第七章 外源基因表达系统

1.SV40病毒载体
• SV40：猿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus 40, SV40)
环型双链DNA分子，含5243bp。
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重组的病毒-质粒载体
• 含有完整的早期区段和复制起点的病毒-质 粒载体： 病毒的早期区段和复制起点+大肠杆菌的 质粒分子重组而成。 例如：pC10＝早期区段和复制起点（多瘤 病毒）＋质粒pBR322 这种载体既可在大肠杆菌中复制，也可在 哺乳动物细胞中复制，称之为穿梭载体。
细菌蛋白酶对外源蛋白质的切割
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真核基因在大肠杆菌 细胞中的表达
1.表达产物存在的部位 ①细胞质；②细胞周质；③分泌到细胞外
① 细胞质中表达：
包涵体（inclusion body):细胞质中不溶性的 蛋白质聚集形成的颗粒。
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• 优点： 形成包涵体，易于纯化分离，抵抗细菌蛋 白酶的水解；对寄主无毒害 • 蛋白质产量高 • 表达载体构建比较简单
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缺点： 恢复生物学活性的过程，有时非常困难。活性
蛋白质的终产量低。
• 形成包涵体的外源蛋白质，一般没有生物活性。
• 细胞质还原的环境不利于形成二硫键
• N-末端存在甲硫氨酸，蛋白质真实性受影响
• 蛋白质种类多，纯化工作量比较大。
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②周质中表达 • 周质（periplasm)—大肠杆菌一类格兰氏阴 性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结
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家蚕表达系统
• 家蚕属于鳞翅目家蚕科，人类饲养家蚕已
有5000余年历史。我国是家蚕业的发祥地， 自古以来农桑并茂，丝绸之路名扬天下。 我国的生丝产量占世界总产量的70％，丝 绸业的年产值达700亿元。
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我国科学家于2003年率先完成家蚕基
因组框架图，覆盖率和精确度分别达到
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化学诱导与温度诱导在实验室 规模比较容易做到，（发酵罐1～5
升）。但在工业化生产时（发酵罐
数十升～数百升乃至数千升），生
产成本很高。
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为解决此问题，可对工程菌进行改造。
例如：采用双质粒表达系统 将CI 857阻 遏蛋白编码基因置于Ptrp启动子之下，克隆 在一个低表达质粒上，从而保证阻遏蛋白 表达较低；第二个重组质粒则含有PL启动 子控制的目的基因。当培养基中缺少色氨 酸时， Ptrp打开， CI 857 阻遏蛋白生成， 由PL介导的目的基因不表达；相反，当色 氨酸大量存在时， Ptrp启动子关闭， CI 阻 遏蛋白不再生成， PL开放。
牛溶菌酶； 乙肝表面抗原； 链激酶； 人肿瘤坏死因子； 人表皮生长因子； 人组织纤溶酶原活化剂； 破伤风毒素片段C；
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应用举例
乳酸克鲁维酵母
牛凝乳酶；人白细胞介素1β ； α －半乳糖苷酶 多型汉逊酵母 乙肝表面抗原 葡萄糖淀粉酶
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α －半乳糖苷酶
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第三节 昆虫细胞表达系统
温度诱导
PL启动子 将工程菌先置于300Ｃ进行培养， 在此温度范围内，由大肠杆菌合成的CI 857 阻遏蛋白与PL 的操纵子区域结合，关闭外 源基因的转录。当工程菌培养到合适的生 长阶段，（一般为对数生长中期）时，迅 速将培养温度提高到42 0Ｃ，此时CI 857失 活，从操纵子上脱落下来， PL启动子遂启 动外源基因转录。
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短小芽孢杆菌表达蛋白质
• 例1：表达白细胞介素－2，表达产物无需 复性处理，即具有生物活性。产率达 50mg/L。 • 例2：表达人表皮生长因子（EGF），产率 达1g/L以上。 澳大利亚盛产羊毛，每年需要大批的剪羊 毛的技工，由于EGF可引起羊毛从根部自 行脱落，故每只羊注射5mgEGF，在1月后 可用手直接抓下羊毛。
昆虫属于动物界节肢动物门昆虫纲，其
发育过程以变态而著称。 昆虫是地球上分布最广、数量最多的动 物，有上百万种。 用于表达外源基因的多为家蚕系统。
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昆虫表达系统 昆虫是高等真核生物,能进行翻译后加 工和修饰. 昆虫细胞常用于真核蛋白质的生 产.其生长速度快,不需要CO2培养箱,易于悬 浮培养,可用于大规模表达蛋白质.
