酵母基因克隆与表达载体

Gal4蛋白有一个非常突出的特性，它的二个结构域在其适当的连接区被打断后仍具有各自的功能，而且这两个不同的结构域可以重建继续发挥转录激活作用。这一特性使得研究者可以构建两个载体来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。具体方法是：将A基因与DB融合构建一个表达质粒（通常带Trp标志基因，以下简称Trp质粒）在酵母中表达Gal4-BD-A，将B基因与AD融合构建另一个表达质粒（通常带Leu标志基因）表达Gal4-AD-B，然后将者两个质粒转化酵母，在泛基诺SD/-Trp-Leu双缺培养基上筛选转化克隆（备注：两个质粒共转化的效率一般很低，也可先后逐个转化，即先转化Trp质粒，在泛基诺SD/-Trp的培养平皿中筛选阳性克隆后再转化Leu质粒。如果A蛋白和B蛋白之间存在相互作用，那么Gal4-BD和Gal4-AD通过A和B的桥接作用被聚集在一起而重建转录因子的活性，启动下游报告基因的转录。早期的报告基因选用LacZ，后来为减少非特异性激活而产生的假阳性，增加了双报告基因和三报告基因(LacZ,His3,Ade2)。
此类质粒在细胞内以附加体的形式高度复制, 每个细胞高达200-400个拷贝贝
用途: 用于外源基因的表达
(二). 表达载体
1、GAL1启动子表达载体-----半乳糖诱导的表达载体
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
此类质粒在细胞内可自主复制,且由于含有中心粒复制序列,因此每个细胞近乎只有一个拷贝。
用途: 由于每个细胞平均只有一个拷贝,避免了目的基因的盈余表达,因而特别适用于基因功能的研究
3、酵母附加体质粒(Yeast episomal plasmid, YEP)
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
2、Cup1启动子表达载体-----硫酸铜诱导的表达载体
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
3、ADH启动子表达载体-ADC1组成型表达载体
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
此类质粒经酶切线性化后可整合到酵母细胞基因组中
用途: a.基因取代或基因删除 b.稳定型表达元件的整合(integration)和敲入(knock in)
2、酵母中心粒-自主复制质粒(Yeast CEN-ARS plasmid, YCP)
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
不久前，由于一个委托研究课题的需要，我用荧虫酶报告基因Luciferase将LacZ置换掉，原始材料分别选用Y187和AH109，在实验之前，需要对局部基因组区域测序收集有关信息，结果发现：Y187和AH109这两个酵母报告株每个报告基因的上游UASg序列与我当年用定点突变优化的组合序列竟完全一致，一个碱基也不差!！我真的不敢想这是否就是出自我当年之手。谈笑间，二十年过去，往事如梦，但一切又仿佛是在昨天，令人感慨万千! 有一首歌是怎么唱的来着？仿佛是：多年后，终点又回到了起点。这就是酵母双杂交系统的前事今生！二十年前酵母遗传学的副产品酵母双杂交系统如今在后基因组时代-蛋白质组研究中再次大放异彩。
1． 酵母表达载体的选择
用酵母来获得高产量蛋白质，其表达载体应具备以下三个特点：一是高效启动子，二是高拷贝质粒，三是可控性。GAL1启动子在半乳糖的诱导下，具有高效启动表达的特性，且在葡萄糖存在的情况下表达几乎完全被抑止，因此在大量表达某些蛋白可能对酵母细胞产生毒性的情况下，GAL1诱导性启动子是很好的选择。这类表达载体的代表是Invitrogen公司的pYes2和pYes3，泛基诺（FunGenome）公司的pYes4，pYes5，pYes6。如果大量表达的蛋白质不具有细胞毒性，ADH构成性（又称组成性）启动子则是非常适用的选择，这类表达载体的代表是泛基诺公司的pAY2，pAY3，pAY4
2． 酵母营养缺陷型培养基的选择
根据表达载体的特性来选择培养基，举例来说：如果选用的表达载体是pYes2那么就应该用SD-Ura(Synthetic Dropout Ura media),其原理是pYes2含尿嘧啶（Ura）合成酶途径中一个关键酶基因Ura3，当pYes2转化Ura3基因缺陷的酵母时，便可以在缺乏Ura的选择缺陷培养基SC-Ura中筛选。同样的道理，pYes3对应的选择缺陷培养基是SD-Trp(简写pYes3-Trp), pYes4(对应的选择缺陷培养基是SC-His，pYes5对应的选择缺陷培养基是SC-Leu, pYes6对应的选择缺陷培养基是SC-Ade。多元基因表达或质粒共转化时可选用SC-Ura-Trp-His-Leu-Ade的适当组合。更详细的培养基选择信息和特殊的个性化要求可发送电子邮件到fungenome@咨询。这里特别强调，泛基诺公司提供的酵母选择缺陷培养基含有除葡萄糖外的所有营养成分，不需要再另加minimal SD base酵母含氮碱和其他氮源，加水后高压灭菌即可，极大地方便了使用者的配置，由于提供的是粉剂，因此在保存干燥的情况下可以长期保存
GAL4基因是酵母糖代谢中的一个重要基因，其编码的蛋白质Gal4（备注: GAL4表示基因，Gal4表示蛋白）具有两个结构域：位于N末端的DNA结合结构域(DNA-binding domain,简称BD)和位于C末端的转录激活结构域(transcription-activating domain,简称AD)。DNA结合结构域（BD）能识别GAL1基因启动子的上游激活序列（Upstream Activating sequence,UAS），转录激活结构域（AD）可同转录复合物的其他成分作用，启动GAL1基因的转录。GAL1基因上游含4个特殊序列UASg (upstream activator sequence-galactose)。每个UASg由17bp序列构成，当加入半乳糖作为诱导物后，Gal4可全方位的与GAL1的UASg结合，从而使GAL1基因的表达成千倍地增加。
