浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略
浅谈细胞培养中微生物污染与防控措施
生长 可证 明该 细胞受 到 了细菌 的污 染 。 １２ 支原 体 污 染 ． 支 原 体 污 染 不 能 用 肉眼 或 光 学显 微镜 检查 细胞观 察 出来 ， 带有 一 定的 隐蔽 性 ， 易被 人们忽 视 。 当细胞 被支 原体 污染 后 ， 细胞营 养 液可 能毫无 变 化 ，短 期 内细胞 没 有 明显 的病理 变
性 作用 ，因此 特 别要注 意不 同的细胞 培养 的特 点
培养 基上培 养 ， 如果见 到培养 基上 有霉 菌 生长 ， 也 可 以判 断该 细胞 受到霉 菌污 染 。霉 菌 污染 可 以使
细胞变 形 、 脱落 。霉菌孢 子对 环境 的耐 受 力很强 ，
和 对抗 生素 耐受程 度 的不 同。在对 具 体 的细胞选
种 营养 成分 隐性污 染细菌 没有 被检 测 出来所 造 成 的。 即使在 细胞培 养液 中加 入 了抗菌 素 ， 得细 菌 使
繁殖 处于 抑制状 态 ， 细胞 生长 不受 明显 影 响， 易 不
即淘汰 该细 胞和 培养 液 。 外 ， 此 支原 体污 染还可 用
荧光 染色法 ［ 和相 差显 微镜 观察 法 ［ 检测方 法 。 ｓ 等 １３ 霉菌 污染 ． 霉 菌污 染和 细 菌污 染 比较 相似 ， 都 可 以 由无 菌操 作环 境差 或者 器材 等 消毒 不彻底 造 成 。霉菌 污染 经 常发 生在潮 湿 的季节 或 者潮湿 的操 作环境 。可 以通 过 肉眼观 察细 胞 生长和 培养 基 培养 的方 法来检 测 霉菌 污染 。霉 菌短 期 内不会 引起 营 养液 的浑浊 ，但 是在 细胞 瓶壁 可 以见 到 明
广 东畜牧兽 医科技
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经验交流 ・９ ４・
细胞培养常见问题的原因及对策
细胞培养常见问题的原因及对策细胞培养中的注意事项1 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。
血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。
CS (calf serum) 则是指小牛血清。
HS (horseserum) 则是指马血清。
6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。
当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。
7 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
细胞培养中的污染问题与对策
细胞培养中的污染问题与对策细胞培养是一种常见的实验室技术，用于研究细胞的生长、分化和功能。
然而，在进行细胞培养的过程中，污染是一个不可忽视的问题。
污染源可以来自外部环境、工作环境或实验操作不当。
对于细胞培养的研究结果的准确性和有效性而言，解决污染问题的对策至关重要。
首先，污染问题可能来自实验室环境以及操作者自身。
实验室环境中存在的微生物污染可能会导致细胞培养的受损。
因此，保持实验室环境的清洁是非常重要的。
定期进行实验室卫生和表面消毒是降低微生物污染的有效措施。
此外，操作者在进行细胞培养时需要严格遵守无菌操作规程，以减少自身的污染对细胞的影响。
操作者需要穿戴合适的实验室清洁工作服、手套和口罩，并在操作过程中注意避免直接接触细胞培养物。
其次，细胞培养中使用的培养基和试剂也是潜在的污染源。
为了避免污染，选择高纯度的培养基和试剂是至关重要的。
购买来自可靠供应商的培养基和试剂，严格遵循使用说明书的指导，可以减少产品本身的污染。
此外，在实验进行过程中，避免将培养基和试剂暴露在不洁的环境中，并妥善保存这些试剂，以防止其受到污染。
另外，细胞培养过程中的传代也是容易导致污染的环节。
细胞传代是保持细胞生长的关键步骤，但传代时的细胞污染可能会导致细胞功能和表型的变化。
为了避免细胞污染，应该定期对细胞进行鉴定和检测，特别是使用发展中的分子标识技术。
这些技术可以帮助确定细胞是否保持纯种，以及是否受到污染。
此外，定期保存冻存品库并且用来传代的细胞不要超过特定的传代次数，以保持细胞的良好生长状态。
另一个需要关注的污染问题是培养器具的污染。
培养器具包括培养皿、培养瓶、移液器等。
这些器具在使用之前需要经过高温高压灭菌处理，以确保其无菌状态。
在使用过程中，需要注意避免直接接触器具内外部分，以减少污染的可能性。
同时，定期更换使用的培养器具也是非常重要的，以防止积累污染物。
最后，除了以上提到的对策，培养载体选择也可以在一定程度上减少细胞培养时的污染问题。
细胞培养过程中的污染及预防
细胞培养过程中的污染及预防由于环境条件没有控制好和操作不当等原因，细胞培养中常可发生细菌和霉菌的污染。
常见污染的细菌有：革兰氏阴性菌，如大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等；革兰氏阳性菌有葡萄球菌等。
真菌污染在炎热潮湿的季节常可发生，如烟曲霉菌、黑曲霉、毛霉菌、孢子苗等。
霉菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长或杀死细胞，镜下可见胞浆内出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃从壁上脱落。
对于污染的观察，霉菌污染易于发现，肉眼可见白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，有的散在生长，镜下可见丝状菌丝，纵横交错于细胞之间。
而细菌污染较重时可见培养基上清浑浊，较轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动，同时可涂片染色镜检或进行培养及培养加以确定。
目前细胞培养过程中最主要的问题就是污染，污染可导致细胞的死亡，使其作为科研的原料不可再用，造成人力、财力和实践的损失，因此一定要尽量避免污染的发生。
一般可从以下三个途径来控制污染的发生：一、细胞培养的室内环境细胞培养室内应相对封闭，洁净无尘，设有缓冲间。
细胞培养间配备枪式移液器、手术器械、离心机、冰箱等专用仪器设备以及专用的实验服和拖鞋，定期消毒。
专用物品只在培养间内使用，不得带出培养间。
培养间和缓冲间每周彻底清洁消毒一次。
二、细胞培养的试剂和用品工作中要特别注意防止培养液和血清的污染。
