外源基因在酵母菌中表达讲义
外源基因在酵母体系中表达
C.albicans hyphal n.r cell wall Ag
Spinach
2
phosphoribulokinase
S/Mut+ Halaas, et al (1995)
Shiba, et al (1995)
S/Mut+
S/Mut+, S/MutS( 30,000 copies/c ell) S/MutS
fragment C
Pertusis
3
antigen P69
Mouse EGF 0.45
Aprotinin 0.8
Kunitz
1
protease
inhibitor (A-
beta-PP)
Human
4
serum
albumin(HS
A)
HIV-1
1.25
gp120
and
0.02
I/Mut+ and Muts I/Muts S/Muts S/Mut+/Muts S/Mut+
第一代酵母基因工程表达系统是以酿酒酵 母表达系统为典型代表。
第二代酵母基因工程表达系统的典型代表 就是近年来倍受关注的毕赤酵母表达系统 等为代表的甲醇酵母表达系统：
1987年Cregg等首次报道甲醇营养型毕 赤酵母(Methy1otrophic Pichia pastoris)表达 外源蛋白以来，由于它具有表达效率高， 遗传稳定，产物可分泌表达等优点，己成 为近年来极受青睐的真核基因表达系统。
S:284
ds Fv (di-sulfide-bonded n.r S/n.r Luo, et al (1995), J.
single chain antibodies) n.r
基因工程：第四章-酵母基因工程
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。
特点：
酵母菌的基因工程课件
拷贝数为50-100个，分别携带K1 K2两种能使多种酵母菌致死的毒
反向重复序列
pGKL1 8.9 kb
素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。
原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25%～ 33%。
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
7 酵母菌的基因工程
A 酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌的分类学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体
UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
生物效应
改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达
作用位点
钙离子依赖型的ATP酶 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 转录水平
基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达
c. 启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响
研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的 表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考 虑到这一因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就 近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大 量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目 的基因的表达效率。
影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素
1.目的基因的特性 2.表达框的染色体整合位点与基因拷贝数 3.宿主的甲醇利用表型 4.分泌信号 5.产物稳定性 6.翻译后修饰
பைடு நூலகம்
b. 翻译起始序列对表达效率的影响
mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结 合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是 起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就 是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密 码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和 翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位 于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体 RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。 ５’--AGGAGGUXXXAUG--- mRNA ３’AUUCCUCCACUAG----- 16S rRNA3’ 末端
构建表达载体的策略
⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列
的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。 ⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的 基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的 问题。
⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后 面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合 蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降 解，最后可以将融合多肽切除。
3. mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译 工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程； 4. 基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强 子序列存在。
第十二章 酵母基因工程-PPT精选文档
凝集素展示表达系统
酿酒酵母细胞表面展示表达系统的应用 可应用于生物催化剂体库构建、免疫检 测及亲和纯化、癌症诊断等领域。
一、酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌 (Yeast) 是一群以芽殖或裂殖方式 进行无性繁殖的单细胞真核生物。
二、酵母菌表达外源基因的优 势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚， 遗传操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。 不含特异性病毒、不产毒素，被美国 FDA 认定为安全的基因工程受体系统。
B
REP2
同源重组
• 表达载体可以有自主复制型和整合型两种。 自主复制型质粒含有ARS，不稳定，拷贝 数高。 整合型质粒不含ARS，必需整合，拷贝数低 • 糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅 1,3甘露 糖，所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位 疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。
二、甲醇营养型酵母表达系统 表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基 因一(A0x1)，甲醇为诱导物 不宜于食品等蛋白生产 巴斯德毕赤酵母 生产医药用重组蛋白质
aph
cat
dhfr
cup1
suc2
ilv2
六、利用酵母菌表达外源基因的步骤 克隆重组→ →酶切线性→ →转化→ →筛选 转化子→ →小规模诱导鉴定表达量→ →大 规模培养以及制备
七、酵母表面展示系统 即把外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因 序列融合后导入酵母细胞，利用酿酒酵母 细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定） 使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。
第十二章
酵母基因工程
1974 1978
Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导
基因工程-外源基因在酵母菌中的表达
基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。
基因工程II-外源基因的表达(ppt62)(1)
● 主要任务： 通过次级键的形成使蛋白质复性 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
复性与重折叠 ： ● 复 性：
分段稀释法 一步稀释法 试剂添加法 蛋白修饰法 产物隔离法 分子伴侣法
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
复性与重折叠 ： ● 二硫键形成
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
劣势
缺乏蛋白质的复性功能 缺乏蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解异源蛋白 胞内含多种内毒素
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因高效表达的原理
◆ 启动子
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
包涵体的溶解与变性 ： ● 主要任务：拆开错配的二硫键和次级键
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
溶解与变性 ：
清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸
● 试剂和条件：
促溶剂 盐酸胍、尿素 混合溶剂
极端pH
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 包涵体型表达
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
◆ 密码子
密码子偏爱性： 密码子偏爱性对外源基因表达的影响：
策略
外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因
（一）外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达形式
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达
化学氧化法 二硫键交换法
酵母菌质粒 讲解
酵母菌质粒酵母菌质粒是一种广泛用于酵母遗传工程的重要工具。
酵母菌质粒是由DNA分子构成的小环状结构，通常具有自主复制和表达基因的能力。
本文将对酵母菌质粒的构成、功能和应用进行讲解。
构成酵母菌质粒通常由几个部分构成：选择标记、复制起源、多克隆位点和表达元件。
选择标记选择标记是一种基因，其作用是将含有质粒的酵母细胞与不含质粒的细胞区分开来。
最常用的选择标记是抗生素抵抗基因，如能使酵母细胞对抗生素耐受的抗药性基因。
复制起源复制起源是质粒进行自主复制的启动点。
酵母菌质粒通常包含一段可以被酵母细胞复制机制所识别的特定序列，确保在细胞分裂过程中能够被复制并传递给下一代细胞。
多克隆位点多克隆位点是酵母菌质粒上的特定位点，用于插入外源DNA片段。
这些位点通常由特定的限制酶切位点组成，使得外源DNA片段可以被切割并连接到质粒上。
常见的多克隆位点有pUC19、pBluescript等。
表达元件表达元件包括启动子、转录终止信号和编码蛋白质的基因。
启动子是DNA上的一个区域，能够在酵母细胞内转录蛋白质基因。
转录终止信号是终止转录的信号序列。
基因则根据所需的表达蛋白质进行选择，并插入到酵母菌质粒的适当位点上。
功能和应用酵母菌质粒在酵母遗传工程中具有广泛的功能和应用。
以下列举了其中的几个重要应用：基因克隆和表达酵母菌质粒作为克隆载体，可以用于插入、克隆和表达各种外源DNA片段。
通过在菌体内表达目标蛋白质，可以研究其功能、相互作用和调控机制。
此外，酵母菌质粒还可以用于制备大量纯化的蛋白质，用于进一步的研究和应用。
逆向遗传学酵母菌质粒是逆向遗传学的重要工具之一。
通过插入外源DNA片段或干扰特定基因，可以研究特定基因的功能和作用机制。
逆向遗传学可以帮助研究者确定基因的功能和互作网络，从而更深入地理解生物体的生物学过程。
药物筛选和基因组工程酵母菌质粒还可以用于药物筛选和基因组工程。
例如，可以构建酵母菌质粒表达库，用于高通量筛选具有特定功能的化合物。
将目的基因导入酵母菌的方法
将目的基因导入酵母菌的方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：将目的基因导入酵母菌是一种常见的实验技术，可以用于基因工程、生物学研究和生物技术应用等领域。
以下是关于将目的基因导入酵母菌的方法的详细介绍。
一、介绍酵母菌是一种常见的真菌，广泛应用于食品发酵、生物燃料生产和药物生产等领域。
将外源基因导入酵母菌可以改变其代谢特性、增强其生产能力，从而扩大其应用范围。
下面将介绍将目的基因导入酵母菌的方法。
二、选择适当的表达载体在将目的基因导入酵母菌之前，首先需要选择一个适当的表达载体。
常用的表达载体有质粒、病毒、质粒体等。
质粒是最常用的表达载体，因为它具有较强的载体稳定性和易于操作的特点。
还需要考虑选择适当的启动子、选择子和标记基因等。
三、构建目的基因载体构建目的基因载体是将目的基因插入到选择的载体中，以便将其导入酵母菌。
首先需要将目的基因进行PCR扩增，获得目的基因的DNA序列。
然后，将目的基因与载体进行连接，可以通过酶切和连接、PCR扩增等方法进行。
最终构建出目的基因载体。
四、转化酵母菌转化是将构建好的目的基因载体导入酵母菌的过程。
目前常用的转化方法有质粒转化、电穿孔法、化学转化、凝血作用等。
质粒转化是最为常用的方法。
质粒转化的步骤主要包括酵母菌细胞的预处理、质粒的导入和细胞的再生。
五、筛选阳性转化子在转化酵母菌后，需要进行阳性转化子的筛选。
阳性转化子是指成功导入了目的基因的酵母菌细胞。
常用的筛选方法有抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、基因荧光标记筛选等。
通过有效的筛选方法，可以获得目的基因成功导入的阳性转化子。
六、验证目的基因的表达最后一步是验证目的基因在酵母菌中的表达情况。
可以通过RT-PCR、Western blot等方法来检测目的基因的表达水平。
验证表达成功后，即可进行后续的实验和应用。
在将目的基因导入酵母菌的过程中，需要注意以下几个方面的问题：1. 酵母菌细胞的处理条件，包括培养基的配制、细胞密度的控制等。
外源基因在酵母体系中表达90页文档
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
外源基因在酵母菌中的表达
酵母菌的载体系统
• 酵母菌克隆表达质粒的构建 • 酵母菌中的野生型质粒
酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的2μ环状质粒 几乎所有的酿酒酵母中都含有2μ双 链环状质粒，拷贝数达50至100 个。 • IRs 反向重复序列，600 bp，重组 • FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 • REP 编码产物控制质粒的稳定性 • STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1，以 及克鲁维酵母属中的pKD1等均与 2μ质粒类似。
显性标记基因
酵母菌的表达系统
• 外源基因在酵母菌中表达的限制因素 • 酵母菌启动子的可控性 • 酵母菌表达系统的选择
酵母菌启动子的可控性
超诱导型启动子 酿酒酵母的半乳 糖利用酶系由 GAL1 GAL7和GAL10 基因编码
外源基因在酵母菌中表达的限制因素
• 外源基因稳态mRNA的浓度 • 外源基因mRNA的翻译活性 • 酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油 醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶 PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的 氨基酸是由25个密码子编码的
用于转化子筛பைடு நூலகம்的标记基因
营养缺陷型的互补基因 • 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有 营养缺陷型互补基因和显性基因两大类 • 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷 酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、 LYS、URA、ADE • 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型 的受体非常困难
用于转化子筛选的标记基因
酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
酵母菌表达外源基因的优势
