外源基因在酵母体系中表达

S:284
ds Fv (di-sulfide-bonded n.r S/n.r Luo, et al (1995), J.
single chain antibodies) n.r
Biochem. 118:825-831
在基因工程表达调控水平上，巴斯德毕 赤酵母（Pichia pastoris）基因表达系统 已有许多新进展。
galactosidase total protein)
Invertase
2.3
Tumor
10
nectosis
factor(TNF)
Bovine
0.55
lysozyme c2
Streptokinase 0.08
(active)
Where/how expressed* I/Muts
I/Mut+ S/Mut+ I/Muts
Scorer, et al (1993)
Carboxypeptidase B
0.8 S/Mut+ and MutS Despreaux, et al (1993)
TAP(tick anticoagulant 1.7
protein)
Porcine
leukocyte n.r
lipoxygenase (72kD)
第一代酵母基因工程表达系统是以酿酒酵 母表达系统为典型代表。
第二代酵母基因工程表达系统的典型代表 就是近年来倍受关注的毕赤酵母表达系统 等为代表的甲醇酵母表达系统：
1987年Cregg等首次报道甲醇营养型毕 赤酵母(Methy1otrophic Pichia pastoris)表达 外源蛋白以来，由于它具有表达效率高， 遗传稳定，产物可分泌表达等优点，己成 为近年来极受青睐的真核基因表达系统。
6434
S/n.r Vad, et al (1995),
Yeast 11:S606
S/MutS Roca,
et
al
(1995),Yeast
11:S589
I/n.r Shiraishi, et al (1995),
Plant
Physiology
108:2(s) 72
I/MutS Trant, J.M. (1996),
短短十多年来，用该系统表达的外源基 因已达三百多种，表达的产物包括细胞 因子、基因工程疫苗、基因工程抗体、 蛋白酶及受体等，表1为利用毕赤酵母表 达的活性蛋白，其中大部分可成为医药 制品，用发酵罐发酵规模可达20-50M3以 上。因此，毕赤酵母表达系统的研究进 展具有极重要的经济效益和社会意义。
activity)
S/MutS Masure, et al (1995), J
of Int&Cyto Rsch
15:955-963
S/MutS Nair, et al (1995),
Blood 86:(10s1):18a
S/MutS Sadhukhan, et al
(1996)
J
of
Biol.Chem.271:6429-
of
Biol.Chem.
271:6490-6496
Human
MCP- 0.00
3(Monocyte
1
Chemotactic Protein)
Human erythropoietin 0.00
receptor
5
Angiotensin-conventing n.r
enzyme(90kD,active)
酵母菌启动子类型
组成型 诱导型 分泌型 复合型
3- 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 （ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAP）
醇氧化酶 （Alcohol oxidase, AOX） 甲醇氧化酶 （methanol oxidase, MOX） 甲酸脱氢酶 （formate dehydrogenase, FMD） 二羟丙酮合成酶（dihydroxy acetone synthase, DHAS） 磷酸甘油酸激酶 （phosphoglycerate kinase, PG K ） 醇脱氢酶 (Alcohol dehydrogenaseⅠ, ADHⅠ)
Human parathyroid n.r
hormone
P.minioluteum
2.5
dextranase
(SUC2
signal sequence)
Spinach cytochrome c 0.1
reductase
Dogfish
shark n.r
cytochrome p450c17
(hydroxylase and lyase
Arch. of Bioch.&
Biophy 326:81-14
Human Clusterin, with native 0.1 S/n.r Lakins, et al (1995), J.
signal sequence(10-100 times
of Cellular Biochem
higher than S.cerevisiae)
Rodriguez, et al (1994) Paifer, er al (1994)
Kunitz protease inhibitor 1 S/Mut+ (APLP-2)
Van Nostrand, et al (1994)
thrombomodulin 0.01-0.03 S/MutS White, et al (1994)
目前用于基因表达的酵母表达 系统主要类型有以下11种：
酿酒酵母表达系统 粟酒裂殖酵母表达系统 克鲁维酵母表达系统 毕赤酵母表达系统 汉逊酵母表达系统 解脂耶鲁酵母表达系统
假丝酵母表达系统 许旺酵母表达系统 嗜腺嘌呤阿祖鲁酵母表达系统 丝孢酵母表达系统 球拟酵母表达系统
酵母菌基因工程载体：
S/MutS n.r n.r S/MutS S/MutS S/MutS
Ridder, er al (1995)
Jenkins and Fayer (1995) Howard and Maurer (1995) Steinlein, et al (1995) Ohsawa, et al (1995)
Fryxell, et al (1995)
I/MutS
Vozza, et al, (1996), biotechnology 14:7781 Weib, et al (1995), FEBS 377:451-456
Staab, et al (1996), J
of
Biol.Chem.