培养细胞所用的血清必须储存于-20至-70℃，但也不能超过一个月，解冻时在4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，在溶解过程中要规则摇晃均匀，使温度与成分均一，这样可以减少沉淀。
最好不要直接在37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
三、无菌操作和对实验人员的要求有很多污染的发生都与操作不当有关，而细胞培养试验的操作应是严格的无菌操作。
首先试验进行前，无菌操作台面、废液缸及实验用品均应用紫外灯照射30-60分钟灭菌；以75%酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后方可开始实验操作。
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法：问题1培养液pH值变化太快可能原因(1)CO2张力不对(2)培养瓶盖拧得太紧(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足(4)培养液中盐浓度不正确(5)细菌、酵母或真菌污染建议解决方法(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。
(2)松开瓶盖1/4圈。
(3)改用不依赖CO2培养液。
加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。
(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。
(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变可能原因(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来(2)冰冻保存培养液建议解决方法(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。
(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化可能原因细菌或真菌污染建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题4：培养细胞不贴壁可能原因(1)胰蛋白酶消化过度(2)支原体污染(3)培养瓶瓶底不干净(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)(7)接种细胞起始浓度太低或太高建议解决方法(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
(2)分离培养物，检测支原体。
清洁支架和培养箱。
如发现支原体污染，丢弃培养物。
(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)(5)重新配置消化液或培养液启用新的保种细胞(7)调节最佳接种细胞浓度问题5：悬浮细胞成簇可能原因(1)培养液中含钙、镁离子(2)支原体污染(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释(4)DNA污染建议解决方法(1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
细胞培养中的微生物污染预防与处理
细胞培养中的微生物污染预防与处理细胞培养作为一种重要的实验手段，在生物医学研究领域中得到广泛应用。
然而，在细胞培养的过程中，微生物污染往往成为一个严重的问题，可能对实验结果产生不良影响甚至导致实验结果的无效化。
因此，预防和处理细胞培养中的微生物污染是细胞培养实验中不可或缺的一环。
首先，预防细胞培养中的微生物污染至关重要。
以下是一些有效的预防措施：1. 严格执行无菌操作：细胞培养实验中，无菌操作是最基本也是最重要的环节。
在进行培养操作前，实验人员应该经过相关的培训和指导，了解无菌操作的正确步骤和技巧。
例如，在实验操作前经常更换手套、使用经过有效消毒的培养器具和培养基等。
2. 经常清洁和消毒实验环境：实验室环境和设备的清洁和消毒是预防微生物污染的另一个重要方面。
实验室的工作台面、实验室衣物、培养箱、孵化器等都需要经常进行清洁和消毒，以减少微生物的存在和传播。
3. 控制空气中的微生物：空气中的微生物往往是细胞培养中的污染源之一。
为了降低空气污染带来的风险，实验室应该配备高效过滤器的实验室通风设备，定期更换过滤器。
此外，实验室应该设置限制进出实验室的措施，例如，安装空气帘或者设置冲洗区域。
4. 识别和处理污染源：在细胞培养中排查和识别潜在的污染源是很重要的。
实验人员应经常检查培养器具、培养基和试剂等是否存在污染，一旦发现污染，应及时处理。
处理污染源的方法包括更换受污染的培养器具、重新配制新的培养基或试剂等。
其次，当细胞培养中发生微生物污染时，采取适当的处理方法也是至关重要的。
1. 立即停止受污染的实验：一旦发现细胞培养被污染，实验人员应立即停止受污染的实验，并将受污染的培养器具和培养基等隔离处理，以防止污染的进一步传播。
2. 进行污染源检查：在处理微生物污染的同时，必须找出污染源，并加以处理。
通过对培养器具、培养基和试剂等进行检查，可以找到导致污染的原因，进而采取相应的措施。
3. 清洁和消毒工作环境：在处理污染源的同时，必须对实验室的工作环境进行清洁和消毒。
细胞培养中的常见问题解决方法
细胞培养中的常见问题解决方法细胞培养是生物医学研究和药物开发中不可或缺的重要工具。
然而，细胞培养过程中常常会遇到一些问题，例如污染、细胞凋亡、不适当的生长条件等。
本文将介绍细胞培养中的一些常见问题以及相应的解决方法。
1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中最常见的问题之一。
它可能是由细菌、真菌、酵母、病毒等微生物引起的。
污染会导致细胞生长受阻、实验结果的不可靠以及其他严重后果。
为了解决这个问题，可以采取以下几种方法：- 严格按照无菌操作操作培养细胞。
使用无菌操作条件，包括在无菌环境下穿戴手套、使用消毒液清洗操作台面和器具、对培养皿和培养物进行灭菌处理等。
- 经常检查细胞培养物的外观。
细胞培养物应呈现透明、均匀的状态。
如果有任何可疑的异常，请及时进行检查和处理。
- 使用含有抗生素的培养基。
对于某些细胞株来说，添加适量的抗生素可以阻止细菌等污染物的生长。
2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一个重要阶段，但在细胞培养过程中，过量的细胞凋亡会导致细胞数量的减少，对实验结果造成不利影响。
以下是一些常见的细胞凋亡问题及其解决方法：- 减少细胞培养的过度处理。
