免疫学实验设计1

1.荷瘤小鼠体内致瘤性及肿瘤生长情况观察 荷瘤小鼠体内致瘤性及肿瘤生长情况观察
• 津白II号小鼠随机分为3组, 分 别于右侧背部皮下注射0.1 mL 的IL-23/MA-891LXSN/MA-891和 MA-891细胞, 结果表明, IL-23 基因转染组与空载体转染组及 亲代细胞组在小鼠体内的成瘤 率均为100%。但IL-23 基因转 染组小鼠皮下结节生长速度明 显慢于接种空载体转染组及亲 代细胞组, 表明IL-23 基因转 染的肿瘤细胞体内生长能力明 显下降(图1)。 • 说明导入IL-23 基因的小鼠乳 说明导入IL IL腺癌细胞分泌的IL 23发挥了 IL腺癌细胞分泌的IL-23发挥了 明显的抗肿瘤作用, 明显的抗肿瘤作用, 减低了肿 瘤在活体内的侵袭能力, 瘤在活体内的侵袭能力, 降低 了其生长速度。 了其生长速度。
4.脾细胞CD11c分子表达的检测 4.脾细胞CD11c分子表达的检测 脾细胞CD11c
• 同上将3组小鼠脾细胞制成单细胞悬液, 用 同上将3组小鼠脾细胞制成单细胞悬液, PBS洗 分别加入FITC FITC标记抗小鼠 PBS洗2次, 分别加入FITC标记抗小鼠 避光作用60 CD11cmAb, 避光作用60 min, 用FCM 分析 c阳性细胞的比率 阳性细胞的比率。 CD11 c阳性细胞的比率。
1.小鼠荷瘤实验 1.小鼠荷瘤实验
2.脾细胞分泌细胞因子的检测 脾细胞分泌细胞因子的检测
实 验 步 骤
5.肿瘤组织细胞表面分子的检测 肿瘤组织细胞表面分子的检测 6.肿瘤组织中CD4+ 6.肿瘤组织中CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞浸润情况的检测 肿瘤组织中 7.统计学分析 统计学分析 3.脾细胞中 脾细胞中CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞的分选 脾细胞中 4.脾细胞 脾细胞CD11c分子表达的检测 脾细胞 分子表达的检测
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6.肿瘤组织中CD4 6.肿瘤组织中CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞浸润情况的 肿瘤组织中 检测（ 检测（图3）
总结
1.树突状细胞( DC )是最重要的抗原提呈细 . 胞,IL-23可以与小鼠DC 结合, 诱导DC产生 IFN-γ, 提高DC 的抗原提呈能力。 2.CD11c是小鼠DC 的表面标志, 可用来分离 和鉴定小鼠DC 。 3.IL-23可通过增加肿瘤的抗原性及抗原提呈 的协同刺激作用, 增强细胞免疫功能, 防 止肿瘤逃逸, 发挥抗肿瘤作用。 结论: 转染IL-23 基因的小鼠乳腺癌细胞所 分泌的IL-23具有生物学活性, 增强了细胞 免疫功能, 在小鼠体内发挥了明显的抗肿 瘤作用。
6.肿瘤组织中CD4+ 6.肿瘤组织中CD4+ 、CD8+ 淋巴 肿瘤组织中 细胞浸润情况的检测
• 同上切取3组肿瘤组织, 100 g/L甲醛固定, 石蜡包埋组织做5 cm 厚切片, 常规脱蜡、 水化, 加TritonX-100修复暴露抗原( 4.℃ 过夜)。以100 mL /L 山羊血清封闭非特异 性结合位点( 37.℃30 min) 后, 分别滴加 兔抗鼠CD4、CD8 抗体( 4.℃过夜), 山羊 抗兔IgG和SABC( 37.℃各孵育1 h)。用DAB 显色后, 再以苏木素复染, 于显微镜下观 实 察结果。
3.脾细胞中CD4+ 3.脾细胞中CD4+ 、CD8+ 淋巴细 4.脾细胞中CD11c 阳性 脾细胞中 4.脾细胞中 脾细胞中CD11c 胞的分选 细胞比率的变化