271:6298-6305
Brandes, et al (1996),J
外源基因在酵母体系中的表达
外源基因在酵母体系中的表达
酵母菌是一种单细胞真核生物，人们对其 遗传学、生理学和全基因组序列等方面已有 较为深入的研究。酵母菌在分类学上属于真 菌界子囊菌纲和担子菌纲，目前已发现90多 个属，700多个种，10000多个独立菌株，构 成一个庞大的微生物家族。
酵母作为基因工程表达系统，既有原核生物 那样生长、繁殖快速，表达量高的特点，又 有与高等真核生物十分相像的蛋白质翻译后 加工和基因表达调控的特征。另一方面，长 期以来酵母作为工业微生物的主要菌种，在 工业化发酵方面已积累了大量的经验。因此 酵母表达系统是一种有着非常大的发展潜力 的真核生物基因表达系统。
C.albicans hyphal n.r cell wall Ag
Spinach
2
phosphoribulokinase
S/Mut+ Halaas, et al (1995)
Shiba, et al (1995)
S/Mut+
S/Mut+, S/MutS( 30,000 copies/c ell) S/MutS
酵母附加体型载体(YEp) 酵母复制型载体(YRp) 酵母着丝粒型载体(YCp) 酵母线性载体(YLp) 酵母整合载体(YIp) 酵母人工染色体(YAC)
酵母复制起点：2μori ; ARS 酵母来源 DNA 酵母调控元件：AOX1; GAP
酵母选择标记：Trp1; Leu2; Ura3; His4 酵母载体
S/Mut+ I/n.r.
Reference
Cregg,et
al
(1987)
Tschopp, et al (1987a) Tschopp, et al (1987b) Sreekrishna,et al(1989)
Digan,et
al
(1989)
Hagenson, et al
(1989)
Tetanus toxin 12
载体类型的发展：毕赤酵母载体一般为穿 梭载体(Shutt1e Vector)，通常具有甲醇精确 诱导调控的醇氧化酶(Alcohol Oxidase ,AOX) 启动子PAOX；根据酵母菌基因组上 AOX结 构基因被外源基因所替换情况，形成Mut+ 或Mut-等不同表型；载体含有一个多克隆位 点、AOX1转录终止序列、酵母选择标志 His4以及来自大肠杆菌质粒 pBR322的Amp 和ColE ori序列等。
Human proteinase cathepsin n.r
E (homodimer of 42 kD
protein)
Bm86
(tick
gut 1.5
glycoprotein)
Alpha amylase
2.5
S/Mut+ I/MutS S/MutS
S/MutS S/MutS
Larouche, et al (1994) Reddy, et al (1994) Yamada, et al (1994)
遗传稳定性：毕赤酵母表达载体多采用 整合型表达质粒，以线形化重组质粒形 式整合到酵母基因组内，随着酵母宿主 菌染色体的复制而复制，外源目的基因 在酵母世系传代趋于稳定，不易丢失。
载体元件的发展：除了PAOX1启动子外，还有 PDAS、PGAP启动子等同样具有很高的表达效率。
选择性标记：毕赤酵母一般为营养缺陷型筛选， 常用His4，也有用蔗糖酶基因SUC2和G418r、 Zeocinr等。
S/Mut+ and 源自文库uts
I and S/Mut+
Clare, et al (1991a) Romanos, et al (1991) Clare, et al (1991b) Vedvick, et al (1991) Wagner, et al (1992)
Barr, et al (1992)
信号肽序列：可用外源基因自身的信号 肽在毕赤酵母中表达，也可用来自酿酒 酵 母 交 配 因 子 （ AMF ） 的 信 号 肽 序 列 （pre-proAMF）等，达到分泌表达的目 的。此外，信号序列还可使用来自酿酒 酵母的SUC2信号肽序列，酵母酸性磷酸 酶基因PHO1的信号肽序列等。
fragment C
Pertusis
3
antigen P69
Mouse EGF 0.45
Aprotinin 0.8
Kunitz
1
protease
inhibitor (A-
beta-PP)
Human
4
serum
albumin(HS
A)
HIV-1
1.25
gp120
and
0.02
I/Mut+ and Muts I/Muts S/Muts S/Mut+/Muts S/Mut+
Hamster prion PrPc <0.001 I/MutS Weiss, et al (1995)
Mouse OB gene 0.01
(leptin)
Human
alanyl-
tRNA synthetase
Recombinant
6mg/L
enterokinase(26kD)
Mouse serotonin 0.001 recepor
大肠杆菌复制起点：pBR322 ori 细菌来源 DNA
大肠杆菌选择标志：Ampr;Tetr
酵母菌与高等真核生物的染色体能够稳定的 传代，将遗传物质均匀地分配到子代细胞中去。 这些真核生物之所以具有稳定传代的功能，是由 于染色体内有复制起点（ARS 元件）、着丝粒（CEN 元件）和端粒（TEL）三种类型的结构元件。因 此，在构建酵母载体时，为了载体的稳定传代， 往往将这三种结构元件插入到酵母载体上。
Tab.1 Published examples of heterologous
protein expression in Pichia pastoris
Protein
Expression
level(g/L)
Hepatitis B 0.4
surface
antigen
Beta-
20,000(U/mg
Rabbit
scFv >0.1g/L
(30kD)
CP15(Cryptospori n.r
dium parvum)
Rat pit-1
n.r
Human N-terminal 0.27 transferrin Amyloid precursor 0.001-0.004 protein Human CD38 ~0.16