频繁的细胞移植和传代会导致细胞凋亡增加。
适当延长传代周期，避免过多的细胞移植。
- 提供适当的细胞营养来源。
细胞需要足够的营养物质来维持正常的生长。
不合适的培养基组分或者浓度可能会导致细胞凋亡。
确保培养基中的营养物质符合细胞的需求，并根据细胞株的特点进行相应的调整。
- 坚持细胞培养的无菌操作。
如前所述，细菌或其他微生物的污染会导致细胞凋亡的增加。
通过无菌操作避免细胞污染，继而减少细胞凋亡。
3. pH值失调培养基的pH值是细胞培养中一个重要的生长条件。
pH值的不稳定性会影响细胞的代谢和生长。
以下是一些解决pH值失调的建议：- 定期检测和调整培养基的pH值。
使用pH计或试纸进行测定，及时调整pH值，保持在适宜的范围内。
- 确保培养基的配制正确。
细胞培养基的配制过程中，需要严格按照配方中所指定的浓度和比例添加各种成分。
细胞培养技术中常见污染问题的解决方法
细胞培养技术中常见污染问题的解决方法细胞培养技术在生物医学研究领域扮演着重要的角色。
然而，细胞培养过程中常常会出现一些污染问题，严重影响实验结果的可靠性和重复性。
本文将探讨细胞培养技术中常见污染问题的解决方法。
一、细菌污染在细胞培养过程中，细胞培养器皿、培养基和实验室环境中都可能存在细菌污染的问题。
为了解决这个问题，可以采取一些预防措施。
首先，必须定期清洗和消毒培养器皿，以确保其表面的无菌。
其次，使用高品质和无菌的培养基是防止细菌污染的关键。
培养基应在严格无菌条件下配制，并在每次使用前进行相关的质检。
此外，实验室环境的洁净度也需要保持，经常进行清洁和消毒，减少细菌的滋生和传播。
二、真菌污染真菌污染是细胞培养中常见的问题之一，尤其在湿度高的环境下更容易发生。
为了避免真菌污染，可以在实验室中合理控制湿度，并保持培养器皿和培养基的干燥。
此外，使用抗真菌剂可以有效地减少真菌感染的风险。
对于一些特定的细胞系，可以对细胞培养器皿进行预处理，如用乙醇或己硝酸等消毒剂进行表面处理，以提高培养器皿的抗真菌能力。
三、交叉污染细胞系的交叉污染是实验室中常见的问题。
它可能是由于不慎携带其他细胞系的污染物，或是在培养中不同细胞系之间的相互感染所致。
为了防止交叉污染，可以采取一些措施。
首先，实验人员在操作细胞系之前必须养成良好的个人卫生习惯，包括洗手、戴手套等。
其次，不同细胞系之间要严格分开培养，避免接触。
此外，可以对新获得的细胞系进行鉴定，使用PCR等方法进行验证，确保其纯度。
四、内源性污染内源性污染是指细胞系自身产生的污染物。
它可能是由细胞自身分泌的代谢产物、去胎氧核糖核酸或细胞死亡引起的。
为了解决这个问题，可以采取以下措施。
首先，要定期更换培养基和培养器皿，及时清除废液和死细胞。
其次，对细胞进行经常性的鉴定，确保其活性和稳定性。
同时，培养温度、培养时间等因素也需要加以调整，以减少内源性污染的发生。
综上所述，细胞培养技术中常见的污染问题是可以通过一系列的控制措施来解决的。
体外细胞培养的污染和控制
辅助 目标 来 看 ，仔猪 与 白条 肉价 格 已经 低于 Ｏ７ ．： ｌ截 至 三 季 度 末 ， 猪 存栏 为 ４５ ， 生 ．６亿 头 ， 能繁 母 猪存 栏 为 ４９ ６６万 头 ， 于 国家 设 定 的辅 助 目标 ， 高
以 引起 细 胞 代 谢发 生 改 变 ， 细 胞 同 步化 、 胞 生 如 细
长受 抑制 ， 甚至 细胞 死亡 。
对物 理性 污染 ， 过实 验室 的合 理设 计及 建立 通 规 范的操 作规 程 ， 减少环 境 中物理 因 素对 细胞 的影 响 。培 养箱应 放在 恒温 的环 境 中 ， 养液 及试 剂应 培
体 外培 养细 胞 自身 没有 抵抗 污染 的能 力 ， 养 培 液 中的抗 生素抗 污染 能 力有 限 ， 养 细胞 一 旦发 生 培 污染 多数将 无法 挽 回 。外界 的微 生物 如 昆 虫 、 肢 节
动 物 、 虫 、 菌 、 毒 、 菌 、 细 胞 壁 的微 生 物 原 霉 病 细 无
生物性 污 染 。
培 养液 、 养 附 加 成分 、 剂都 可能 成 为化 学 性 污 培 试
染 的来源 ， 玻璃 制 品在清洗 过 程 中残 留的变性 剂 或
肥皂 是最 常见 的化 学性污染 。 针对化 学污 染 的来源 及性 质 ， 采取 以下措 施 应 来 控制污 染 ：
细胞培 养使 用 的所有 物质 都应 是 高纯 度的 ， 并 经过 权威 机构 的鉴 定 ， 验者 本人 也应 对上 述成 分 实
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畜禽 养 殖 业 Ｍ ｄｒ ｎ ａ Ｈ ｓａｄｙ 。ｅｎＡ ｉ ｌ ｕｂｎｒ ｍ
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细胞培养教学中的常见问题及应对措施
细胞培养教学中的常见问题及应对措施标签：细胞培养;实验教学;评价标准细胞培养技术已经成为当今生命科学各研究领域的基本技术,是生命科学工作者必备的实验技能。
细胞培养的成败受细胞生长的各种条件,个人操作手法、操作环境、使用器具等多种因素的影响[1]。
在多年的教学实践中,笔者发现细胞培养过程一些常见的问题直接影响到教学的顺利进行,针对这些问题,笔者采取了一些应对措施,取得了较好的效果。
1 细胞培养教学中的一些常见问题1.1 培养的细胞易被污染离体培养的细胞没有抗感染能力,因此防止污染是细胞培养成败的关键。
笔者在教学中发现因各种因素导致学生培养的细胞被污染的比例达30%~40%。
1.2 细胞培养对操作环境要求高,不易组织教学细胞培养需要在无菌室的超净台中进行,空间较小,教师无法面对大量的学生进行实验示教,因此在组织教学上有一定的困难。
1.3 实验过程较长,操作步骤多,不易监控细胞培养实验的特点是实验的前期准备工作多,实验过程长,操作步骤多。
进行一轮完整的实验,往往需数天时间,而且在实验过程中,学生来做实验的时间不固定,因此教师不容易对学生的实验全过程进行监控。
1.4 实验评价标准单一,不适于这一类实验的教学以往对学生细胞培养实验的评价是以学生培养的细胞的生长状况和实验报告为依据,其缺陷是只注重结果而忽视实验的过程,而学生是否真正掌握细胞培养技术,主要体现在实验的过程中。
笔者曾在中国科学院生物物理研究所、北京大学医学部、解放军传染病研究所等国内一些重点实验室学习和进修,虽然细胞培养只是这些实验室最基础的一种技术,但其做细胞培养实验的一些有益的经验非常值得参考和借鉴。
笔者针对在教学中学生经常出现的一些影响实验教学的问题,综合这些经验,提出了相应的处理对策。
2 应对措施2.1 完善细胞培养室设施,规范实验操作步骤2.1.1 细胞培养室应单独隔离出来专用,能建立一定清洁级别的培养室是最好的,考虑到用于教学的实验室需要较大的面积,可能不易达到这样的清洁级别要求,但至少要有一个洁净的环境和隔离出一个专用的无菌区[2]。
