酒精性肝损伤和氧化应激

诱导肝脏产生TNF-α过程是急性酒精中毒氧化应激一个关键因素肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的生产是酒精性肝损伤的发病机制中的一个关键因素。

氧化应激和内毒素在酒精诱导的肿瘤坏死因子生产过程中都有涉及。

然而，这些因素之间的因果效应的关系没有得到充分的定义。

目前的研究，一般使用的急性酒精肝损伤的小鼠模型用来确定急性酒精中毒诱导的TNF-α产生的关键因素。

酒精的灌胃剂量为6克/公斤剂量129/Sv，由测量蛋白质水平，免疫组化，和mRNA表达来证明能诱导肝脏Kupffer细胞产生的TNF-α。

酒精中毒引起的肝损伤与血浆内毒素和肝脏脂质过氧化增加相关。

用内毒素中和蛋白来治疗可以显著抑制酒精诱导血浆内毒素的高度，肝脂质过氧化和抑制TNF-α产生。

治疗通过使用抗氧化剂，N -乙酰- L -半胱氨酸，或二甲基亚砜，虽然不能降低血浆内毒素的高度，但可以显著防止酒精引起的肝脂质过氧化反应，TNF-α产生和脂肪变性。

这些所有的治疗可以防止酒精引起的肝脏坏死性细胞死亡。

因此，本研究将系统区分血浆内毒素升高，肝氧化应激，急性酒精中毒导致TNF-α产生之间的关系，结果表明，氧化应激在急性酒精中毒中介导了内毒素诱导的肝TNF-α产生饮酒所致的肝脏疾病在美国的疾病和死亡中为首要原因。

虽然有些药物已经用于预防和治疗酒精性肝病的实验模型或诊所试验评估，目前有没有FDA批准的治疗方案。

对酒精诱导的细胞损伤的发病机制的调查可能会提供开发新疗法的基础。

现已提出一些有关酒精导致细胞损伤的机制的假设中，氧化应激和促炎细胞因子的生产，被公认的首先的致病因素。

酒精代谢的主要途径存在于肝脏，位于不同的亚细胞间隔的每个细胞质，微粒体的乙醇氧化系统的内质网中的酒精脱氢酶和在线粒体中的醛氧化酶.所有三个结果会产生活性氧（ROS），包括超氧阴离子，羟基自由基和过氧化氢。

当氧化应激发生在肝脏，细胞的抗氧化能力是在足以应付与活性氧的积累的。

酒精引起的肝脏氧化应激已反复检测ROS的来证明，在这病人和动物的模型中通过测量脂质过氧化反应和氧化应激标志物。

积累在肝脏中的ROS被发现会导致细胞膜的功能系统障碍，蛋白质和DNA的氧化，最终导致肝细胞损伤。

炎性细胞因子如TNF-α在酒精性肝炎的启动和发展发挥了关键作用。

Kupffer细胞是TNF-α当肝脏中出现酒精后的主要来源。

有人曾建议，酒精介导内毒素（脂多糖，LPS）来引起的TNF-α产生，同时增加血浆内毒素水平和TNF-α表达已被反复报道于那些酗酒的患者。

研究报告已经证明内毒素在Kupffer细胞上复杂的结合LPS CD14/toll样受体4引起NF-kB 激活和TNF-α的表达。

在内毒素的作用已被研究很多的时，氧化应激在酒精诱导的TNF-α表达也发挥了重要作用。

肝脏灌注的研究表明，Kupffer细胞在急性酒精中毒和恢复期的早期阶段主要负责肝脏超氧化物歧释放。

许多报告提出的假说认为酒精引起的活性氧不仅作为有毒物质，但也通过刺激激活氧化还原反应敏感的核转录因子NF -κB，进而导致TNF-α的信号转导，有越来越多的证据TNF -α信号在肝细胞中通过电子传递链导致线粒体ROS生成增加，.然而氧化应激是否反映了酒精诱导的TNF-α产生或作为一个内毒素诱导的TNF-α产生的重要因素仍存在争议。

