microRNA技术介绍
microrna研究思路
microrna研究思路引言：随着生物技术的发展，人们对于微小RNA（microRNA）的研究越来越深入。
微小RNA是一类非编码RNA分子，具有调控基因表达的重要功能。
本文将介绍微小RNA研究的思路和方法，以期更好地理解其在生物学中的作用。
一、鉴定与筛选微小RNA：鉴定和筛选微小RNA是研究的第一步。
目前，常用的方法有基于高通量测序的全基因组鉴定以及生物信息学分析。
首先，通过提取RNA样本，利用高通量测序技术获得大量的RNA序列信息。
然后，利用生物信息学分析工具对测序数据进行处理和比对，筛选出具有典型微小RNA特征的序列。
二、微小RNA的功能研究：微小RNA的功能研究是微小RNA研究的重点之一。
通过实验室内外的功能研究，可以揭示微小RNA在基因调控中的具体作用机制。
常用的研究方法有：靶标预测、基因敲除、转染和转基因动物模型等。
首先，通过生物信息学方法预测出微小RNA的靶标基因。
然后，利用基因敲除技术或转染技术使微小RNA的表达发生变化，观察靶标基因的表达水平变化。
最后，利用转基因动物模型验证微小RNA对于生物体内的调控作用。
三、微小RNA与疾病的关联研究：微小RNA在多种疾病中发挥重要的调控作用，因此，研究微小RNA与疾病的关联关系对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
常用的研究方法有：疾病相关基因的筛选、微小RNA表达谱的分析以及功能研究等。
首先，通过大量的临床样本和生物信息学分析，筛选出与疾病相关的基因。
然后，通过微小RNA表达谱的分析，寻找与疾病相关的微小RNA。
最后，通过功能研究，揭示微小RNA 在疾病发生发展中的作用机制。
四、微小RNA的应用前景：微小RNA的研究不仅可以增进对基因调控的理解，还具有广泛的应用前景。
微小RNA可以作为潜在的生物标志物用于疾病的早期诊断和预后评估。
此外，微小RNA还可以作为潜在的治疗靶点，通过调控微小RNA的表达来治疗相关疾病。
目前，已经有一些微小RNA药物进入了临床试验阶段。
microrna 5’加接头原理
一、微小RNA的概念和作用微小RNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA分子，主要通过靶向特定mRNA分子来调控基因表达。
在细胞内的功能方面，miRNA参与了许多生物学过程，包括细胞增殖、分化和凋亡等。
对于miRNA的研究不仅为我们深入了解基因调控提供了新的视角，同时也为相关疾病的诊断和治疗提供了新的思路。
二、miRNA 5’加接头的概念和作用miRNA的5’加接头是指miRNA分子在转录后会在5’端连接一个独特的序列，这个序列通常被称为5’接头。
在miRNA的成熟过程中，这个5’接头扮演着至关重要的角色，它不仅可以保护miRNA分子不被降解，同时也可以帮助miRNA与靶mRNA结合，从而发挥调控基因表达的作用。
三、miRNA 5’加接头的原理miRNA 5’加接头的原理主要包括以下几个环节：1. miRNA的转录：miRNA首先会在细胞中通过基因转录的方式合成成为一段长的前体miRNA，该前体miRNA会进一步被酶切成为长度约为70-100个核苷酸的小分子；2. miRNA的修饰：在miRNA的成熟过程中，miRNA的5’端会连接上一段特定的序列，这个序列即为5’加接头；3. 5’加接头的功能：miRNA 5’加接头的添加不仅可以保护miRNA 分子，同时也可以为miRNA与RISC（RNA诱导靶向RNA降解复合体）的结合提供必要条件。
四、miRNA 5’加接头在研究中的应用miRNA 5’加接头在miRNA研究中起着至关重要的作用，它不仅可以帮助我们更加深入地了解miRNA在基因调控中的作用机制，同时还可以为miRNA的定量和检测提供重要技术支持。
在miRNA疾病的诊断和治疗中，miRNA 5’加接头也被广泛应用，比如在miRNA药物的设计和开发中，5’加接头的改造可以帮助提高miRNA的稳定性和靶向性。
五、miRNA 5’加接头技术的发展和挑战随着对miRNA的深入研究，miRNA 5’加接头技术也在不断地发展和完善中。
微小RNA (microRNA, miRNA)
内容
➢什么是microRNA ➢microRNA的加工过程与作用 ➢microRNA在疾病检测与治疗中的应用
微小RNA (microRNA)
~22 nt的内源性的单链小分子RNA
Bartel, 2018, Cell
发现历程
Bushati and Cohen,2007, Annu. Rev. Cell Dev. Biol
发现历程