浅谈细胞培养的污染及防治
浅谈细胞培养的污染及防治污染是细胞培养中面临的主要问题；细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。
虽然每一种细胞有其独特的培养体系，但是污染造成后果也不尽相同。
某些污染的发生往往难以察觉检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类污染事实上大部分被人们忽视了。
培养的细胞作为个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变；对生产和实验结果造成潜在的威胁。
物理、化学及生物因素都可能对培养环境造成污染。
其中的生物性的污染对细胞的危害最大；微生物代谢消耗大量需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。
因此，认识细胞培养污染的途径及其危害性，建立细胞培养规范的操作方法及规章制度，可以有效地防止污染保证细胞培养的稳定性和可靠性。
1 污染的分类。
1.1物理性污染物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。
物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。
培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。
细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。
通过生产的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。
温室（或恒温箱）的温度尽量保持恒定和均匀，温度一般在37.5±05℃；生产细胞用的消化液和培养液的温度为20℃左右；以避免过冷的温度对细胞的影响。
转瓶培养时，转速为8-10r/h。
1.2化学性污染培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。
化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。
不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。
培养基、试剂、水、血清、生长辅助因子及器皿都可能成为化学性污染的来源。
细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。
植物组织培养中污染的分析及防控对策
植物组织培养中污染的分析及防控对策植物组织培养是一种重要的生物技术，在植物育种、繁殖、生产等方面都具有广泛的应用。
然而，在实际操作过程中，难免会出现各种污染问题，如细菌、真菌、病毒等。
这些污染会严重影响培养物的生长和发育，降低培养的成功率和品质。
因此，对植物组织培养中污染的分析及防控对策需要特别重视，以确保培养物的质量和数量。
一、污染的影响1. 生长受阻细菌、真菌和病毒会侵入植物细胞或其周围环境，抑制细胞分裂和生长，导致细胞不能正常地向培养基中分化和生长，进而影响到整个培养物的发育。
2. 变异增多植物细胞在体外培养过程中往往会出现变异，不过这种变异一般是基因层面的，而污染则会导致细胞形态上的变异，甚至是基因造成的异常表达。
3. 腐烂和死亡细菌和真菌会分解培养基中的有机物，而这些有机物也是培养生长的重要因素。
所以，一旦培养基受污染，其成分和含量都会发生变化，导致植物细胞死亡或腐烂。
二、污染的分类分析和识别污染源也是非常必要的一步，这有利于我们在后期的操作中加强管理和控制。
其主要分为三类：1. 真菌或霉菌污染真菌或霉菌污染是比较常见的一种污染，往往会导致真菌或霉菌孢子侵入培养物中，产生白色丝状物或橙色孢子团，不利于培养物的清晰观察。
2. 细菌污染细菌污染是植物组织培养中比较常见的类型，它会导致细胞生长受阻，表现为发黄或出现不规则黑斑，甚至在割裂的器官上出现腐烂。
3. 病毒污染病毒污染也是较为常见的，因为病毒经常侵入植物细胞中，与其DNA和RNA交互，导致生长受阻或死亡。
识别病毒污染的方法可以根据病毒所引起的症状进行分析。
三、防控策略针对植物组织培养中的污染问题，必须采取一系列的预防和控制措施，以使植物组织培养体系能够有效地保持健康和发育。
1. 无菌操作在进行植物组织培养时，必须确保无菌条件。
在操作前，必须对工作台、培养器、器具进行彻底消毒，清洁过程中要注意不污染设备表面，严格遵守无菌操作要求。
2. 选择良好的初始材料在进行组织培养前应选择健康、生长良好的植物组织作为起始物质，这样可避免由于起始材料本身带来的病原微生物的污染，减少进一步污染的风险。
细胞培养技术中的常见问题与解决方法参考
细胞培养技术中的常见问题与解决方法参考细胞培养是生物学和医学研究中非常重要的一项技术。
然而，在进行细胞培养过程中，我们常常会遇到一些问题。
本文将介绍几个细胞培养中常见的问题，并提供相应的解决方法参考。
1. 细胞污染问题细胞污染是细胞培养中最常见的问题之一。
它可能来源于细胞培养器皿、培养基、试剂、液体气氛等多个方面。
常见的细胞污染类型包括细菌、真菌、酵母菌、支原体、霉菌等。
遇到细胞污染问题时，可以采取以下解决方法参考：- 严格的无菌操作：所有实验应该在无菌条件下进行，使用经过验收的培养器皿和无菌试剂。
- 经常检查和更换培养器皿、培养基：经常检查培养器皿和培养基是否有异常情况，如有污染应及时更换。
- 预防细胞污染：定期进行表面消毒、培养器具灭菌和试剂消毒以预防其他污染来源。
2. 细胞生长问题细胞生长问题是细胞培养过程中常见的一个问题。
主要表现为细胞无法黏附、生长缓慢或停止生长。
解决细胞生长问题的方法参考如下：- 增加培养物中的营养物：根据细胞类型和需求，调整培养基中的蛋白质、维生素和氨基酸等营养物的浓度。
- 提供适宜的培养条件：调整温度、湿度、CO2浓度等环境参数，以提供适宜的生长条件。
- 检查细胞的健康状态：定期检查细胞的形态和健康状况，如发现异常应及时采取措施。
3. 细胞凋亡问题细胞凋亡在细胞培养中可能出现，特别是在长期培养过程中。
细胞凋亡表现为细胞收缩、核染色质浓缩、DNA断裂等特点。
以下是解决细胞凋亡问题的方法参考：- 优化培养条件：提供适宜的培养基、温度、CO2浓度、液面高度等环境因素。
- 增加细胞存活因子：添加适量的生长因子、细胞因子或激素等，以提高细胞存活率。
- 检查细胞状态和健康：及时观察细胞的形态和生长状态，发现异常情况及时处理。
4. 细胞分化问题在一些特定细胞系中，细胞分化可能成为一个问题。
