蛋白质的定量测定方法PPT课件
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《蛋白质的测定》PPT课件
选择蒸馏时间四—五分钟，自 动完成蒸馏；
滴定，计算氮及蛋白含量。
计算公式
WcV0.014F100 m
W—蛋白质的质量分数，%； c—盐酸规范液的浓度，mol/L； V—试剂滴定耗费规范液量，mL； m—样质量量，g； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数，6.25。
三、微量凯氏定氮法
原理与常量凯氏定氮法一样
设备安装
步骤
采样〔固体采样、液体采样〕 样品预处置 样品分析 样品数据处置 撰写分析报告
2NH2(CH)2COOH ＋ 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O
2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O
2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
2、仪器和试剂
① 500ml凯氏烧瓶
② 定氮蒸馏安装
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
硫酸铜 ；
硫酸钾；
硫酸；
40g∕L硼酸溶液：
混合指示剂：〔国标〕1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L 甲基蓝乙醇溶液，临用时按2：1的比例混合。
或者1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L溴
甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5的比例混合；
400g∕L氢氧化钠；
蛋白质的测定
一、测定食品中蛋白质含量的意义 二、常量凯氏定氮法 三、微量凯氏定氮法 四、自动凯氏定氮仪
一、概述
〔一〕测定意义 1、蛋白质作为三大供能物质，是食品的重要
营养目的。 2、人体组织的构成成分。 3、构成体内各种重要物质 4、蛋白质不是越多越好〔添加肾负担，骨质
滴定，计算氮及蛋白含量。
计算公式
WcV0.014F100 m
W—蛋白质的质量分数，%； c—盐酸规范液的浓度，mol/L； V—试剂滴定耗费规范液量，mL； m—样质量量，g； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数，6.25。
三、微量凯氏定氮法
原理与常量凯氏定氮法一样
设备安装
步骤
采样〔固体采样、液体采样〕 样品预处置 样品分析 样品数据处置 撰写分析报告
2NH2(CH)2COOH ＋ 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O
2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O
2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
2、仪器和试剂
① 500ml凯氏烧瓶
② 定氮蒸馏安装
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
硫酸铜 ；
硫酸钾；
硫酸；
40g∕L硼酸溶液：
混合指示剂：〔国标〕1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L 甲基蓝乙醇溶液，临用时按2：1的比例混合。
或者1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L溴
甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5的比例混合；
400g∕L氢氧化钠；
蛋白质的测定
一、测定食品中蛋白质含量的意义 二、常量凯氏定氮法 三、微量凯氏定氮法 四、自动凯氏定氮仪
一、概述
〔一〕测定意义 1、蛋白质作为三大供能物质，是食品的重要
营养目的。 2、人体组织的构成成分。 3、构成体内各种重要物质 4、蛋白质不是越多越好〔添加肾负担，骨质
蛋白质的测定课件参考.ppt
1.装水至 2/3 容积 处，加甲 基橙数滴 及硫酸数 毫升以保 持酸性
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
高级生化试验-实验一蛋白质定量分析ppt课件
计算
〔1〕规范管法〔规范比较法〕 实践测定过程中，用一知浓度的测定物
按测定管同样处置显色，读出吸光度，再根 据前式计算。
A规范/A样品= KC规范/ KC样品 C样品=A样品/A规范×C规范
A：吸光度；K：吸光系数；C：溶液浓度；L： 液层厚度
〔2〕规范曲线法
配制一系列知不同浓度 的测定物溶液，按测定 管同样方法处置显色， 分别读取各管吸光度。
测定管
0.1
5.0
实验三 紫外分光光度法
【根本原理】 Tyr and Trp包含不饱和的共轭双键，因此蛋白质具
有吸收紫外光的性质，吸收峰在280nm波优点， 可利用该吸收峰值估计蛋白质浓度; 核苷酸是蛋白质样品中的主要污染成分, 其在280nm 处也有吸收峰, 但最大吸收峰值出如今 260nm;
Protein Conc (mg/ml)=1.45A280-0.74A260; A280/A260>1.5 (核苷酸的污染可以接受) ; 不够准确，但较为简便，样品可回收利用; 灵敏度：50-100μg
2．比尔〔Beer〕定律 一束单色光经过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介
质的浓度的添加呈指数减少。 LgI0/I=KC
I0 :入射光强度； I :透射光强度；C ：介质浓度 K：吸光系数
mbert-beer’s law
一束单色光经过某溶液时，光波被溶液吸收一部分， 吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。
2. 在试管架上有3中蛋白质样品 a. 规范血清，浓度70 mg/ml. 在Improved Lowry Assay中，用于 制备不同浓度的规范样品； b. 用于 Improved Lowry Assay的未知样品； c. 用于 Bradford assay的未知样品(勿稀释).。
蛋白质的定量测定方法PPT课件
以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘 制出标准曲线。
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下 测定其光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中 查出样品溶液的蛋白质含量。
第8页/共24页
【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
蛋白质染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定 的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2 分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便，快速，灵敏 度 高 ， 稳 定 性 好 ， 是 一 种 测 定 蛋第白20质页/含共量24页的 常 用 方 法 。
【实验材料】
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升 Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值 。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量。
第5页/共24页
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白