• 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简 便 • 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 • 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 • 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 • 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全 的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） • 酵母菌是最简单的真核模式生物
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酵母菌的宿主系统
• • • • 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： • 酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） • 克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） • 毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） • 裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharoyces pombe） • 汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯 德毕赤酵母表达外源基因最理想。
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母 • UBI 4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突 变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株 要低得多，因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的 受体 • UBA 1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但 其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的 蛋白降解 • Ubc4 - ubc5 双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法 • 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的 原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化 细胞可达原生质体总数的1-2%。 • 但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质 再生率的严重制约 • 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细 胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的 原生质体占转化子总数的25-33%
乙型肝炎病毒的结构与性质
乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因
乙型肝炎病毒的结构与性质
传统乙肝疫苗的制备 • 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖， 因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的 肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜 来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于 原材料的限制难以大规模产业化。
酵母菌表达系统的选择
乳酸克鲁维酵母表达系统 • 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被 广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳 定性载体，即便在无选择压力的条件下， 也能稳定遗传40代以上。 • 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的 重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。
酵母菌表达系统的选择
巴斯德毕赤酵母表达系统 • 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的 甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途 径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇 氧化酶基因AOX11所属强启动子、表达的可诱导 性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。 • 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体， 所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色 体DNA上。在此情况下，外源基因的高效表达在 很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵 母系统中获得成功表达。
转化质粒在酵母细胞中的命运
• 单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是 双链的10-30倍； • 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转 化为双链并复制； • 不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同 源整合入染色体,这对于体内定点突变酵母基因组 极为有利； • 克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受 体细胞的染色体DNA的同源序列，会发生高频同 源整合，整合子占转化子总数的50-80%。
பைடு நூலகம்
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 • 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+ 等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸 收质粒DNA，而且具有下列特性：
• 吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相 差80倍 • 共转化现象极为罕见
酵母菌的转化程序
酵母菌电击转化法 • 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条 件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免 使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大 的负作用。 • 电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗 传特征及培养条件适用范围广，而且转化 率可高达105 / μgDNA。
酵母菌中的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线状质粒pKL1和 pKL1,拷贝数为50-100个，分别携带K1K2两种能使多种酵母 菌致死的毒反向重复序列素蛋白编码基因（αβγ），同时含 有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRpp质粒的构建 • ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染 色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自 主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、 提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。 以ARS为复制子的质粒称为YRp 以22μ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp • 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达 200个，但培养几代后，质粒的丢失率高达50%70%，主要是由于分配不均匀所致。
酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统 • 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活 性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷 酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属 的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 • 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能 力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等） 与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺 陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧 链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质 的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外 侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有蛋白质的 糖基化系统，但野生型酿 酒酵母对异源蛋白的糖基 化反应很难控制，呈超糖 基化倾向，因此超糖基化 缺陷株非常重要。
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
• 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA 特定序列和标记基因， • 构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒 通常插在染色体DNA特定序列中，这样目 的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色 体DNA区域.
酵母菌的转化系统
• 转化质粒在酵母细胞中的命运 • 酵母菌的转化程序 • 用于转化子筛选的标记基因
酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
酵母菌表达外源基因的优势
• 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简 便 • 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 • 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 • 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 • 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全 的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） • 酵母菌是最简单的真核模式生物
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因 酵母菌共有四个泛素编码基因 • UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期 表达稳定期关闭 • UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期 表达稳定期关闭 • UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期 表达稳定期关闭 • UBI 4 编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达 酵母菌共有七个泛素连接酶基因： • UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、 UBC 7
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建 • CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀 分配有关的序列 • 将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的 新载体称为YCp • YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷 贝数只有1 - 5个 • 含有TELL的YAC质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
用于转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因 • 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有 营养缺陷型互补基因和显性基因两大类 • 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷 酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、 LYS、URA、ADE • 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型 的受体非常困难
用于转化子筛选的标记基因
酵母菌表达系统的选择
多型汉逊酵母表达系统 • 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制 序列HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， 但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞 有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是， HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体 DNA上，甚至可以连续整合100多个拷贝 • 目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋 白在该系统中获得成功表达。 ，因此重组多型汉 逊酵母的构建也是采取整合的策略。
显性标记基因
酵母菌的表达系统
• 外源基因在酵母菌中表达的限制因素 • 酵母菌启动子的可控性 • 酵母菌表达系统的选择
酵母菌启动子的可控性
超诱导型启动子 酿酒酵母的半乳 糖利用酶系由 GAL1 GAL7和GAL10 基因编码
外源基因在酵母菌中表达的限制因素
• 外源基因稳态mRNA的浓度 • 外源基因mRNA的翻译活性 • 酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油 醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶 PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的 氨基酸是由25个密码子编码的
利用重组酵母生产乙肝疫苗
• 乙型肝炎病毒的结构与性质 • 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 • 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
乙型肝炎病毒的结构与性质
• 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具 有感染力的病毒； • 乙型肝炎病毒的结构颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要结构蛋 白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽， 它具有糖基化和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋 白成份包括核心抗原（ HBcAg ）和病毒DNA聚 合酶、微量病毒蛋白； • 除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成 并释放大量的22nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原 性是未装配的各种包装蛋白组份的1000倍。包装 蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。