➢ 271 organisms ➢ 38 589 hairpin precursors ➢ 48 860 mature microRNAs
Kozomara, et al., 2019, Nucleic Acids Research
二、microRNA的加工与作用
miRNA
的 加 工
Williams, 2008, Cell. Mol. Life Sci
酶消化
酶消化
冻融
酸碱
Chen et al., 2008, Cell Research
microRNAs 表达随疾病发生变化
血清
正常 肺癌 血细胞 血清
Chen et al., 2008, Cell Research
microRNA用于疾病诊断
miR-122的抑制剂（anti-miR-122） 用于丙肝治疗
miRNA的作用
Bartel, 2004, Cell; BaNA也能上调基因表达
He et al., 2016, PNAS
三、microRNA用于疾病诊断
血浆microRNAs
Chen et al., 2008, Cell Research
血浆microRNAs很稳定
酶Drosha切割后成为Pre-miRNA, 随后通过 Exportin运输到细胞质，最终经核酸酶Dicer切割 后并分离为单链的miRNA ➢ miRNA常通过抑制翻译或降解信使RNA而抑制基 因表达，特殊条件下也能激活基因表达 ➢ 血清中存在miRNA，并可用于疾病诊断与治疗
microRNA知识大全
microRNA知识大全microRNA知识大全MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer 酶加工后生成。
其在细胞内具有多种重要的调节作用。
每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。
这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。
随着miRNA调控基因表达的研究的逐步深入，将帮助我们理解高等真核生物的基因组的复杂性和复杂的基因表达调控网络。
miRNA广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。
成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基。
编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体(pre-miRNA)并经过Dicer 酶加工后生成。
成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3′端羟基则是它与相同长度的功能RNA 降解片段的区分标志。
miRNA 5'端第一个碱基对U(尿苷)有强烈的倾向性，而对G却排斥，但第二到第四个碱基缺乏U。
一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。
这些分子能够与那些和它的序列互补的mRNA分子相结合，有时候甚至可以与特定的DNA片断结合。
这种结合的结果就是导致基因的沉默。
这种方式是身体调节基因表达的一个重要策略。
据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。
microRNA - 形式1 . pre-miRNA约70bp含microRNA茎环结构的pre-miRNA。
制备方式：化学合成、生物转录合成、pre-miRNA质粒表达载体、pre-miRNA病毒。
2. pri-miRNA天然pri-miRNA从染色体基因文库中调取300bp-1000bp完整的microRNA基因，克隆到质粒载体(普通载体或病毒载体)，以强大的CMV启动子操纵该300bp-1000bp microRNA。
MicroRNA研究概况以及MicroRNA芯片技术简述MicroRNA的研究
MicroRNA 研究概况以及MicroRNA 芯片技术简述一、MicroRNA 的研究概况1.MicroRNAMicroRNA（miRNA , miR）是由约21-25个核苷酸组成的分子，microRNA 通过抑制mRNA 的翻译或者促进其降解而起到负性调控的作用。
最初miRNA 的功能在植物学、癌症、病毒性感染和发育生物学中得到了验证。
但最近的研究发现，患有心脏疾病的小鼠对照正常状态miRNAs 失调，并且在肥大的心脏中也检测到了数种miRNA 的上调或者下调，同时体外实验也证实了它们对心肌细胞形态的影响。
2.MicroRNA 的研究进展miRNA现象的最早报道是在佃80年的Genetics和Cell上。
