50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系／株。一般细胞原代培养1-4周后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，影响细胞的生长繁殖。

在细胞传代的过程中，有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株。传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。人传代次数与个体年龄成反比：人胚胎40-60代；幼年20-40代；成年10-30代；得了早老病的儿童2-10代。传代培养的方式主要有：贴壁型细胞传代和悬浮型细胞传代。

(1)贴壁型细胞传代：传代时需要用胰酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用ＥＤＴＡ溶液与胰酶按体积比为1:1或1:2比例混合后联合使用。过滤除菌后小量分装，于-20℃保存。消化时吸去培养瓶内的培养液，加入适量的ＥＤＴＡ溶液与胰酶的混合液，以能覆盖细胞层为宜，将培养瓶平放，37℃作用3-5min，加入Hanks液，1000r/min离心5min即可除去消化液，洗1-2次后加入完全培养液，计数，置培养皿或培养瓶中培养。

(2)悬浮型细胞传代：传代时用吸管将细胞吹打均匀，特别是一些成团生长的细胞，应将细胞团块打散。根据细胞生长状况的不同，用吸管将细胞悬液吸去适当的量，然后再加入完全培养液至原体积

3影响细胞体外培养的因素

3.1细胞分离方法

细胞分离方法细胞培养之前，首先要进行组织块的分离，其主要方法包括：

直接分离法（包括机械法和EDTA螯合法）和酶消化法（包括胰蛋白酶消化和胶原酶消化）。

3.1.1直接分离法

该方法分离得到的细胞数量没有酶消化法得到的多，但可满足一般实验的要求，该方法的优点是操作流程简单，不需要复杂的仪器和昂贵的胶原酶。

3.1.2酶消化法

多用于新生动物组织或动物胚胎的肝细胞培养。胰蛋白酶消化法具有分离效果好、操作简单和价格便宜的特点，因为胰酶消化的条件很难掌握，所以未被广泛应用；胶原酶消化法具有分离效果好、细胞产量高（即时存活率高、对细胞损伤小）、维持细胞特异性功能的时间长等优点。

3.2细胞培养温度

不同种类的动物细胞对温度的要求并不一致，如人和哺乳动物的细胞培养温度为35-37℃，鸟类细胞培养温度为38.5℃，鼠类细胞为34℃。一般来说，细胞对低温的耐受力比高温强。因此，在细胞的培养过程中要及时地根据细胞的类型调整适宜的温度。在使用恒温培养箱时，箱内温度应维持在37℃、CO2体积分数为5%。

3.3细胞培养基的成分

培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基，按其来源分为天然培养基和合成培养基。

3.3.1天然培养基

最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。质量好的血清应该是无溶血、橘黄色清亮透明、无细菌、无支原体污染的黏稠状液体。血清的体积分数要控制在5%-20%，当超过30%时反而不利于细胞生长，过高或过低的血清体积分数都不利于细胞的生长和增殖。一般将血清保存于-20℃以下，时间不易过长。

3.3.2合成培养基

合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化