质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最
பைடு நூலகம்
广泛的方法之一。
第2页/共24页
【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于／L氢氧化钠溶液中，再把 硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后 将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下 测定其光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中 查出样品溶液的蛋白质含量。
第8页/共24页
【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
蛋白质染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定 的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2 分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便，快速，灵敏 度 高 ， 稳 定 性 好 ， 是 一 种 测 定 蛋第白20质页/含共量24页的 常 用 方 法 。
【实验材料】
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升 Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值 。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量。
第5页/共24页
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白
质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最
பைடு நூலகம்
广泛的方法之一。
第2页/共24页
【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于／L氢氧化钠溶液中，再把 硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后 将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
蛋白质组学定量研究常见方法-PPT课件
辉骏生物：fitgene/
免费服务热线：400-699-1663
1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
4：化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰 物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造 成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
蛋白质组学定量研究常见方法
辉骏生物：fitgene/
免费服务热线：400-699-1663
蛋白质组学定量研究常见方法
1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC
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BCA法测定蛋白质含量ppt课件
C测=A测/ A标×C标
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
2.利用标准曲线法进行换算测定物浓度（标准曲线法）
❖ 配制一系列的
A
标准管，然后
绘出标准曲线。
A待测
❖ 再测出测定管 的吸光度，在 标准曲线上查 找到对应浓度。
二.实验原理
A562∝M蛋白质
紫蓝色
562nm
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
二.实验原理
采用标准曲线法计算待测液含量
作图人：
仪器型号：722型分光光度计
时间：
A待测
波长：562nm
45°
二.实验原理
在碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原为Cu+， Cu+与两分子 BCA（二辛可酸）反应形成紫蓝色的络合物，测定其在 562nm处的吸光度值，并与标准曲线对比，即可计算待测
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
5 测定管
m(ug)
0 15 30 45 60 75
吸光度 (A)
仪器名称、型号编号： 波长： 测定日期： 测定人：
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
四.注意事项
1、实验分组，两人一组 2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染 3、准确量取试剂，正确使用吸量管 4、正确操作722型分光光度计，此次由于 溶液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗 5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、 作图人、时间等 6、实验原始数据书写规范，三线表 7、待测液(小牛血清)已经稀释了500倍，
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
2.利用标准曲线法进行换算测定物浓度（标准曲线法）
❖ 配制一系列的
A
标准管，然后
绘出标准曲线。
A待测
❖ 再测出测定管 的吸光度，在 标准曲线上查 找到对应浓度。
二.实验原理
A562∝M蛋白质
紫蓝色
562nm
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
二.实验原理
采用标准曲线法计算待测液含量
作图人：
仪器型号：722型分光光度计
时间：
A待测
波长：562nm
45°
二.实验原理
在碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原为Cu+， Cu+与两分子 BCA（二辛可酸）反应形成紫蓝色的络合物，测定其在 562nm处的吸光度值，并与标准曲线对比，即可计算待测
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
5 测定管
m(ug)
0 15 30 45 60 75
吸光度 (A)
仪器名称、型号编号： 波长： 测定日期： 测定人：
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
四.注意事项
1、实验分组，两人一组 2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染 3、准确量取试剂，正确使用吸量管 4、正确操作722型分光光度计，此次由于 溶液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗 5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、 作图人、时间等 6、实验原始数据书写规范，三线表 7、待测液(小牛血清)已经稀释了500倍，
最新实验一蛋白质含量测定ppt课件
生物化学与分子生物学基础实验
TU1800 紫外可见分光光度计
波长范围：200－1100nm 钨灯：340－1100nm
测光系统：单光束
氘灯：200－340nm
功能指标：光度测量 光谱扫描 定量测量
生物化学与分子生物学基础实验
注意事项
1 测紫外吸收要用石英比色皿 ！ 2 定量实验取液要准确。 3 从低浓度到高浓度依次测量，比色皿不要润 洗。 因此3ml溶液足够测定。 4 测量完毕，请把光度计的盖打开 ！ 5 每次实验时提交上一次的实验报告。