佃93年在线虫中发现的lin-4 是第一个被确定的miRNA [31]，它的基因产物是21 个核苷酸的RNA 分子并且部分序列互补于lin-14 mRNA的3' UTR区域。
这些互补序列使lin-4间断地与lin-14 mRNA结合。
奇怪的是，lin-4没有明显地改变lin-14 mRNA的量，但是Lin-14蛋白表达却明显降低。
2000年又在线虫中发现了与lin-4相似的miRNA ―― let-7，它们参与线虫发育的时空调节。
miRNA基因首先被RNA聚合酶H转录为较长的初始转录本，该转录本含有数千个核苷酸，称其为pri-miRNA。
在pri-miRNA内，miRNA位于由大约70个核苷酸构成的环柄结构内。
在动物体内，该环柄结构在细胞核内被RNA酶川Drosha和其辅助蛋白Pasha/DGCR8 识别和切割，形成pre-miRNA 。
之后，pre-miRNA 迅速被核质/细胞质转运蛋白Exportin5转运至细胞质，被位于细胞质内的RNA酶川Dicer 进一步切割。
产生一个类似于siRNA 的miRNA ：miRNA* 复合体，随后，该双链体解旋为成熟的miRNA和miRNA*，成熟的miRNA在一种ATP-依赖的沉默复合体（RISC ）中，形成非对称的RISC 复合物。
microrna生物学特征
microrna生物学特征
MicroRNA（miRNA）是一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，广泛存在于真核生物中。
其生物学特征主要包括以下几个方面：
1. 长度短：一般含20\~24个碱基，在3'端有1\~2个碱基的差异。
2. 特异性：成熟的microRNA在5'端和3'端具有特殊结构，便于区分。
3. 同源性：均来自前体的一条臂。
4. 广泛性：在自然界广泛存在，从低等生物到人类都有其存在的痕迹。
5. 保守性：高度保守性，时序表达特异性和组织表达特异性，以及miRNA 独有的特征。
6. 功能特性：可以跟RISC结合，促进靶基因mRNA降解，或抑制其蛋白翻译，从而发挥其生物学作用。
更多信息可查阅关于miRNA的学术文献获取。
microRNA沉默技术
microRNAs 沉默技术例证
microRNAs沉默技术例证
实验进程1
·实验动物：小鼠
·沉默分子：antagomir-122
就
是
·提呈系统：胆固醇偶联
我
啦！
·注射方式：尾静脉注射
·靶分子：miR-122（肝脏）
microRNAs沉默技术例证
northern biot分析
③ 夏新，张小敏，宋鹏飞，王爽.反义寡核苷酸介导的 miRNA沉默研究.安徽农业科学.2011.39(24):14545-14547
④ Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350–-355
病（没有图）
microRNAs 沉默技术
microRNAs沉默技术
microRNAs的转录与加工
无效或低 效沉默
高效沉默
microRNAs沉默技术
用单纯的反义寡核苷酸抑制miRNA
效果差！！
分子改造！！
反义寡核苷酸链与miRNA之间 亲和力低！！稳定性差！
1.提高亲和力！ 2.延长细胞内滞留时间！
目录
microRNAs 背景知识介绍
microRNAs的背景知识介绍
mRNA：信使RNA，转录的模板 tRNA ：转运RNA rRNA：核糖体RNA microRNA：微小RNA，起基因调控作用。 hnRNA：不均一核RNA，多为mRNA的前体 snRNA：小核RNA ,对RNA加工方面起作用。 ssRNA:作为病毒的线状单链遗传物质 dsRNA：作为病毒的线状双链遗传物质 siRNA：小干扰RNA Sat-RNA：卫星RNA TR：端粒酶RNA，组成端粒酶的成分之一 核酶RNA：起催化反应的RNA。 。。。。。。
MicroRNA治疗原理分析及应用前景评估
MicroRNA治疗原理分析及应用前景评估近年来，MicroRNA（miRNA）已成为基因治疗领域的研究热点之一。
作为一类小分子RNA，miRNA在细胞内起着调控基因表达的关键作用。
通过干扰miRNA的功能，人们发现可以有效地调控基因的表达，从而影响一系列重要的生物过程，如细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡等。
本文将对miRNA治疗的原理进行深入分析，并对其在疾病治疗领域的应用前景进行评估。
一、MicroRNA治疗原理分析1. miRNA的功能和调控机制miRNA是一种短链非编码RNA，一般由21-23个核苷酸组成。
在细胞内，miRNA通过与靶基因的MRNA序列互相配对，从而介导了转录后基因表达的调节。