细胞分化表现为细胞形态、生长速率、分泌物或细胞功能的改变。
以下是解决细胞分化问题的方法参考：- 控制培养时间：在合适的时间段内收获细胞，以避免细胞进一步分化。
口腔黏膜上皮细胞体外培养的影响因素分析及改进方法
口腔内科论文口腔上皮细胞论文：口腔黏膜上皮细胞体外培养的影响因素分析及改进方法[摘要] 目的分析人口腔黏膜上皮细胞培养的影响因素，并建立稳定的细胞培养体系。
方法新洁尔灭和硫酸庆大霉素联合处理口腔黏膜标本，比较不同浓度的Dispase对上皮的分离作用，酶消化法分离细胞，采用无血清培养液进行原代和传代培养。
结果微生物污染得到有效控制，0.40%的Dispase 的上皮分离效果优于0.25%的Dispase，细胞在短期内快速稳定增殖。
结论人口腔黏膜上皮细胞的原代培养方法经改进后可简化操作，并提高成功率。
[关键词] 细胞培养；口腔黏膜；上皮细胞人口腔黏膜上皮细胞的体外培养对于研究口腔黏膜上皮细胞的生理、病理变化，上皮癌变过程以及组织工程化黏膜的构建具有重要意义。
多年来，国内外许多学者一直致力于获得更为完善有效的口腔黏膜上皮细胞的培养体系。
但是微生物的污染、人类黏膜组织来源的限制、上皮细胞不能贴壁以及所需营养成分复杂等仍然是上皮细胞培养成功的主要影响因素[1]。
本研究对这些影响因素进行分析，试图通过培养体系的改进而探索更好的口腔黏膜上皮细胞的体外培养方法。
1材料和方法1.1组织来源2004年10月—2005年6月于吉林大学口腔医院口腔颌面外科取唇裂修复术、智齿拔除术和鳞癌手术切除的口腔黏膜正常组织24例，患者年龄6个月～76岁。
其中，鳞癌患者的正常黏膜取自手术切除组织的边缘，并经病理切片证实无上皮异常增生，也未发生癌变。
1.2主要试剂分离酶Dispase和角化细胞无血清培养液（keratinocyte-serum free medium，K-SFM）（Gibco公司，美国）；胰蛋白酶（上海生物工程有限公司）；胎牛血清（天津灏洋）；鼠抗人广谱单克隆角蛋白抗体AE1/AE3及SP免疫组化试剂盒（福州迈新）；其余试剂均为国产分析纯。
1.3主要仪器和器材CO2饱和湿度细胞培养箱（Napco公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；超净工作台（苏州净化设备厂）；一次性细胞培养板和培养皿（NUNC公司，丹麦）；0.22μm微孔滤器（Corning公司，美国）。
体外细胞培养的污染和控制
生物性污染的控制
1、建立规范的无菌操作程序及各种规章制 度，并严格执行；
2、控制环境污染，同时注意实验人员的防 护及无菌服的洁净和无菌；
3、保证细胞培养基和器材无菌； 4、在细胞培养基中加入适量的抗生素。
支原体污染
• 支原体（mycoplasma）是介于细菌与病毒之间能 独立生活的最小微生物，直径0.22μm左 右，无细 胞壁，对理化因素比较敏感。
• 受污染的细胞在显微镜下无特殊的外观表现，培 养液也不浑浊；部分敏感细胞生长增殖变慢，细 胞变圆，脱落。在细胞培养过 程中，如在显微镜 下发现破碎的细胞有许多，培养物需要频繁改善 营养环。
污染的定义
细胞培养污染是指培养环境中侵入 了对细胞生存有害的成分和造成细 胞变异的异物。体外细胞培养污染 可分为3 类：物理性、化学性及生 物性污染。
物理性污染
物理性污染通过影响细胞培养体系中的生 化成分，从而影响细胞的代谢。 培养环境中的物理因素，如温度、放射线、 振动、辐射（紫外线或荧光）会对细胞产 生影响。细胞、培养液或其他培养试剂暴 露在放射线、辐射或过冷过热的温度中， 可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步 化、细胞生长受抑制，甚至细胞死亡。
化学性污染
1、使用的所有物质都应是高纯度的, 同时 正确配制和储存培养液及试剂； 2、在配制液体和清洗容器时必须使用不含 杂质的超纯水。 3、选用同一批次的血清。 4、在选用器皿时，根据被培养细胞的生长 特性、培养方式和所用培养液的性质来选 用适合的器皿来达到实验的准确性和可靠 性。
生物性污染
常见的生物性污染： 一、细菌：G+菌较多。 二、真菌：霉菌较多。 三、支原体：不易检测。 四、病毒：由于病毒有种属特异性，所以病 毒污染的概率比较小。
浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略
摘要动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术。
近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生命科学、生物医药学等多个学科的研究和生产领域，成为广泛采用的技术手段，许多生物技术科学研究都离不开细胞培养。
本文从细胞培养的基本操作方法入手，介绍了动物细胞体外培养的主要影响因素，以及对细胞实验室无菌环境的防控策略。
关键词：细胞体外培养；影响因素；无菌环境；防控策略目录摘要 (I)1引言 (1)2基础理论概述 (1)2.1细胞培养的概念 (1)2.2原代细胞培养的概念 (1)2.3传代细胞培养 (2)3影响细胞体外培养的因素 (3)3.1细胞分离方法 (3)3.1.1直接分离法 (3)3.1.2酶消化法 (3)3.2细胞培养温度 (3)3.3细胞培养基的成分 (4)3.3.1天然培养基 (4)3.3.2合成培养基 (4)3.4接种密度 (5)3.5培养基的pH值 (5)3.6细胞的冻存与复苏 (5)3.6.1细胞冻存 (6)3.6.2细胞复苏 (6)4细胞实验室无菌环境的防控策略 (6)4.1无菌室的彻底消毒 (7)4.2培养用品的清洗和消毒灭菌 (7)4.2.1清洗 (7)4.2.2消毒灭菌 (8)4.3培养试剂的分装与保存 (9)4.4对操作者的要求 (9)5结语 (10)参考文献 (11)致谢 (12)浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略1引言细胞体外培养技术由于具有简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测实验结果，以及方便控制培养产物等优点，在医药领域已成为研究发病机理和筛选药物的重要手段，在分子生物学领域，利用细胞培养技术，结合细胞融合、细胞杂交以及转基因技术，进行基因重组、组织构建，成为分子遗传和组织工程研究者的重要研究工具，利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分。
近年来，分子生物学和分子遗传学获得巨大进展，培养细胞技术被广泛应用于该领域的研究，这些培养的细胞已成为基因工程、遗传工程、体细胞克隆、转基因动物、生物制药、干细胞、微生物学、细胞生物学、遗传学、病毒学、免疫学等学科研究的有力工具和重要途径。