生物化学与分子生物学基础实验
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
实验步骤
0 1234567
标准蛋白（1mg/ml）ul 0 20 40 80 120 160 200 0
待测样品 ul
-
- - - - - - 200
蒸馏水 ul
1000 980 960 920 880 840 800 800
Folin-酚试剂甲 ml
3、所有的样品（包括标准样品），都必须在规定时间 内测试。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出 的样品浓度与实际的浓度不符。
生物化学与分子生物学基础实验
722型光栅分光光度计
光 源
单 色
样
光
读
品
电
数
器
池
源
单
件元
测量完毕，请把光度计的盖打开 ！
讲解完毕后，每个组出一个同学去 127听老师讲解仪器使用。
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
• 酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙 醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。
蛋白质的测定PPT课件
杜马斯法（燃烧法）
样品在高温下（700-800℃）燃烧，释放的氮 气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。 测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。
几种蛋白质测定方法比较
原理 装置 溶剂
时间 灵敏 度 干扰
凯式定氮法 双缩脲
总氮量
蛋白氮
凯式定氮装置 分光光度计
浓硫酸
用量较少
长
较低
简单快速 低
较小
▪ Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml） ▪ N为稀释倍数 ▪ c为样品原浓度（mg/ml）。
福林-酚法（双缩脲法的发展）
▪ 两步反应
(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋 白质—铜络合物。
(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂) 还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物) 。
0.0 4.0
A540
取两组测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋 白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定
取4支试管分成两组，按下表平行操作：
0Байду номын сангаас
1
样品稀释液/ml
0.5
蒸馏水/ml
1.0
0.5
双缩脲试剂/ml
4.0
4.0
A540
3、计算
▪ 取两组测定的平均值计算：
固体样品蛋白质的含量(%) Y N 100% c
第四节 氨基酸定量测定
一、甲醛滴定法
氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后， 与-NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定 -COOH基。
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法 利用特定氨基酸残基法
实验四 蛋白质的定量测定方法共26页PPT
实验四 蛋白质的定量测定方法
16、自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17ห้องสมุดไป่ตู้一般情况下)不想三年以后的事， 只想现 在的事 。现在 有成就 ，以后 才能更 辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须 充满光 明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
16、自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17ห้องสมุดไป่ตู้一般情况下)不想三年以后的事， 只想现 在的事 。现在 有成就 ，以后 才能更 辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须 充满光 明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
实验二蛋白质定量测定22页PPT
40、人类法律，事物有规律，这书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
实验二蛋白质定量测定
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
实验二蛋白质定量测定
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
蛋白质定性定量分析ppt课件
2021/6/15
29
2、利用微电极直接测定凝胶表面的p H而得知样品的等电点；
3、将凝胶切成等距离(5nm)的小块， 浸于水中，用精密试纸测定pH。以凝 胶块距正极的距离为横坐标，pH为纵 坐标作用图得出胶的pH梯度曲线。根 据待测样品在凝胶中的位置而得出蛋
白质样品的等电点。
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与标准蛋白比较，得出样品蛋白的含量。
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免疫印迹技术的基本操作(例PKC)
1、细胞裂解物的制备 2、细胞裂解液蛋白含量测定 3、细胞裂解物SDS－PAGE电泳 4、蛋白质转膜 5、目的蛋白的检测
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转变为硫酸铵。
Pr＋H2SO4
CO2＋H2O＋(NH4)2SO4
(NH4)2SO4+2NaOH NH4OH+HCl
NH4OH+H2SO4 NH4Cl+H2O
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凯氏法的评价： 优点：
1、适用于一切形态的样品； 2、不用比色，对混浊不透明的样品也可 进行分析； 3、结果的精、准度较高。
其它蛋白质定性定量分析技
术
蛋白质的电泳染色定量分析
特定蛋白质在总蛋白中所点比例的分析：最
早应用于血浆蛋白电泳分离后白蛋白和球蛋
白的比例测定。其方法有二，其一是将染色
后的蛋白区带剪下，用适当的溶剂提取后比
色测定；其二用反射扫描仪处理后，计算各
蛋白质含量的测定(共4张PPT)
第三页，共4页。
样品的测定
吸取提取液和稀释250倍的血清液各1.0mL于试管中（三次重复），分别 加5.0mL试剂甲，放置10分钟后，加试剂乙0.5mL，立即混匀，恒温37度 反应20分钟，测A750的值。
管号
1 2 3
小白 菜
T或A
管号
1 2 3
血清 T或A
☆小白菜用mg／g，血清用mg／mL。
／mL）
μg
1 样品（小白菜）液的提取
其中双缩脲法和Folin-酚法
0
1.0 0
2 以1号为参比，测A750的值。
0.2 0.8 50
进—一Fo步lin掌-酚握试分剂光法光（度L法ow—ry—法求3）标和准考曲马线斯、0亮.准蓝4确法测（定Br未od知0fo.样rd6品法、）正100
4 其中双缩脲法和Folin-酚法
蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚基
的酪氨酸，故有此颜色反应。因此，用Folin-酚法测定蛋白质 含量灵敏度较高。
第二页，共4页。
实验步骤 1.标准曲线的制作：按下表操作
管
BSA
H2O Pr.
蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混号合物）。（300μg
含量
样品（小白菜）液的提取 是一般实验室中经常使用的方法。
蛋白质含量的测定
—Folin-酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝法
（Brodford法）
一 Folin-酚试剂法（Lowry法） 目的和要求
学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。
进一步掌握分光光度法——求标准曲线、准确测定未知样品、正 确使用仪器
第一页，共4页。
原理
蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如折射率、比重、紫 外吸收等测定而得知：或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、 Folin-酚试剂反应等方法来求算。其中双缩脲法和Folin-酚法
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(3)标准蛋白质溶液：用分析天平精密称取牛(或人)血清白蛋 白100毫克，用少量蒸馏水完全溶解后，转移至100毫升容量瓶 中，准确稀释至刻度，使蛋白质浓度1mg/mL。
(4)样品溶液：配制约0.5mg/mL的酪蛋白溶液作为未知样品 溶液。
.
5
【实验操作】
1. 绘制标准曲线 取7支试管，按下表分别加入各试剂
(2)Folin酚试剂乙：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠
(Na2WO4∙2H2O)、25g钼酸钠(Na2MoO4∙2H2O)、700mL蒸馏水、50mL85％磷酸及 100mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加150g硫酸锂、50mL蒸
馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定
.
2
【实验原理】
该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度 范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用 比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质 浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时 （25100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(525μg) 在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线 求出未知样品中蛋白质的含量。
(2)样品溶液：配制约0.5mg/mL的酪蛋白溶液作为 未知样品溶液。
.
8
【实验操作】
1. 绘制标准曲线
取 7 支试管按下列各表加入各试剂：
试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0 号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。
以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制 出标准曲线。
紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简 便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因 此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。
.
7
【实验材料】
1.实验器材
试管及试管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外 分光光度计。
2.实验试剂
(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／mL的酪蛋白 溶液。
容到1000mL。过滤，如显绿色，可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色。置
于棕色瓶中暗处保存。.
4
【实验材料】
使用前用标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞为指示剂，以标定该试 剂的酸度，一般为2mol／L左右(由于滤液为浅黄色，滴定时滤 液需稀释100倍，以免影响滴定终点的观察)。使用时适当稀释 (约1倍)，使最后浓度为lmol／L酸。
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下测定其 光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查 出样品溶液的蛋白质含量。
.
9
【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
【实验原理】
凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时， 则可用此法测定样品中蛋白质的含量。
实验 蛋白质的定量测定方法
【实验预习】
1.试比较Folin酚法与考马斯亮蓝染料结合比色法 的优缺点。
2 .试比较二喹啉甲酸法与Folin酚法的优缺点。
3.凯氏定氮法中在消化样品时，加入浓硫酸，硫 酸钾和硫酸铜粉末的目的是什麽？
4.紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是什麽？
.
1
一、Folin酚试剂法(Lowry法)
。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量. 。
6
二、紫外吸收法
【实验目的】
1. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
2. 掌握紫外分光光度计的操作方法。
【实验原理】
大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色 氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收， 并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利 用这一特性可定量测定蛋白质的含量。
当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳 和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程 通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加 入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂， 以促进反应的进行。
.
10
消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的 硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨 蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后， 氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指 示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液 中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量可计算 出待测物中的总氮量。
【实验目的】
1.学习Folin 酚试剂法测定蛋白质含量的原理。
2.掌握Folin酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。
【实验原理】
蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin酚试剂起氧化还 原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子 中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质Cu2+复合物；第二 步：蛋白质Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中 的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克 蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品 中蛋白质的含量。
.