miRNA在这一过程中通过促进mRNA降解或抑制蛋白质合成来发挥作用。
2. miRNA的治疗模式miRNA治疗可以通过两种模式实现：增强miRNA的功能或抑制miRNA的功能。
增强miRNA功能主要通过miRNA模拟物来实现，这类物质能够降低特定miRNA的表达量，并恢复其功能。
而抑制miRNA的功能则是通过miRNA反义物或miRNA掩蔽物来实现，用以影响miRNA与靶基因的结合。
3. miRNA疾病相关性研究表明，许多疾病与miRNA表达的异常相关。
异常表达的miRNA在许多疾病中被发现，包括癌症、心血管疾病、神经系统疾病等。
因此，调控miRNA表达和功能，对于疾病的治疗具有重要意义。
二、MicroRNA治疗的应用前景评估1. 癌症治疗领域miRNA在癌症治疗中具有广泛的应用前景。
已有研究显示，通过调控miRNA的表达和功能，可以恢复肿瘤抑制miRNA的水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。
此外，miRNA还可以作为肿瘤标记物，用于早期癌症诊断和预后评估。
2. 心血管疾病治疗领域miRNA也被广泛应用于心血管疾病的治疗。
研究发现，某些miRNA在心脏病变中表达异常，并与心肌纤维化、心肌细胞凋亡等心血管疾病相关的生理过程密切相关。
microrna编辑原理
microrna编辑原理
MicroRNA（miRNA）是一种由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中参与转录后基因表达调控。
其编辑原理如下：
1. miRNA前体的生成：具有发夹结构的70~90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer加工后生成定位于RNA前体的3'或5'端、有5'端磷酸基和3'端羟基的miRNA前体pre-miRNA。
2. 转运和剪切：pre-miRNA在Exprotin/5复合物的作用下被转运到胞质基质中，在胞质中由Dicer剪切成为miRNA复合体（RISC）。
3. 沉默机制：RISC与该miRNA的3'翻译区（3'UTR）结合到位于胞质的P-body（processing body）中。
如果miRNA与靶mRNA匹配完全，则该复合体降解mRNA；若两者序列部分匹配，尤其是miRNA的5'端2~8个被称为种子序列的核苷酸与靶mRNA匹配完好，则通过抑制靶mRNA的翻译来沉默特定基因。
4. 调节网络：每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。
这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。
据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。
如需了解更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。
mirna的鉴定标准
mirna的鉴定标准miRNA（microRNA）是一类长度约为21-23个核苷酸的非编码RNA分子，它们在基因表达调控中起着重要作用。
miRNA的鉴定标准通常涉及多个方面，包括实验技术、生物信息学分析和生物学验证等方面。
首先，在实验技术方面，miRNA的鉴定通常涉及miRNA的提取、测序、定量和功能分析等步骤。
提取miRNA的方法可以采用常规的RNA提取技术，如TRIzol法或商用的miRNA提取试剂盒。
测序方面，可以利用高通量测序技术对miRNA进行全面的检测和定量。
此外，还可以利用qPCR等技术对miRNA进行定量检测。
功能分析方面，可以通过miRNA转染、靶基因预测和验证等方法来研究miRNA的生物学功能。
其次，在生物信息学分析方面，miRNA的鉴定标准涉及到对测序数据的处理和分析。
这包括对miRNA测序数据的质控、比对、差异表达分析、miRNA靶基因预测等步骤。
常用的生物信息学工具包括Bowtie、TopHat、DESeq2、miRanda等，这些工具可以帮助研究人员对miRNA数据进行全面的分析和解读。
最后，在生物学验证方面，miRNA的鉴定标准还包括对其生物学功能的验证。
这包括对miRNA靶基因的实验证实、miRNA与疾病相关性的研究、miRNA在细胞信号通路中的作用等方面。
通过细胞实验、动物实验以及临床样本的检测，可以验证miRNA在生物学过程中的作用和意义。
总的来说，miRNA的鉴定标准涉及实验技术、生物信息学分析和生物学验证等多个方面，需要综合运用多种技术和方法来全面、准确地鉴定miRNA及其生物学功能。
希望这些信息能够对你有所帮助。