• 取皮下接种IL-23/MA-891、 • 取皮下接种IL-23/MA-891、 IL LXSN/MA-891和MA-891细胞后 LXSN/MA-891和MA-891细胞后 d的小鼠脾细胞制成单细 30 d的小鼠脾细胞制成单细 胞悬液, 胞悬液, FCM 分选结果显示 IL-23/MA-891组 IL-23/MA-891组CD4+ 淋巴细 胞及CD8+ 胞及CD8+ 淋巴细胞比率 34.0± ( 34.0±1.7, 14. 6 均较LXSN /MA±0.6)% 均较LXSN /MA-891 12.3± 9.1±0.5)%、 ( 12.3±0.8, 9.1±0.5)%、 MA5± MA-891( 12. 5±0.7, 9. 组明显增高( 0±0.6)% 组明显增高( n= 6, 01)。 P < 0. 01)。 接种IL-23/MA-891、 LXSN/MA-891和MA-891细胞 后30 d的小鼠脾细胞中 CD11c阳性细胞(DC) 表达 的FCM 检测显示: 接种IL23/MA-891细胞组小鼠脾脏 中, CD11c 阳性细胞比率 ( 21.4±1.6)%与接种 LXSN/MA-891和MA-891细胞 组小鼠脾脏相比CD11c阳性 细胞比率( 12.4 ±1.0,11. 6±0. 6)% 有明显增高( n = 6, P < 0. 01); 而接种 LXSN /MA-891 和MA-891细 胞组小鼠脾脏中CD11c 阳 性细胞比率之间无统计学 意义。
5.肿瘤组织中细胞表面分子表型的变化 5.肿瘤组织中细胞表面分子表型的变化
经FCM 分析,皮下接种IL-23/MA-891、LXSN/MA891和MA-891细胞后30 d, IL-23/MA-891组肿瘤组 织细胞表面分子MHC-I、MHC-II、CD80、CD86表达 与接种MA-891和LXSN/MA-891细胞组相比较有明显 的提高( P < 0. 01) ; MA-891和LXSN/MA-891组 小鼠的肿瘤组织细胞表面分子表达无统计学意义 (表1) 。
实验材料
• 逆转录病毒介导转染IL-23基因的小鼠乳腺癌细胞 ( IL-23 /MA-891) ；转染逆转录病毒空载体的小鼠 乳腺癌细胞( LXSN /MA-891)及亲代小鼠乳腺癌细 胞(MA-891) ；津白II号小鼠( 雌性, 6~ 8周龄)； IFN-γ、TNF-α和IL-4 ELISA 检测试剂盒； IL12ELISA检测试剂盒；FITC 标记的抗小鼠CD11c、 CD80、CD4、CD8 单克隆抗体( mAb) 及PE 标 记的CD86 mAb 抗体； FITC 标记的抗小鼠MHCI类分子mAb和PE标记的抗小鼠MHC-II类分子 mAb； 兔抗鼠CD4、CD8抗体、山羊抗兔IgG抗 体及SP试剂。
实 验 步 骤
2.脾细胞分泌细胞因子的检测 2.脾细胞分泌细胞因子的检测
• 于接种IL-23 /MA-891、LXSN /MA-891 和MA-891 于接种IL/MA-891、 /MAMAIL 细胞后30 分别取3组各6只小鼠脾脏, 细胞后30 d, 分别取3组各6只小鼠脾脏, 无菌制 备脾细胞悬液, 按每孔0.1 mL脾细胞 脾细胞( 备脾细胞悬液, 按每孔0.1 mL脾细胞(含2 ×105 mL丝裂霉素处理的/MA-891细胞 丝裂霉素处理的/MA 细胞( 个)和0.1 mL丝裂霉素处理的/MA-891细胞(含2 加入到96孔板中, 再加入终浓度0. 96孔板中 ×105 个) 加入到96孔板中, 再加入终浓度0. 05 刺激小鼠脾细胞, h后用ELISA法检 后用ELISA g /L ConA 刺激小鼠脾细胞, 48 h后用ELISA法检 测各组脾细胞培养液中IFN IFNTNFIL-12和 测各组脾细胞培养液中IFN-γ、TNF-α、IL-12和 IL- 的含量。 IL-4的含量。
1.小鼠荷瘤实验 1.小鼠荷瘤实验
• 将津白II号小鼠随机分为3 组, 分别于右侧背部皮下 注射0.1 mL(含5×105 个 活细胞) 的IL-23 /MA-891、 LXSN /MA-891 和MA-891细 胞。观察小鼠成瘤及肿瘤 生长情况, 各组小鼠每隔2 d用游标卡尺测量皮下肿瘤 长径和短径, 用下列公式 计算肿瘤体积: 肿瘤体积 ( cm3 ) = 长径×短径2 ×1/2。
3.脾细胞中CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞 的分选