因此，本研究在急性酒精性肝损伤的小鼠模型之间内进行定义内毒素，氧化应激和TNF-α的关系。

材料和方法动物129/Sv小鼠来自杰克逊实验室（(Bar Harbor,ME），在路易斯维尔大学研究资源中心中的动物。

他们均保持在22°与12小时的光/暗周期，并充分获得食物及自来水。

这些老鼠将在9周龄被使用，以前的在同类研究中作为一个例行的年龄选择，30实验程序收到动物保护机构和使用委员会的批准，这是由美国实验室动物保护协会认证认可的。

治疗1）酒精给药：酒精灌胃剂量（Aldrich,Milwaukee, WI）为6克/公斤。

2）内毒素中和：为了中和酒精引起的血浆内毒素升高，内毒素中和蛋白（ENP）（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州）剂量为10毫克/公斤静脉注射对急性酒精中毒后进行处理。

3）抑制酒精诱导的氧化应激：两个抗氧化剂，N -乙酰- L -半胱氨酸（NAC）和二甲基亚砜（DMSO）的使用。

两种剂量NAC（Calbiochem公司，拉霍亚，CA）在对酒精治疗前2小时和30分钟注射IP150mg/kg。

酒精治疗前30分钟通过腹腔注射二甲基亚砜剂量为2g/kg。

要实现一个课题的研究，再被酒精处理后血浆和肝脏样本将在1.5，3，6，和12小时后被使用。

小鼠戊巴比妥钠（0.05毫克/ g体重）麻醉。

血取自背腔静脉通过血浆肝素化在4°C离心10分钟，用注射器得到了500克，并存储在80 °C中，肝脏用生理盐水灌注和测量TNF -α和脂质过氧化反应，样品处理和病理组织学观察。

谷丙转氨酶含量根据指示提供，使用诊断试剂盒用色度法测量血浆谷丙转氨酶（ALT：EC2.6.1.2）活性。

组织病理学观察，将肝组织固定于10％中性福尔马林并嵌入在塑化石蜡中。

被切断为5μm 组织切片用苏木精和曙红染色。

肝脏TNF -α的量化根据以前的报告进行一些小的修改，对肝脏肿瘤坏死因子-α的检测样品进行制备。

简单地说，肝脏样本在5倍容积冰预冷的Ripa的缓冲液中解体。

在冰上孵育30分钟后，4 °C15分钟将两次标本进行离心20,000×g，将此产生的上清液用于检测。

TNF -α水平用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，小鼠的试剂盒（BIOSOURCE国际公司，Camarillo的，CA），肝脏的免疫组化定位肝组织被切成7μm，风干，固定于丙酮在20°C10分钟。

内源性过氧化物酶的活性在3％H2O2被灭活。

30分钟中非特异性结合位点被10％正常山羊血清阻断。

多克隆兔TNF -α抗体（BIOSOURCE国际）检测，小鼠的试剂盒（BIOSOURCE国际公司，Camarillo的，CA），并表示作pg/g血浆内毒素水平一种在细胞裂解液含量测定基础上显色内毒素检测的试剂盒（Q CL-1000, Whit-taker Bioproducts Inc., Walkersville, MD），按照制造商的指示用于测量血浆内毒素水平。

