第七章 外源基因表达系统张幻灯片

*
17
②周质中表达 • 周质（periplasm)—大肠杆菌一类格兰氏
阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞 结构 • 表达于细胞质中的蛋白，借助信号肽穿过 细胞内膜到达周质
*
Байду номын сангаас
18
优点： • 蛋白种类少，易纯化 • 酶解程度低 • 促进二硫键的形成和蛋白质的折叠 • 蛋白质N-端真实性 缺点： • 转运的效率不稳定
*
10
化学诱导与温度诱导在实验室 规模比较容易做到，（发酵罐1～5 升）。但在工业化生产时（发酵罐 数十升～数百升乃至数千升），生 产成本很高。
*
11
为解决此问题，可对工程菌进行改造。
例如：采用双质粒表达系统 将CI 857阻遏
蛋白编码基因置于Ptrp启动子之下，克隆在
一个低表达质粒上，从而保证阻遏蛋白表达
包涵体（inclusion body):细胞质中不溶性 的蛋白质聚集形成的颗粒。
*
15
• 优点： 形成包涵体，易于纯化分离，抵抗细菌蛋 白酶的水解；对寄主无毒害
• 蛋白质产量高 • 表达载体构建比较简单
*
16
缺点： • 形成包涵体的外源蛋白质，一般没有生物活性
。恢复生物学活性的过程，有时非常困难。活 性蛋白质的终产量低。 • 细胞质还原的环境不利于形成二硫键 • N-末端存在甲硫氨酸，蛋白质真实性受影响 • 蛋白质种类多，纯化工作量比较大。
在真核基因中发现了类似Pribnow框的 共同序列，即位于—25～—30 bp处的 TATAAAAG，也称TATA框(TATAbox)。
*
6
常用的大肠杆菌启动子
• Plac 来源于乳糖操纵子 • Ptrp 来源于色氨酸操纵子 • PL 来源于λ噬菌体早期操纵子 • PrecA 来源于recA基因
*
有 Lac 、trp、tac、T7、λPL等。
• 强启动子 外源蛋白质的表达占菌体总蛋
白质的10-30％。
*
5
启动子有关知识
• 大肠杆菌的启动子是控制外源基因转录的 重要元件，基因表达程度与启动子的强弱 密切相关。
• 启动子的强弱主要取决于
启动子本身的序列，尤其是－10区 (TATAA)和－35区(TTGACA)的组成。
*
26
分泌表达形式的缺点：
相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋 白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难 在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因 即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体 方式低很多。
*
2
第一节 大肠杆菌表达系统
一.大肠杆菌表达体系的优点：
•外源基因可以高水平表达 •培养方便、价廉、可大规模生产 •生物学、遗传学背景清楚 • 安全性好 • 寄主菌株及载体较多
*
3
大肠杆菌
*
4
二.大肠杆菌的表达条件
• 克隆的真核基因必须连续，无内含子序列。
• 大肠杆菌不能识别真核启动子，外源基因须 置于原核启动子的控制之下。常用的启动子
7
启动子的可控性
目前使用的大肠杆菌启动子，一般含 有与阻遏蛋白特异性结合的序列，因此由 这些启动子介导的外源基因在大肠杆菌细 胞内通常是痕量表达的。例如在不含乳糖 的培养基内， Plac 启动子处于阻遏状态， 外源基因极少表达。
*
8
• 当重组大肠杆菌生长到某一阶段，向培养 物中加入乳糖或IPTG（异丙基硫代半乳糖 苷 isopropylthiogalactoside，IPTG),它 们特异性的与阻遏蛋白结合，使之从操纵 子上脱落下来，启动子打开并启动外源基 因转录。（化学诱导）
*
19
③ 表达产物分泌到细胞外 • 诱导大肠杆菌细胞分泌外源蛋白质 • 利用信号肽； • 融合蛋白配体； • 透化剂；
*
20
蛋白质合成后的靶向输送
•蛋白质的靶向输送(protein targeting)
蛋白质合成后需要经过复杂机制，定 向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部 位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。
*
9
温度诱导
PL启动子 将工程菌先置于300Ｃ进行培养， 在此温度范围内，由大肠杆菌合成的CI 857阻遏蛋白与PL 的操纵子区域结合，关 闭外源基因的转录。当工程菌培养到合适 的生长阶段，（一般为对数生长中期）时 ，迅速将培养温度提高到42 0Ｃ，此时CI 857失活，从操纵子上脱落下来， PL启动 子遂启动外源基因转录。
第七章 外源基因表达系 统张幻灯片
2020年4月23日星期四
基因工程所用的宿主菌,皆经过人工改造
原因是 野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统, 会切割未经修饰的外源DNA.
经过改造的宿主菌一般具备下列特点 限制系统缺陷型:不切割外源DNA. 重组缺陷型 :避免外源DNA与宿主DNA的重组. 转化亲和型:改变细胞壁的通透性,提高转化效率.
信号假说：分泌型蛋白质的定向输送，就是
靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP） 识别并特异结合，然后再通过SRP与膜上的对 接蛋白（DP， 即SRP受体）结合后→开放膜 蛋白通道→分泌性蛋白穿过膜→膜外侧面信 号肽酶切断信号肽加工区。
信号肽的一级结构
优点：
• 酶解作用低 • 纯化方便 • 增进蛋白折叠 • N-端的结构真实
*
13
原核表达存在的问题 翻译后的加工修饰 真核细胞的某些蛋白质翻译合成后，还 需要加工和修饰，如糖基化，但大肠杆菌 细胞无此功能。 细菌蛋白酶的存在 细菌蛋白酶对外源蛋白质的切割
*
14
真核基因在大肠杆菌 细胞中表达的部位
1.表达产物存在的部位
①细胞质；②细胞周质；③分泌到细胞外
① 细胞质中表达：
较低；第二个重组质粒则含有PL启动子控制 的目的基因。当培养基中缺少色氨酸时，
Ptrp打开， CI 857 阻遏蛋白生成，由PL介导 的目的基因不表达；相反，当色氨酸大量存
在时， Ptrp启动子关闭， CI 阻遏蛋白不再
生成， PL开放。
*
12
此工程菌可用糖蜜和酪蛋白水解物组 成的廉价培养基进行发酵，内含微量的色 氨酸，欲使外源基因表达时，可加入富含 色氨酸的胰蛋白胨进行诱导。
• 信号序列(signal sequence)
所有靶向输送的蛋白质结构中存在分 选信号，主要为N末端特异氨基酸序列， 可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位 ，这一序列称为信号序列 。
常见的信号序列由10～40个氨基酸残基 组成，N端为带正电荷的氨基酸残基，中间为 疏水的核心区，而C端由小分子氨基酸残基组 成（加工区），可被信号肽酶识别并裂解。 •