• 同1. 2. 2方法取出3组小鼠脾脏, 制成单细胞悬液, 用 PBS洗2次, 然后每组加入FITC 标记的抗小鼠CD4、 CD8 mAb, 避光作用60 min, 采用流式细胞术( FCM ) 进行CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞的分选试验。
实 验 步 骤
2.脾细胞分泌细胞因子的检测 2.脾细胞分泌细胞因子的检测
• 皮下接种IL-23/MA-891、LXSN/MA891和MA-891细胞后30 d 的小鼠脾 细胞在体外经MA-891诱导后, 用 ELISA 法检测脾细胞培养上清中 Th1类细胞因子IFN-γ、TNFα,Th1类细胞诱导因子IL-12 及 Th2类细胞因子IL-4 的含量。结果 显示, 接种IL-23/MA-891 细胞的 小鼠脾细胞可产生高水平的IFN-γ、 TNF-α和IL-12等Th1类及相关细胞 因子, 与接种LXSN/MA-891细胞和 MA-891 细胞 2组小鼠的脾细胞相 比明显增加( n = 6, P < 0. 01); 而Th2 类细胞因子IL-4的水平却无 统计学意义( n = 6,P > 0. 05, 图2)。
实 验 步 骤
5.肿瘤组织细胞表面分子的检测 5.肿瘤组织细胞表面分子的检测
• 于注射IL-23 /MA-891、LXSN /MA-891 和 MA-891细胞后30 d, 取出3组小鼠肿瘤组织 制成单细胞悬液, 用PBS洗2次, 然后每组 分别加入FITC标记抗小鼠MHC-I类分子、 CD80 mAb及PE 标记抗小鼠MHC-II类分子、 CD86 mAb, 避光作用60 min, 用FCM 分析 细胞表面待测分子的表达情况。
ILIL-23 在小鼠乳腺癌中的抗肿 瘤作用及其免疫机制
研究背景： 研究背景：
• 在世界范围内乳腺癌的发病率逐年上升 而且乳腺 在世界范围内乳腺癌的发病率逐年上升, 癌患者有年轻化趋势。 癌患者有年轻化趋势。目前的常规治疗手段对提 高乳腺癌患者长期生存率仍不十分理想, 高乳腺癌患者长期生存率仍不十分理想 所以研究 有效的治疗方法已迫在眉睫。近年来, 有效的治疗方法已迫在眉睫。近年来 免疫基因治 疗越来越受到人们的重视。白细胞介素23( IL-23) 疗越来越受到人们的重视。白细胞介素 年发现的一种由p19亚基和 亚基和p40亚基共同 是2000年发现的一种由 年发现的一种由 亚基和 亚基共同 构成的1种细胞因子 构成的 种细胞因子 , 主要来源于活化的单核巨噬 细胞和树突状细胞( 细胞和树突状细胞 DC ),其具有较强的免疫调节 其具有较强的免疫调节 活性, 参与自身免疫性疾病、 活性 参与自身免疫性疾病、慢性炎症反应和某些 感染性疾病的发病和调控过程。有报道提出,IL感染性疾病的发病和调控过程。有报道提出 23可通过诱导和增强小鼠脾细胞 可通过诱导和增强小鼠脾细胞CTL活性和 活性和IFN-γ 可通过诱导和增强小鼠脾细胞 活性和 等细胞因子的产生而发挥抗肿瘤作用, 但与IL-12 等细胞因子的产生而发挥抗肿瘤作用 但与 相比, 不会诱导淋巴细胞产生高水平的γ干扰素 相比 不会诱导淋巴细胞产生高水平的 干扰素 ( IFN-γ), 减少了毒副作用。因此, IL-23作为肿瘤 减少了毒副作用。因此 作为肿瘤 基因治疗的候选因子越来越受到关注。 基因治疗的候选因子越来越受到关注。 •
目的与方法
• 目的 研究白细胞介素23(IL-23) 在小鼠乳腺癌 目的:
中的抗肿瘤作用及其免疫功能变化。 • 方法 将逆转录病毒介导转染IL-23基因的小鼠 方法: 乳腺癌细胞( IL-23 /MA-891)、转染逆转录病毒 空载体的小鼠乳腺癌细胞( LXSN / MA-891) 及 亲代小鼠乳腺癌细胞(MA-891) 分别接种于小鼠 皮下, 观察小鼠成瘤及肿瘤生长情况; 30 d时取 3 组小鼠脾脏和肿瘤组织,用ELISA 法检测3组小 鼠脾细胞在MA-891诱导下IFN-γ、TNF-α、IL12和IL-4的产生情况; 用流式细胞术( FCM )检 测肿瘤组织细胞表面分子MHC-I、MHC-II、CD80、 CD86的表达, 检测脾细胞CD11c 阳性细胞的比率, 并对脾细胞中CD4+ 、CD8+ 淋巴细胞进行分选; 用免疫组织化学技术对3组肿瘤组织中CD4+ 、 CD8+ 淋巴细胞浸润情况进行检测。