蛋白质含量检测PPT教学课件
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实验一血清蛋白质测定(共51张PPT)
【注意事项】
1.测定的血清以新鲜为宜，但在冰箱保存而不混 浊的标本也可应用，高脂血症混浊血清会干扰比 色，可采用下述方法消除：取2支带塞试管或离 心管，各加待测血清，再加蒸馏水和丙酮10ml， 塞紧并颠倒混匀10次后离心，倾去上清液，将试 管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加 入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述 相同的其他操作和计算。
-----------------
-----------------
标准
A 血红蛋白和BCG产生与白蛋白相等的颜色强度，血红蛋白在1g/L以下无明显干扰，2g/L使吸光度增高3.
2．10mmol/L BCG贮存液
标准
3．叠氮钠贮存液
4．聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)贮存液
5．BCG试剂
实验一 血清蛋白质测定
但本法的检出限为～，这相当于70g/L的血清3～24μl，已能满足临床生化检验的需要，成为临床实验室血清TP首选的最方便，实用的常规方法。 酚酞、溴磺酞钠在碱性溶液中呈色，影响测定结果，右旋糖酐可使测定管混浊亦影响结果，理论上这些干扰均可用相应的标本空白管来消除。 ３．在波长630nm处用空白管调零，用定量加液器加BCG试剂，与测定管血清混合后，立即在30±3s内，读取吸光度。 4%，4g/L使吸光度增高7. 2 桌面，边台，水池，窗台，仪器要一尘不染，请值日生用抹布擦干净。 4(显蓝绿色)，受酸、碱影响较大，故所用的器材必须无酸、碱污染，BCG工作液的pH必须精确度监测，务必使其保持在限度内。 手工操作参数：波长540nm，光径1cm； 用双缩脲法测定血清标本中总蛋白浓度，用溴甲酚绿法测定血清白蛋白浓度, 蛋白质测定方法很多，常用的有： 丽春红蛋白结合法测得的结果与凯氏定氮法相符，并且显色后在室温可稳定24小时； 1．黄疸血清，溶血，高糖，酚酞等干扰用样本空白来消除。 由于血红蛋白本身能与双缩脲试剂反应，产生与血清白蛋白和球蛋白相近的显色效价，故应注意高血红蛋白的影响。 取试管4支，标明测定管（U）、标准管（S）、标本空白管（B）、试剂空白管（RB）。 双缩脲法测定血清总蛋白
蛋白质的测定课件参考.ppt
1.装水至 2/3 容积 处，加甲 基橙数滴 及硫酸数 毫升以保 持酸性
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
蛋白质的研究方法优秀课件.ppt
就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白 完全变性的特性。
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
蛋白质的研究方法优秀课件
18
非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
蛋白质的研究方法优秀课件
22
细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
蛋白质的研究方法优秀课件
25
#
蛋白质的研究方法优秀课件
26
等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
蛋白质的研究方法优秀课件
5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
蛋白质的研究方法优秀课件
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
蛋白质的研究方法优秀课件
18
非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
蛋白质的研究方法优秀课件
22
细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
蛋白质的研究方法优秀课件
25
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蛋白质的研究方法优秀课件
26
等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
蛋白质的研究方法优秀课件
5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
蛋白质的研究方法优秀课件
最新实验一蛋白质含量测定ppt课件
生物化学与分子生物学基础实验
TU1800 紫外可见分光光度计
波长范围：200－1100nm 钨灯：340－1100nm
测光系统：单光束
氘灯：200－340nm
功能指标：光度测量 光谱扫描 定量测量
生物化学与分子生物学基础实验
注意事项
1 测紫外吸收要用石英比色皿 ！ 2 定量实验取液要准确。 3 从低浓度到高浓度依次测量，比色皿不要润 洗。 因此3ml溶液足够测定。 4 测量完毕，请把光度计的盖打开 ！ 5 每次实验时提交上一次的实验报告。
生物化学与分子生物学基础实验
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
实验步骤
0 1234567
标准蛋白（1mg/ml）ul 0 20 40 80 120 160 200 0
待测样品 ul
-
- - - - - - 200
蒸馏水 ul
1000 980 960 920 880 840 800 800