简言之，血浆样品稀释1:10，并加热到75°C下20分钟，变性，血浆内毒素抑制剂。

样品孵育10分钟，用裂解，在37 °C，6分钟，随着用提供的发光液来孵育。

在405 nmol测定吸光度，和内毒素浓度分别为欧盟/毫升表示。

脂质过氧化实验如前所述，通过测定硫代巴比妥酸反应物质（TBARS），对肝脏脂质过氧化作用进行了量化。

nmol/克的肝脏用TBARS的浓度表示。

统计所有的测量都是以平均值±标准差（n=4 - 6）。

通过方差分析和纽曼Keuls的多重比较测试数据进行分析。

组间差异显著，P <0.05。

结果酒精诱导的TNF -α的产生和肝损伤通过ELISA，RT - PCR和免疫组化法，分别测定TNF -α浓度，基因表达及在肝脏中的定位。

如图1所示，酒精处理1.5小时后肝脏的TNF -α水平显著升高。

酒精诱导的TNF –α产生在在6小时达到高峰，达到4.6倍的提升。

虽然TNF –α在12小时后产生下降，但其水平仍高于对照组。

在肝脏经过酒精处理3和6小时后的TNF –αmRNA的RT – PCR分析证明，TNF -α基因表达可被酒精处理提高（图2）。

通过免疫组化，TNF –α阳性染色发现Kupffer 细胞集中在血窦壁上（图3）图1，肝脏的TNF -α水平在急性酒精处理后时间的变化过程。

单次灌胃给酒精6克/公斤，和用ELISA法检测在不同时间点肝的TNF -α水平。

通过方差分析和纽曼Keuls“多重比较测试数据进行分析。

与对照组对比，被不同的字母标记确定为有有显著性差异（P <0.05）图2。

在肝脏中酒精诱导的TNF -αmRNA的表达。

肝脏在用酒精处理（6克/公斤）后3或6小时后被拆除，和TNF -α和管家基因由mRNA RT - PCR分析技术确定。

相对控制组，酒精处理在3和6小时治疗后增加在肝脏中TNF -αmRNA表达。

图3在肝脏中TNF -α阳性细胞经过免疫组化染色。

肝脏酒精处理（6克/公斤）6小时后移除和7- M低温恒温器部分被制成。

第一个多克隆抗鼠TNF -α抗体与HRP标记的羊抗兔IgG 抗体培养。

A：对照组肝脏。

B：酒精处理的肝肝脏。

箭头：TNF -α阳性细胞。

箭头：肝血窦。

放大倍率，×260。

血浆内毒素和肝脏的氧化应激的同时提高与急性酒精中毒相关内毒素在酒精性肝损伤TNF -α产生触发是一个非常重要因素。

要确定是否TNF -α生产与内毒素升高，在酒精处理后测定血浆内毒素水平。

如图6所示，血浆内毒素水平于1.5和3小时后显著上升，血浆内毒素6小时后下降到正常水平。

图4。

在急性酒精中毒处理后血浆ALT活动时程变化。

单次灌胃给酒精6克/公斤，使用西格玛诊断试剂盒来测定血浆ALT活性。

通过方差分析和纽曼Keuls多重对比测试数据进行分析，与对照组对比，被不同的字母标记确定为有有显著性差异（P <0.05）。

由于氧化应激可能的原因或结果，或者，TNF -α产生，在肝脏中的酒精诱导的氧化应激是通过测量脂质过氧化（TBARS浓度）进行评估。

如图7所示，肝的TBARS浓度在酒精处理1.5小时后升高，TBARS浓度随时间变化的增加到12小时，这个模式不同于酒精诱导的的肝脏TNF –α的升高。

内毒素在急性酒精暴露诱导TNF –α产生时的作用为了确定内毒素在急性酒精暴露诱导TNF –α产生时的作用，通过注射ENP内毒素中和被执行。

如图8所示，在急性酒精暴露1.5小时后ENP注射显著抑制血浆内毒素水平增加。

如图9所示肝脏急性酒精中毒后内毒素中和可以抑制TNF –α的产生。

在急性酒精中毒后6小时内毒素中和也部分地抑制在肝脏急性酒精诱导的脂质过氧化（图10）。

氧化应激在由酒精引起的TNF –α产生和肝损伤中的作用图5酒精引起的肝脏病理组织学改变。

单次灌胃给酒精6克/公斤。

A：对照组。

B：酒精3小时。

C：酒精6小时。

D：酒精12小时。

酒精处理引起的突出的小泡脂肪变性（箭头）随着肝坏死（箭头）。

坏死的肝细胞用苏木精和曙红染色其特点是细胞肿大和核溶解，放大倍数× 260。

要确定的氧化应激在TNF -α的生产和肝损伤的作用，外源性抗氧化剂NAC和DMSO，两个被用来减轻急性酒精暴露后的氧化应激。

在图8-2所示，NAC或DMSO处理1.5小时后酒精处理，血浆内毒素升高没有影响。

然而，NAC和DMSO显着抑制TNF –α的产生（图9）。