二.酵母基因克隆与表达载体
(一).功能型骨架载体-----用于不同用途的功能研究和载体改造
1、酵母基因组整合质粒(Yeast integrating plasmid, YIP)
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
作为分子生物学实验操作的案头资料-红皮书(Current Protocol in Molecular Biology)将酵母作为一个独立的章节与其他常用分子生物学实验技术并行而列；而被生命科学实验室奉为圣经的分子克隆, 其第三版的多个章节则穿插有不同方面的酵母实验操作, 足见酵母遗传学方法在当今生命科学研究中的重要作用。酵母在生命科学研究中主要用于以下几个方面:
神奇的酵母遗传学技术与高等生物基因功能研究系列讲座(二)酵母双杂交系统的前世今生
2010-08-02 15:39:40| 分类： 酵母遗传学方法与 | 标签：转录 gal4-bd gal4ad 报告基因 酵母双杂交 |举报|字号 订阅
酵母双杂交系统的原理、应用与进展
酵母实验操作在国内研究型实验室广为传播的主要原因还是酵母双杂交系统的应用和发展，关于酵母双杂交系统的原理，这方面的文章俯拾皆是，但无论是新手上路还是导师专家，花几分钟的时间参阅下面由泛基诺技术总监撰写的内容，相信您还是能得到一些非常有用的信息，并在实际科研工作中有一定的借鉴作用。
【正文】酵母双杂交系统首先由Stanley Fields实验室建立的，其原始出处参见1987年Cell杂志上的论文。该系统的理论基础是建立在对于酵母半乳糖代谢调控的两个关键转录因子Gal80负调控因子和Gal4正调控因子的功能解析上。
作者: 泛基诺技术总监 胡恩泛
【编辑部按：无论是新手上路还是导师专家，花几分钟的时间参阅下面由泛基诺技术总监撰写的内容，相信您还是能得到一些非常有用的信息，并在实际科研工作中有一定的借鉴作用】
酵母遗传学对二十世纪九十年代以来的生命科学与医学研究产生了极大地推动作用，其威力之巨大、影响之深远、应用之广泛使得其他任何一种模式生物都不能望其项背。这一节主要讲述酵母双杂交系统原理的最新诠释和实验操作精要。
神奇的酵母遗传学技术与高等生物基因功能研究讲座（一）外源基因在酵母中的表达
2010-07-24 11:51:11| 分类： 酵母遗传学方法与 | 标签：酵母培养基 选择缺陷 dropout 表达质粒 |举报|字号 订阅
作者：泛基诺技术部模式生物组 朱蕾诺
芽生酵母（budding yeast, Saccharomyces cerevisiae）俗称酿酒酵母,是单细胞真核生物，它的基因组比较简单（仅为大肠杆菌的3-4倍），易于操作，遗传背景相对清楚，加之其突变株又易于分离，而被誉为“真核大肠杆菌”（Eukaryotic E.coli）和“体内试管”（In vivo test tube), 因而是研究高等真核生物基因功能的理想模式生物。正象离不开大肠杆菌的操作一样, 一个向深度发展的分子生物学实验室离不开酵母实验操作。
一、外源基因在酵母中的的表达(Foreign gene expression in yeast)
最常用的外源基因表达受体是大肠杆菌，然而，自然界一些物种之间存在巨大的密码子偏好差异，一些物种的基因可以在大肠杆菌中得到有效的表达，而另一些物种的基因则在大肠杆菌中表达很弱或不能表达（如某些林木类植物），在这种情况下，作为真核细胞的酵母便成为目的基因表达的首选受体细胞。泛基诺公司技术部成功地为一些林业科学研究单位表达出大量具有天然活性的蛋白质，而这些蛋白质在原核生物大肠杆菌中是不能表达的（更详细的理论和技术信息可发电子邮件到:fungenome@进行咨询）。另外，由于酵母具有易于繁殖且又无毒的特性（日常生活中用来发酵面粉和酿酒，故又称为面包酵母和啤酒酵母），因此生物技术和产业界研究人员常用酵母来表达外源基因，获得大量具有天然活性的蛋白质和经基因工程改造生产疫苗等。
பைடு நூலகம்
1991年，我在美国做博士后期间, 老板从Stanley Fields实验室获得原始材料，让我对菌株和质粒进行改造， 原始菌株是SCY90，实际上将它作为起始材料基本上没有任何用处，因为其中的标志基因已经没有选择的余地，只能从W303-1A/-1B系列或YPH499/500系列开始.。我试图从以下几个方面来改进：1）用不同的启动子序列代替单一的GAL1，并将上游激活序列用定点突变（SDM）的方法进行优化；2）用三报告基因（Ade2、His3、LacZ）替换单报告基因（LacZ）和双报告基因（LacZ，His3）。这些工作三言两语说得轻巧，可做起来却花费了我近两年的时间。要知道，我们还要将原始菌株中的编码Gal80和Gal4这两个基因敲除（注意：酵母基因敲除英文不用knock out，而是用deletion，所以中文描述应该是基因删除）。熟悉酵母分子遗传学操作的人都知道，删除酵母的某个基因时，需要在基因组中插入可供筛选的标记基因，但为了方便后续实验，即为保证最终获得的酵母报告菌株有较多的选择标记基因可用，还需要将先前插入的标记基因再删除以备后续酵母转化实验中的质粒转化选择筛选，这些工作可是非常的time consuming！另外，当时定点突变采用的方法是Uracil选择法，该法费力耗时，可不像现在所采用的Strategene的SDM法简单快捷。在我走后又过了几年，双报告基因和三报告基因就先后商业化了，如Y187和AH109等.