细胞培养中的微生物污染及防控对策
细胞培养中的微生物污染及防控对策细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。
体外细胞污染可分为3类：物理性、化学性、生物性污染[1].其中生物性污染常见且造成的后果也较为严重，培养的细胞一旦遭到微生物污染，将具有不可逆转性，轻则污染细胞废弃，重则连带污染培养箱内的其他细胞，甚至整个实验室的环境，给科研工作带来严重的损失和威胁。
以下对细胞培养过程中常见的微生物污染及防控作以介绍。
1 细菌污染细菌污染特点为污染速度快，易被发现。
细菌污染后，培养基1 ~ 2 d就会变浑浊，对细胞生长影响明显[2],p H值改变[3].常见细菌种类为大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌等（革兰阴性菌）葡萄球菌等（革兰阳性菌）[4-5],其中革兰阳性菌较为多见[6],利用此特点可指导抗生素的应用。
污染主要来源实验室环境、实验人员（实验服）、实验用具等[4].污染后的镜下特点为：胞浆出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从壁上脱落，污染较轻时可见小菌体在细胞间运动[5].疑细菌污染后，可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可取10 m L细胞悬液以100 rpm离心5 min,沉淀中加入无抗生素的培养液2 m L,置于37 ℃培养，24 h可得结果。
确定污染后，若想进行挽救可在细菌污染培养液中添加双抗（青链霉素）、西司他丁钠+亚胺培南消除细菌污染[4,7].2 霉菌污染霉菌污染特点为短期内不会引起培养液的浑浊，可在培养液中形成白色或黄色漂浮物。
污染的主要来源为实验人员（实验服）[5].污染后的镜下特点为：低倍镜下可见乳白色的团状漂浮物，培养液无变化；高倍镜下可见明显的菌丝，细胞活力变差，生长速度明显变慢，甚至死亡[8].疑有霉菌污染的细胞可离心后经PAS染色进行霉菌镜检，同时进行霉菌培养以确定污染及鉴定霉菌种类[9].霉菌污染初期，在培养液中可见漂浮的菌丝，这时将污染的细胞培养液慢慢吸出，用Hanks液清洗细胞及瓶壁2 ~ 3次，加入含有以下抗生素的培养液，即青霉素100单位/m L,链霉素100单位/m L,两性霉素10 mg /L,24 h后观察换液，若仍有菌丝可重复上述步骤进行处理，2 ~ 3次后就基本得到控制[8].但经此种方式处理后对细胞的生长影响也较大。
浅析细胞体外培养的三大污染
浅析细胞体外培养的三大污染细胞培养技术是离体方法中主要的一种，是从动物体内取出细胞，模拟体内的生理环境，在无菌、适温、丰富的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。
细胞实验是科学探究的基础，然而在细胞培养中，常会因为不适宜的环境条件以及不得当的操作导致细胞被污染。
在细胞培养实验中如何避免污染是一项很重要的工作，现在我们来看一下细胞体外培养中常见的污染种类，以及避免方法。
1、外源性污染外源性污染中应注意实验室内空气保持洁净，定期清扫、紫外消毒，操作者严格按照无菌操作进行。
由于离体细胞对各种毒物都很敏感，所以细胞培养所用器材的清洗、消毒处理非常关键。
培养所用的物品器具要彻底清洗消毒，超净台的物品摆放要井然有序，避免反复烧烤已经高温灭菌的物品以及避免因细胞株种类过多而引起的细胞间交叉污染。
细胞实验室的构建也是各个细胞实验服务公司必备的实验室，实验室需要配备CO2培养箱、超净工作台/生物安全柜、纯水系统以及液氮罐等设备，同时需要保证细胞实验室的干净与整洁。
2、支原体污染支原体是一种没有细胞壁的原核生物，大多呈不规则球状或丝状，由于它的直径小（约为0.15-2 µm），而且形状灵活，所以能逃过实验室常用的滤膜。
在光学显微镜下支原体不可见，对培养基的需求有限，一般不会引起培养物混浊，因此支原体像慢性毒药一般杀细胞于无形之中。
细胞被支原体污染后，其生长繁殖和形态、代谢及功能、染色体及免疫细胞产量均会受到影响，支原体污染能够消耗营养物，促进代谢积累，导致PH改变，诱导或抑制细胞因子表达，并改变培养细胞的代谢、增殖特征以及形态。
据一些资料报道，支原体污染在细胞体外培养过程中发生率高达15%~80%。
为了避免支原体污染的发生，对培养物进行常规的支原体检测非常重要，应严格按照细胞培养操作程序进行操作、确保适宜的环境条件、严格的无菌观念操作、定期清洁消毒、任何培养用液使用前均进行无菌检查、只引进来源可靠的细胞，同时一旦发现污染的细胞应灭活弃之避免进一步污染扩散。
细胞培养污染拯救及预防方法
细胞培养污染拯救及预防方法概论▪污染是细胞培养的大敌。
预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
▪一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。
（一）污染的类型▪细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。
1、细菌污染▪细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。
最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
▪培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
2、真菌污染▪真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
▪培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
▪真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
丝状菌污染3、支原体污染▪支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。
开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。
多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。
▪培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。
但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