Folin-酚试剂甲 ml
3、所有的样品（包括标准样品），都必须在规定时间 内测试。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出 的样品浓度与实际的浓度不符。
生物化学与分子生物学基础实验
722型光栅分光光度计
光 源
单 色
样
光
读
品
电
数
器
池
源
单
件元
测量完毕，请把光度计的盖打开 ！
讲解完毕后，每个组出一个同学去 127听老师讲解仪器使用。
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
• 酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙 醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。
《血清蛋白质测定》PPT课件
• ⑹血浆蛋白质广泛应用于组织和细胞的培养，血浆中含有各总细胞刺激因子 和抑制因子，它们对稀薄啊的活力、增殖、分化、胞内酶的合成及细胞特殊 功能起者特殊的作用。
• ⑺在人类不少疾病，包括两种常见的疾病——动脉粥样硬化及肿瘤的发病学 研究，以及最常见的糖尿病及其并发症的发病机制中，血浆蛋白质均有广泛 涉及。
• 补体蛋白类 • 补体蛋白C • B因子 • D因子 • 备解素
• P因子又称备解素（properdin），是替代途径中除C3以外最 先发现的一种血浆蛋白。现已探明，P因子以聚合体形式而 存在：即三聚体（54%）、二聚体（26%）和四聚体（20%） 都有，但特异活性的顺序依次为：四聚体>三聚体>二聚体。 P因子为由4条相同的肽链（分子量各55kDa）组成的四聚体 分子，链间以非共价键相连接，分子量为220kDa。P因子的 生物学活性是以高亲和力与c 3bBb和C 3bnBb相结合，结合 后通过发生构象改变而加固C3b与Bb间的结合力，从而可使 其半衰期由2分钟延长至26分钟。另外，P因子还可封闭H因 子的抑制作用，更增加了上述两种酶的稳定性及活性，有利 于促进替代途径级联反应的继续进行。因此，P因子实际上 是替代途径中的一个重要的正调节分子。因其常成为c 3bBb 和C3bnBb复合物中的组成成分之一，故将其作为补体系统的 固有成分在此一并描述。此外，在膜增生性肾小球肾炎病人 血清中发现有一种C3肾炎因子（C3nephritic factor,C3NeF） 实际为C 3bBb的自身抗体，也可与C3bBb结合而增加c 3bnBb 的稳定性，使其半衰期处长10-30倍。
• ⑵生理学家与病理生理学家；注重蛋白质的生理 功能，研究其胶体性质、缓冲性质和生理作用， 运输、结合功能等。
• ⑶血浆蛋白质 具有遗传的变异：如Hp、TFP等在不 同的人群中常见有结构上的差异，以及某些蛋白质 的缺乏表现出一定的临床症状，具有临床意义；遗 传学家利用蛋白质结构上的差异作为研究人群与家 族遗传特征的标志。
ppt牛奶中蛋白质含量的检测
考核评价
自我评价（30%） 小组评价（30%） 教师评价（40%）
谢谢聆听！
敬请批评指正
八、小结
步骤 湿法消化
碱化蒸馏 硼酸吸收 盐酸滴定
反应前后颜色变化
凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）→加硫 酸炭化黑色→消化后红棕色→ 棕褐色→消 化终点蓝绿色/墨绿色→淡蓝色（冷却后溶
液） 反应室：深蓝色或黑色沉淀
紫红色→绿色
甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色→灰色 甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色→蓝紫色
硼酸溶液（20g/L）1L怎么配制？
氢氧化钠溶液（400g/L）1L怎么配制？ 盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）2L怎么配 制？（注意） 混合指示剂：甲基红1+溴甲酚绿5
四、实验准备
硼酸溶液（20g/L）：称取20g硼酸，加水溶解后并 稀释至1000mL。
氢氧化钠溶液（400g/L）：称取40g氢氧化钠加水 溶解后，放冷，并稀释至100mL。
任务1 牛奶中蛋白质含量的检测0102 Nhomakorabea03
04
检查学生的 出勤情况
工作服穿 戴情况
学习用具 是否齐全
本次任务的 安全培训
实验安全最重要， 操作规则记心上。 个人防护有意识， 职业素养即养成。 防电，防烫，防硫酸！！
一、实验目的 二、相关知识 三、实验仪器及试剂 四、实验准备
五、实验步骤
六、数据分析及处理 七、注意事项
五、实验步骤
1.样品消化处理
• （1）称取10～25g试样，移入干燥的消 化管中，加入0.2g 硫酸铜、6g硫酸钾及 20mL浓硫酸，置于控温消化炉上。
• （2）小心加热，待内容物全部炭化，泡 沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内 液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明 后，再继续加热0.5～1h。取下冷却备用 。同时做空白试验
蛋白质检测方法ppt课件
✓优点：极高的显色灵敏度 和良好的检出限
✓缺点：水合茚三酮和不同 的氨基酸显色程度有所差 异，蛋白质水解程度的不 同容易对测量结果造成较 大误差。此外，茚三酮显 色剂的稳定性较差，不利 于长期存储
15
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
18
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
4
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
