大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统总结
随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。

表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。

大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。

大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。

据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。

与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。

常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。

该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。

大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。

宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。

其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。

表达载体也是影响外源基因表达的重要因素，它是表达系统中最关键的元件，包括启动子、目的基因、抗性基因和终止子等，表达载体需具有高拷贝数、产量高、应用范围广、表达产物易纯化及稳定性好等特点，应用在大肠杆菌中的载体包括融合表达型载体、分泌型表达载体和共表达载体等，常用的表达载体为pET、pUC、pSC、
pPBB、pBV220、 pRK1、pRLK14等，常用的启动子有Ptrp、 Ppho、PL、PR、Ptac、Plac、T7 噬菌体启动子、 trp-lac 杂合启动子等。

高效表达系统建立后就需进行高密度发酵。

大肠杆菌高密度发酵是目前发酵工业的研究热点之一，影响高密度发酵的因素除了高效表达系统外，还需要适配性的工艺。

适配性工艺包括：培养基组分，温度、pH值和溶氧控制，诱导和补料策略等，可有效提高菌浓和单位菌体产量。

首先是培养基成分，大肠杆菌表达所需的培养基成分有碳源、氮源和无机盐，碳源是优化的关键，常用的碳源包括糖类、油脂、低碳醇和有机酸等。

葡萄糖虽然是廉价且易用的碳源，也是高密度表达最常用的碳源，但高浓度葡萄糖会导致菌体生长旺盛并加速乙酸积累，进而抑制生长和合成。

利用甘油作为碳源不会导致生长过于旺盛和乙酸的大量积累，有利于菌体生长和蛋白表达。

氮源是培养基中另一种关键营养因素，包括有机氮源和无机氮源，选择合适的氮源有利于菌体生长和蛋白表达。

除了选择最优的碳源和氮源，合适的碳氮比也是影响高密度发酵的重要因素，不同的碳氮比情况下菌体生长和蛋白表达存在差异。

另外，微量因素、无机盐浓度也会影响蛋白表达。

其次是发酵条件控制，包括：溶氧、温度、pH。

高密度发酵过程中溶氧是非常关键的因素，其影响发酵过程中质粒稳定性和乙酸生成，当溶氧浓度低于5%时，质粒会快速丢失，溶解氧浓度需维持在30%-40%。

除了溶氧，不同的重组蛋白和高密度发酵不同阶段对温度要求不同，需根据蛋白性质、质粒性质和菌体状态等调整温度。

此外维持合适的pH 也有利于蛋白表达。

补料策略也是高密度发酵的关键因素，大肠杆菌高密度发酵过程中常用的补料策略有恒速流加、梯度流加、指数流加3种非反馈补料和根据溶解氧、pH值和CER的反馈补料，根据菌体生长速率、底物消耗速率、产物生成速率、有害物积累速率和质粒稳定性选择合理的补料策略是高密度发酵的关键。

通过补料策略控制菌体比生长速率是影响高密度培养的重要因素，因为不同比生长速率会影响菌体生长和蛋白表达，较高比生长速率可能引起质粒丢失。

最后，诱导剂的种类和浓度、诱导的时间选择也影响菌体生长和蛋白表达，需根据实际情况选择合适的诱导条件。

大肠感觉工业发酵过程中采用的诱导方式主要包括包括营养源诱导、温度诱导、丙基硫代半乳糖苷（IPTG）和乳糖诱导。

产业化规模应用的大肠杆菌绝大多数为IPTG诱导型，但由于IPTG对细胞具有毒害作用、价格较贵并增加纯化的难度，在大规模发酵时一般采用乳糖代替。

利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白是目前行业研究的热点，具有巨大的优越性的同时存在部分问题。

首先，大部分表达的重组蛋白存在于细胞质中，易被大肠杆菌内源性蛋白酶降解，导致表达量低；其次，部分重组蛋白虽然可形成包涵体而避免被降解，同时分离纯化方便且效率高，但复性难；最后，可分泌至细胞周质或细胞培养液中的重组蛋白同时具有分离纯化简单和避免被降解的优点，但由于细胞周质空间较小且重组蛋白不能跨膜转运，表达量较低。

另外，噬菌体也是影响大肠杆菌表达系统的关键因素。

综上所述，大肠杆菌表达系统相较于其它表达系统具有简单、快速、成本低、产量高等众多优点，已广泛应用于多种生物制品和化学品的商业生产中；但其在表达不同产品时，需匹配适配性的工艺，对发酵过程中的温度、pH、溶氧和诱导条件等关键因素进行优化，进而达到产量最大化和成本最低化。

最后，大肠杆菌表达系统存在表达量低、复性难和噬菌体污染等问题，需进一步优化解决。