11
【实验材料】 1.实验器材 微量凯氏定氮仪1套；50mL凯氏烧瓶4个；移液管；锥形瓶；试管；小玻璃珠 2.试验试剂 (1)浓硫酸；30％氢氧化钠溶液；2％硼酸溶液；标准盐酸溶液(0.01mol／L)。 (2) 粉末硫酸钾—硫酸铜混合物： K2SO4与CuSO4∙5H2O以3：1配比研磨混合。 (3)混合指示剂(田氏指示剂)：由50mL0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1％甲 基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。 (4)样品溶液：配制3mg/mL的牛血清白蛋白溶液作为样品。
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含
量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。 Nhomakorabea.
3
【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50mL0.lmol／L氢氧化钠溶液中， 再把0.5g硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液， 然后将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
各管加入Fo1in酚试剂乙后，立即摇匀，放置30分钟后比色，在
500nm处记下各管光密度，以0号管为对照，以光密度为纵坐标，标
准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升
Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值
(4)样品溶液：配制约0.5mg/mL的酪蛋白溶液作为未知样品 溶液。
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【实验操作】
1. 绘制标准曲线 取7支试管，按下表分别加入各试剂
(2)Folin酚试剂乙：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠
(Na2WO4∙2H2O)、25g钼酸钠(Na2MoO4∙2H2O)、700mL蒸馏水、50mL85％磷酸及 100mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加150g硫酸锂、50mL蒸
馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定
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【实验原理】
该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度 范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用 比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质 浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时 （25100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(525μg) 在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线 求出未知样品中蛋白质的含量。
(2)样品溶液：配制约0.5mg/mL的酪蛋白溶液作为 未知样品溶液。
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【实验操作】
1. 绘制标准曲线
取 7 支试管按下列各表加入各试剂：
试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0 号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。
以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制 出标准曲线。
紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简 便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因 此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。
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【实验材料】
1.实验器材
试管及试管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外 分光光度计。
2.实验试剂
(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／mL的酪蛋白 溶液。
容到1000mL。过滤，如显绿色，可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色。置
于棕色瓶中暗处保存。.
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【实验材料】
使用前用标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞为指示剂，以标定该试 剂的酸度，一般为2mol／L左右(由于滤液为浅黄色，滴定时滤 液需稀释100倍，以免影响滴定终点的观察)。使用时适当稀释 (约1倍)，使最后浓度为lmol／L酸。
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下测定其 光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查 出样品溶液的蛋白质含量。
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【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
【实验原理】
凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时， 则可用此法测定样品中蛋白质的含量。
实验 蛋白质的定量测定方法
【实验预习】
1.试比较Folin酚法与考马斯亮蓝染料结合比色法 的优缺点。
2 .试比较二喹啉甲酸法与Folin酚法的优缺点。
3.凯氏定氮法中在消化样品时，加入浓硫酸，硫 酸钾和硫酸铜粉末的目的是什麽？
4.紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是什麽？
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一、Folin酚试剂法(Lowry法)
。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量. 。
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二、紫外吸收法
【实验目的】
1. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
2. 掌握紫外分光光度计的操作方法。
【实验原理】
大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色 氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收， 并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利 用这一特性可定量测定蛋白质的含量。
当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳 和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程 通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加 入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂， 以促进反应的进行。
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10
消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的 硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨 蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后， 氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指 示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液 中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量可计算 出待测物中的总氮量。
【实验目的】
1.学习Folin 酚试剂法测定蛋白质含量的原理。
2.掌握Folin酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。
【实验原理】
蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin酚试剂起氧化还 原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子 中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质Cu2+复合物；第二 步：蛋白质Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中 的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克 蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品 中蛋白质的含量。
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【实验材料】 1.实验器材 微量凯氏定氮仪1套；50mL凯氏烧瓶4个；移液管；锥形瓶；试管；小玻璃珠 2.试验试剂 (1)浓硫酸；30％氢氧化钠溶液；2％硼酸溶液；标准盐酸溶液(0.01mol／L)。 (2) 粉末硫酸钾—硫酸铜混合物： K2SO4与CuSO4∙5H2O以3：1配比研磨混合。 (3)混合指示剂(田氏指示剂)：由50mL0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1％甲 基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。 (4)样品溶液：配制3mg/mL的牛血清白蛋白溶液作为样品。
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含
量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。 Nhomakorabea.
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【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50mL0.lmol／L氢氧化钠溶液中， 再把0.5g硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液， 然后将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
各管加入Fo1in酚试剂乙后，立即摇匀，放置30分钟后比色，在
500nm处记下各管光密度，以0号管为对照，以光密度为纵坐标，标
准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升
Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值