支原体污染阳性阴性4、病毒污染▪组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。
目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。
▪尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。
影响细胞体外培养的因素及无菌环境防控策略
影响细胞体外培养的因素及无菌环境防控策略
胡沈荣;蓝贤勇;陈宏;雷初朝
【期刊名称】《实验技术与管理》
【年(卷),期】2012(029)011
【摘要】动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术.近年来,动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生命科学、生物医药学等多个学科的研究和生产领域,成为广泛采用的技术手段,许多生物技术科学研究都离不开细胞培养.从细胞培养的基本操作方法人手,介绍了影响动物细胞体外培养的主要因素,以及对细胞实验室无菌环境的防控策略.
【总页数】5页(P54-57,67)
【作者】胡沈荣;蓝贤勇;陈宏;雷初朝
【作者单位】西北农林科技大学动物科学学院,陕西杨凌 712100;西北农林科技大学动物科学学院,陕西杨凌 712100;西北农林科技大学动物科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科学学院,陕西杨凌 712100
【正文语种】中文
【中图分类】Q813.1
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摘要动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术。
近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生命科学、生物医药学等多个学科的研究和生产领域，成为广泛采用的技术手段，许多生物技术科学研究都离不开细胞培养。
本文从细胞培养的基本操作方法入手，介绍了动物细胞体外培养的主要影响因素，以及对细胞实验室无菌环境的防控策略。
关键词：细胞体外培养；影响因素；无菌环境；防控策略目录摘要 (I)1引言 (1)2基础理论概述 (1)2.1细胞培养的概念 (1)2.2原代细胞培养的概念 (1)2.3传代细胞培养 (2)3影响细胞体外培养的因素 (2)3.1细胞分离方法 (2)3.1.1直接分离法 (3)3.1.2酶消化法 (3)3.2细胞培养温度 (3)3.3细胞培养基的成分 (3)3.3.1天然培养基 (3)3.3.2合成培养基 (3)3.4接种密度 (4)3.5培养基的pH值 (4)3.6细胞的冻存与复苏 (4)3.6.1细胞冻存 (4)3.6.2细胞复苏 (5)4细胞实验室无菌环境的防控策略 (5)4.1无菌室的彻底消毒 (5)4.2培养用品的清洗和消毒灭菌 (6)4.2.1清洗 (6)4.2.2消毒灭菌 (6)4.3培养试剂的分装与保存 (7)4.4对操作者的要求 (7)5结语 (8)参考文献 (9)致谢 (10)浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略1引言细胞体外培养技术由于具有简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测实验结果，以及方便控制培养产物等优点，在医药领域已成为研究发病机理和筛选药物的重要手段，在分子生物学领域，利用细胞培养技术，结合细胞融合、细胞杂交以及转基因技术，进行基因重组、组织构建，成为分子遗传和组织工程研究者的重要研究工具，利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分。
近年来，分子生物学和分子遗传学获得巨大进展，培养细胞技术被广泛应用于该领域的研究，这些培养的细胞已成为基因工程、遗传工程、体细胞克隆、转基因动物、生物制药、干细胞、微生物学、细胞生物学、遗传学、病毒学、免疫学等学科研究的有力工具和重要途径。
2基础理论概述2.1细胞培养的概念细胞培养是指将细胞从机体中取出，人工模拟机体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等的研究工作，是维持细胞结构和功能的体外培养方法。
2.2原代细胞培养的概念原代培养是指取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养，这是细胞培养的最初和必经阶段。
培养方法包括：单层细胞培养和悬浮培养。
(1)单层细胞培养：将取下的组织块无菌剪切后，用0.25%胰酶消化，使细胞分离，再用无菌Hanks液或0.85%NaCl溶液洗涤后，置培养皿或培养瓶中培养。
(2)悬浮培养：悬浮培养的细胞多取材于血液或体腔液，一般采用离心法分离细胞，低速500-1000r/min，离心5-10min即可。
培养时，只要取适当浓度的细胞悬液接种于完全培养液中，细胞就能增殖。
2.3传代细胞培养传代细胞培养是指细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中，即当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养。
根据原代培养物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系或细胞株。
这些细胞一般可顺利传40-50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系／株。
一般细胞原代培养1-4周后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，影响细胞的生长繁殖。
在细胞传代的过程中，有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株。
传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。
人传代次数与个体年龄成反比：人胚胎40-60代；幼年20-40代；成年10-30代；得了早老病的儿童2-10代。
传代培养的方式主要有：贴壁型细胞传代和悬浮型细胞传代。
(1)贴壁型细胞传代：传代时需要用胰酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用ＥＤＴＡ溶液与胰酶按体积比为1:1或1:2比例混合后联合使用。
过滤除菌后小量分装，于-20℃保存。