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利用梭菌属嗜热菌株 由纤维素生产乙醇
• 纤维素是由葡萄糖单体以β －1，4－糖苷
键连接的多糖，利用梭菌属嗜热菌株可由 纤维素直接发酵生产乙醇。利用基因工程 技术改造菌株，增加乙醇的产率，降低副 产物（如乙酸、丁酸等）。
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第二节 酵母菌表达体系
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第四节 哺乳类细胞表达系统
优点：哺乳动物细胞可加工修饰表达的蛋白质，
包括二硫键的形成、糖基化、磷酸化、寡聚体
的形成、蛋白酶的定点切割产生具有天然活性
的蛋白质
缺点：细胞生长缓慢，培养周期长；
生产成本高；
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常用的哺乳动物表达细胞
• CHO细胞 中国仓鼠卵巢上皮细胞，是一株
源基因极少表达。
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• 当重组大肠杆菌生长到某一阶段，向培养
物中加入乳糖或IPTG（异丙基硫代半乳糖
苷 isopropylthiogalactoside，IPTG),它们特
异性的与阻遏蛋白结合，使之从操纵子上
脱落下来，启动子打开并启动外源基因转 录。（化学诱导）
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优点：
• • • • 酶解作用低 纯化方便 增进蛋白折叠 N-端的结构真实
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分泌表达形式的缺点：
相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋 白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很 难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源 基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比 包涵体方式低很多。
• 强启动子 外源蛋白质的表达占菌体总蛋
白质的10-30％。
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启动子有关知识
• 大肠杆菌的启动子是控制外源基因转录的 重要元件，基因表达程度与启动子的强弱 密切相关。 • 启动子的强弱主要取决于 启动子本身的序列，尤其是－10区 (TATAA)和－35区(TTGACA)的组成。 在真核基因中发现了类似Pribnow框的 共同序列，即位于—25～—30 bp处的 TATAAAAG，也称TATA框(TATAbox)。
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第一节 大肠杆菌表达系统
一.大肠杆菌表达体系的优点：
•外源基因可以高水平表达 •培养方便、价廉、可大规模生产 •生物学、遗传学背景清楚 • 安全性好
• 寄主菌株及载体较多
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大肠杆菌
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二.大肠杆菌的表达条件
• 克隆的真核基因必须连续，无内含子序列。 • 大肠杆菌不能识别真核启动子，外源基因须置 于原核启动子的控制之下。常用的启动子有 Lac 、trp、tac、T7、λPL等。
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• 从2000年以后，哺乳动物细胞表达系统更 受重视。目前，美国418种在研药物中约 70%是以哺乳动物细胞表达的。在FDA已 批准上市的生物技术药物中，哺乳动物细 胞表达的产品占70%以上。
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一.用于哺乳动物细胞表达的载体
• 病毒载体： （1）含有能够被真核细胞识别的有效启 动子 （2）在感染周期中能够持续复制，达到很 高的拷贝数。 （3）控制自己复制的元件 （4）有些载体可高效稳定地整合到寄主基 因组上 （5）外壳蛋白识别细胞受体，可将外源基 因高效导入受体细胞。 2013-7-24 48
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• 表达量高，数百mg/L以上水平
• 表达的蛋白既可存在于细胞，又可分泌到 胞外。由于甲醇酵母自身分泌的蛋白（背 景蛋白）非常少，十分有利于纯化。
• 糖基化程度低。
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多型汉逊酵母表达系统
• 已用于表达乙肝表面抗原
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3.应用举例
毕赤酵母
95.54和99.95，是我国科学家向人类社会 贡献的第三大基因组研究成果。
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• 家蚕的特点是丝素蛋白的高效表达。蚕丝
的主要成分是丝素蛋白。在家蚕的丝素蛋 白合成期，每个细胞每秒合成数万个丝素 分子。
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杆状病毒载体
• 杆状病毒是含有包膜的双链DNA病毒，宿 主为无脊椎动物。主要感染昆虫，包括鳞 翅目、膜翅目、鞘翅目、毛翅目等。 杆状病毒表达载体可分为两大类： 1.表达单个外源基因 2.表达多个外源基因
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常用的大肠杆菌启动子
• Plac
• Ptrp
来源于乳糖操纵子
来源于色氨酸操纵子
• PL
• PrecA
来源于λ噬菌体早期操纵子
来源于recA基因
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启动子的可控性
目前使用的大肠杆菌启动子，一般含有 与阻遏蛋白特异性结合的序列，因此由这 些启动子介导的外源基因在大肠杆菌细胞 内通常是痕量表达的。例如在不含乳糖的 培养基内， Plac 启动子处于阻遏状态，外
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酵母菌的种类
• 酵母菌（Yeast） 有56个属500多个种组成。 如果说大肠杆菌是最成熟的原核表达系统， 则酵母菌是最成熟的真核表达系统。 常用的有： 酵母属（如酿酒酵母） 毕赤酵母属（如巴斯德毕赤酵母属） 裂殖酵母属（如非洲酒裂殖酵母）