免疫印迹法检 测样品中特异 蛋白质的基本 流程
5
样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
✓ 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回 收
✓ 缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中 含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出 现较大的干扰
7
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。 ✓ 优点：绝大多数的有机物都有吸收响应，所以测量时几乎 无需进行样品前处理 ✓ 缺点：吸收系数小，其检测限通常不到 0.1%，不利于对蛋 白质的衡量分析
✓缺点：水合茚三酮和不同 的氨基酸显色程度有所差 异，蛋白质水解程度的不 同容易对测量结果造成较 大误差。此外，茚三酮显 色剂的稳定性较差，不利 于长期存储
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免疫印迹法检 测样品中特异 蛋白质的基本 流程
5
样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
✓ 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回 收
✓ 缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中 含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出 现较大的干扰
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。 ✓ 优点：绝大多数的有机物都有吸收响应，所以测量时几乎 无需进行样品前处理 ✓ 缺点：吸收系数小，其检测限通常不到 0.1%，不利于对蛋 白质的衡量分析
分光光度法检测蛋白质含量课件
实验一
分光光度技术及蛋白含量测定
•分光光度法检测蛋白质含量
• 理论 掌握分光光度技术的基本原理 了解分光光度计的基本构造
• 实验: 利用分光光度技术进行蛋白质含量测定 1.双缩脲法测定蛋白质含量 2.考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 3.紫外分光光度法测定蛋白质含量
•分光光度法检测蛋白质含量
分光光度技术（Spectrophotography）
标准曲线使用注意事项
❖标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。 ❖吸光度在0.05～1.0范围内。 ❖所作标准曲线仅供短期使用。 ❖标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，
避免误差产生。
•分光光度法检测蛋白质含量
5．应用中注意的问题***
❖ Lambert-beer’s law的偏离：该定律只适应于一定浓度 范围，A宜在0.05～1.0之间；
一、概念 利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含
量的一项技术 。 应用：定性、定量 优点：灵敏度高 精确度高 操作简便、快速
•分光光度法检测蛋白质含量
二、工作原理
❖物质对光线有选择性吸收作用。 ❖每种物质都具有其特征性的吸收光谱。 ❖在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质
的浓度成正比。
分光光度法所使用的光谱范围： 200nm ~ 10µm
优点：灵敏度高，1-5μg；测定速度快；干扰物质少。
•分光光度法检测蛋白质含量
【操作步骤】
1．取试管3支，编号按下表操作
试 剂（ml）
空白 标准
生理盐水
0.1
蛋白标准液(50ug／ml)
0.1
样品
0.1
考马斯亮蓝试剂 5.0 5.0
标本 5.0
2.混匀，放置5分钟，在波长595nm处，以空白管调“0”，测 定各管的吸光度。
蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝染色法(共20张PPT)
光源
0.575
单色器
吸收池
检测器 显示器
第6页，共20页。
➢ 光源
不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源
钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的320～1100nm波长的光谱，光通过三棱镜折射
后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该色谱可作为 可见光分光光度计的光源
吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质 Ø当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射，一 部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液，则：
入射光=反射光+吸收光+透过光
Ø如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射等因素造成的入射光 的损失，则：
入射光=吸收光+透过光
第4页，共20页。
Ø朗伯-比尔（Lambert-Beer）光吸收定律