消化时吸去培养瓶内的培养液，加入适量的ＥＤＴＡ溶液与胰酶的混合液，以能覆盖细胞层为宜，将培养瓶平放，37℃作用3-5min，加入Hanks液，1000r/min离心5min即可除去消化液，洗1-2次后加入完全培养液，计数，置培养皿或培养瓶中培养。
(2)悬浮型细胞传代：传代时用吸管将细胞吹打均匀，特别是一些成团生长的细胞，应将细胞团块打散。
根据细胞生长状况的不同，用吸管将细胞悬液吸去适当的量，然后再加入完全培养液至原体积3影响细胞体外培养的因素3.1细胞分离方法细胞分离方法细胞培养之前，首先要进行组织块的分离，其主要方法包括：直接分离法（包括机械法和EDTA螯合法）和酶消化法（包括胰蛋白酶消化和胶原酶消化）。
3.1.1直接分离法该方法分离得到的细胞数量没有酶消化法得到的多，但可满足一般实验的要求，该方法的优点是操作流程简单，不需要复杂的仪器和昂贵的胶原酶。
3.1.2酶消化法多用于新生动物组织或动物胚胎的肝细胞培养。
胰蛋白酶消化法具有分离效果好、操作简单和价格便宜的特点，因为胰酶消化的条件很难掌握，所以未被广泛应用；胶原酶消化法具有分离效果好、细胞产量高（即时存活率高、对细胞损伤小）、维持细胞特异性功能的时间长等优点。
3.2细胞培养温度不同种类的动物细胞对温度的要求并不一致，如人和哺乳动物的细胞培养温度为35-37℃，鸟类细胞培养温度为38.5℃，鼠类细胞为34℃。
一般来说，细胞对低温的耐受力比高温强。
因此，在细胞的培养过程中要及时地根据细胞的类型调整适宜的温度。
在使用恒温培养箱时，箱内温度应维持在37℃、CO2体积分数为5%。
3.3细胞培养基的成分培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。
培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基，按其来源分为天然培养基和合成培养基。
3.3.1天然培养基最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。
血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。
与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。
质量好的血清应该是无溶血、橘黄色清亮透明、无细菌、无支原体污染的黏稠状液体。
血清的体积分数要控制在5%-20%，当超过30%时反而不利于细胞生长，过高或过低的血清体积分数都不利于细胞的生长和增殖。
一般将血清保存于-20℃以下，时间不易过长。
3.3.2合成培养基合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。
内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。
单独使用细胞虽有生存但不能很好地生长增殖。
迄今为止，人工合成的培养基已有多种，如RPMI-1640、Eagle’s MEM、DMEM等，其主要差别在于氨基酸、维生素、无机盐和能源物质的组成及含量不同。
一般认为RPMI-1640营养全面，对各种组织生长都适用；Eagle’s MEM适合于细胞株的传代培养；DMEM有利于细胞的分裂增殖；Ham’s F12能促进细胞的分化。
也有学者将不同培养基混合应用，从而得到较好的培养效果。
培养液中的抗生素是青霉素和链霉素。
此外，卡那霉素、新霉素、两性霉素、氯霉素等都可以防止细胞培养过程中细菌和真菌的感染。
3.4接种密度一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，细胞密度过大时，养分不足，使细胞迅速老化；而密度过小时，不利于细胞单层的形成。
在传代培养中，细胞的密度取决于传代的时间。
一般分瓶的稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。
在细胞生长的外部条件完全相同的情况下，细胞分散比率不同会导致不同的增殖倍数，影响细胞产量，这对培养种细胞尤其重要。
3.5培养基的pH值在培养动物细胞时，不同种动物或是同一种动物的不同部位对pH值的要求各不相同。
一般认为，动物细胞培养基的pH值一般在7.2-7.4，呈弱碱性。
培养过程中pH值低于6.8时对细胞生长会有抑制作用，细胞生长缓慢；而当pH高于7.6时则细胞不能生长，这可能是由于空气的接触而导致培养基中的营养成分被氧化所致。
3.6细胞的冻存与复苏细胞冻存和复苏的基本原则是“慢冻快融”，实验证明这样可以最大限度地保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质都能提高细胞膜对水的通透性。
缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
3.6.1细胞冻存传代培养的细胞，如果暂时不用，可以冷冻保存。
利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏细胞后用于实验。
而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。
除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
细胞冻存时向培养基中加入保护剂至终体积分数5％。
15％的甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。
标准冷冻速度开始为-1℃／min或者-2℃／min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内（-196℃）。
3.6.2细胞复苏复苏细胞的原则为快速解冻，从液氮中取出细胞冻存管之前应准备好38℃的温水，冻存管取出后用镊子夹住顶端迅速放入温水中，结束后还要在75％酒精中清洗几次，除去透明过程中染上的杂质。
为缩短透明时间，可将标本放在烘干箱或灯光下加热，透明时间长短根据标本大小、多少和环境温度而定。
冻存复苏后的状态主要与冻存保护剂的种类、浓度以及细胞复苏方法和复苏后培养液中小牛血清浓度等有关。
二甲基亚砜（DMSO）是一种具有非常强的溶解能力和非凡渗透能力的化学物质，也是应用最广泛的体外培养细胞冻存保护剂，其常用体积分数为10％～20％，不同种属细胞的最适浓度也存在一定差别。
4细胞实验室无菌环境的防控策略目前细胞培养过程中最主要的问题就是污染，污染可导致细胞死亡，从而造成人力、财力和时间的损失，有时还可能造成特殊材料的不可再用。
因此，在做细胞实验时，一定要尽力避免污染的发生。
4.1无菌室的彻底消毒无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。