u设 I0为经过空白校正后入射光的强度，I t为透过光的强度 u根据实验得知：It= I0 ·10－εbc，式中：c 表示吸收物质的摩尔浓度；b表示吸收物质的光径， 用cm表示；ε表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对光的吸收特性，不同物 质的ε数值不同，所以 It/ I0= 10－εbc u令 T（透射比）= It/ I 0 ， 则T=10－εbc ，lg（1 / T）=εbc ulg（l / T）为物质的吸光度（A），则A = 1g（1 / T）＝εbc，此式说明了物质的吸光度 与吸收物质的浓度和光程成正比，这就是Lambert-Beer光吸收定律
蛋白质含量的测定 考马斯亮光光度技术的一般原理
ü学习722型可见光分光光度计的操作 ü熟悉考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理和方法
卫生检验蛋白质ppt课件
③酚试剂法：灵敏度高达双缩脲法的100倍，有利于检出微量蛋白质， 较合适于单一蛋白质检测。
④紫外分光光度法：利用蛋白质在280nm处有吸收峰的特点，常用 于测定较纯的酶和免疫球蛋白。
⑤染料结合法：常用氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼 等，前三者主要用于蛋白电泳，邻苯三酚红钼可用于尿液和脑脊 液中蛋白质的测定，简便快速、灵敏，但不同蛋白质结合力不一 样，且试剂对比色杯有吸附作用。
(3).A/G比值 正常为1.5-2.5/1,ALB减少和/或球蛋白升高， A/G降低,严 重者A/G﹤1.0，称为A/G比值 倒置。
(4).先天性ALB缺乏症：ALB合成障碍，极少见。
13
4.溴甲酚绿法测定ALB 注意事项
(1).BCG是一种PH指示剂,变色域PH3.8(黄色)-5.4(蓝绿色),控制反应液 PH是本方法的关键。
1
一 .蛋白质代谢检查 二 .糖代谢检查 三 .离子测定
2
(一)TP测定:方法、原理、操作、临床意义及注意义、注意 事项
3
1. TP测定方法简介: TP测定时常利用蛋白质的一些特性,如重复的肽键结构;酪氨 酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外光吸收;与色素结合 的能力;沉淀后的浊度;电泳的迁移率大小等来设计蛋白质 的测定方法。经典和常见的方法分述如下：
9
2.双缩脲法测定TP 方法特点
(1).双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比,与蛋白质种类,分子量及 氨基酸组成无明显关系,各种蛋白质显色程度基本相同,显色稳定性好,试剂 单一。
(2).双缩脲法重复性好,RCV4%,CCV3.9%;线性范围0-140g/L,干扰少,使用
单一的稳定试剂,操作简单、快速,适于手工操作及自动化分析,为TP测定的 参考方法。 (3).唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍,但能满足临床生化 检验需要,对血清总蛋白定量较为适用;对蛋白质含量很低的其他体液如脑 脊液、胸腹水和尿液等，不是合适的定量方法。
④紫外分光光度法：利用蛋白质在280nm处有吸收峰的特点，常用 于测定较纯的酶和免疫球蛋白。
⑤染料结合法：常用氨基黑、丽春红、考马斯亮蓝、邻苯三酚红钼 等，前三者主要用于蛋白电泳，邻苯三酚红钼可用于尿液和脑脊 液中蛋白质的测定，简便快速、灵敏，但不同蛋白质结合力不一 样，且试剂对比色杯有吸附作用。
(3).A/G比值 正常为1.5-2.5/1,ALB减少和/或球蛋白升高， A/G降低,严 重者A/G﹤1.0，称为A/G比值 倒置。
(4).先天性ALB缺乏症：ALB合成障碍，极少见。
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4.溴甲酚绿法测定ALB 注意事项
(1).BCG是一种PH指示剂,变色域PH3.8(黄色)-5.4(蓝绿色),控制反应液 PH是本方法的关键。
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一 .蛋白质代谢检查 二 .糖代谢检查 三 .离子测定
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(一)TP测定:方法、原理、操作、临床意义及注意义、注意 事项
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1. TP测定方法简介: TP测定时常利用蛋白质的一些特性,如重复的肽键结构;酪氨 酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外光吸收;与色素结合 的能力;沉淀后的浊度;电泳的迁移率大小等来设计蛋白质 的测定方法。经典和常见的方法分述如下：
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2.双缩脲法测定TP 方法特点
(1).双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比,与蛋白质种类,分子量及 氨基酸组成无明显关系,各种蛋白质显色程度基本相同,显色稳定性好,试剂 单一。
(2).双缩脲法重复性好,RCV4%,CCV3.9%;线性范围0-140g/L,干扰少,使用
单一的稳定试剂,操作简单、快速,适于手工操作及自动化分析,为TP测定的 参考方法。 (3).唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍,但能满足临床生化 检验需要,对血清总蛋白定量较为适用;对蛋白质含量很低的其他体液如脑 脊液、胸腹水和尿液等，不是合适的定量方法。
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(三）、操作（标准曲线制作） ：
取7支试管按下表操作：
空白 待测 标1 标2 标3 标4 标5
标准蛋白 （微升）
待测样品2（微升）
生理盐水（微升） 100
CBB-G250(ml)
5.0
20. 40. 60. 80. 100. 5.0
95 80 60 40 20 0.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
最终蛋白浓度（微克/毫升）
4.0 8.0 12 16.0 20.0
混匀，室温放置3分钟，在595nm测定各管O.D
值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲
线．
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❖以Bradford法测定血清和层析分离 蛋白内的蛋白浓度
取2支试管分别从血清样品和层析样品 中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入 考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以 595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上 查出其蛋白浓度。
E.移液管
2F02.0试/12/1管0 与试管架来自2（2）、试剂
A. 9 g/L NaCl 溶液 B. 标准牛血清白蛋白溶液
牛血清白蛋白0.1克加生理盐水定容 至 100毫升。 C. 待测血清样品 取兔血清0.1毫升，用生理盐水稀释 至 20毫升。
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3、操作
取3支试管按下表操作：
液中，然后加入100毫升 850 ml/L 磷酸，最后加蒸馏
2水020定/12/1容0 至1000毫升。
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❖ （2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）
❖ （3）标准蛋白质溶液（1mg/ml）： 精确称取100毫克牛血清白蛋白，用生理
盐水定容至100毫升。 (4) 血清样品(已稀释4倍) (5) 层析样品(前次层析实验分离的原液)
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也可 分别测定各管280nm处的O.D值，以蛋白浓度 为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲线。
根据未知蛋白的O.D 值，可在标准曲线上查出该蛋 白的浓度。
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二、Bradford法
(一）、原理：
考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后 形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且
Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择
适20当20/1的2/10 对照品来消除。
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（二）器材及试剂
1、器材 A. 分光光度计 B. 微量加样器 C. 移液管、试管及试管架 D. 坐标纸
2. 试剂
（1）考马斯亮蓝G-250溶液：
称取CBB- G-250 100毫克 溶于 50 ml 950ml/L乙醇溶
空白 标准 测定
标准蛋白 （1 mg/ml） 0 0.5 0
待测样品1 （ml）
0 0 0.5
生理盐水 (ml)
4.0 3.5 3.5
轻轻混匀放置３分钟，在２８０nm处以空
白调零，测定各管光密度，计算蛋白含量．
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计算公式：
测定O.D/标准O.D X 标准浓度X稀释倍数 =待测样品蛋白浓度（mg/ml)
实验四、
紫外吸收法和Bradford法 检测蛋白质浓度
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一、紫外吸收法
1、原理： 蛋白质分子中含有共轭双键，在280nm处有
最大吸收值，其吸光度与蛋白浓度成正比。以标 准蛋白作参比即可求得未知蛋白浓度。
2、器材与试剂
（1）、器材
A.紫外分光光度计
B.坐标纸
C.恒温水浴
D.微量加样器
蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。这是一种快速、准
确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。CBB- G-250
在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保
持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，
更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。但较高浓度的十
二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），