microRNA简介
micro RNAMicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。
到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有28645 个miRNA 分子(Release 21: June 2014) 。
大多数miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster) 的形式存在于基因组中(Lagos2Quintanaet al , 2001 ; Lau et al , 2001) 。
中文名MicroRNA性质非编码单链RNA 分子特点由内源基因编码的长度等缩写miRNA简介MicroRNA (miRNA) 是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。
每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。
这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。
据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。
最近的研究表明大约70 %的哺乳动物miRNA 是位于TUs区( transcriptionmicro RNA units , TUs ) ( Rodriguez et al ,2004) , 且其中大部分是位于内含子区( Kim &Nam , 2006) 。
一些内含子miRNA 的位置在不同的物种中是高度保守的。
miRNA 不仅在基因位置上保守, 序列上也呈现出高度的同源性(Pasquinelli etal , 2000 ; Ruvkun et al , 2001 ; Lee & Ambros ,2001) 。
miRNA 高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。
miRNA 与其靶基因的进化有着密切的联系, 研究其进化历史有助于进一步了解其作用机制和功能。
MicroRNAMicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，几个miRNAs也可以调节同一个基因。
循环microRNA
多，但是芯片检测方法的重现性和准确性比
较差，因此只用于疾病相关循环miRNA的初
.
15
循环miRNA研究、研发体系
Solexa技术初筛患者血清中表达上升的一组miRNA qRT-PCR技术对初筛miRNA进行复筛 qRT-PCR技术对复筛结果进行验证 评价筛选出的miRNA临床诊断价值
.
16
循环miRNA展望
循环miRNA与肿瘤
有学者发现口腔黏膜鳞状细胞患者血浆中 miR-31含量较健康人显著增高，手术切除肿 瘤2周后其水平明显下降。 多种miRNA在转移型前列腺癌患者血清中含 量非常高；其中miR-375和miR-141可作为肿瘤 风险高低的生物标志分子。 Hu等发现血清中miR-486、miR-30d、miR-1和 miR-499可以作为NSCLC患者生存率的预测因 子。 用伊马替尼治疗慢性粒. 细胞白血病患者2周后13
《循环microRNA的研究现状与展望》 孙士 鹏，李金明等
.
19
谢谢！
.
20
资料可以编辑修改使用 学习愉快！
课件仅供参考哦， 实际情况要实际分析哈！
感谢您的观看
.
5
microvesicles
eraly endosomes late endosomes
shedding vesicle
exosome
cell
.
6
exosomes
.
7
循环miRNA 耐受降解机制的假说
RNA可能与DNA退火，使得它们既耐受 DNase降解又能耐受RNase降解
RNA可能被包入脂质或脂蛋白复合物内而 受到保护
循环microRNA的发展 和前景
.
1
microRNA 技术
miRNA技术详述摘要: miRNAs是一类重要的内源性小的非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。
miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过抑制翻译或降解靶标mRNAs而调节基因的表达。
人类基因组中大约存在超过1000条miRNA，其在多种人体细胞类型中大量表达，估计其调节超过60%的哺乳动物基因。
引述精准的基因表达调控对生物体的生长发育和功能至关重要。
过去对基因表达调控的研究主要集中在转录因子介导的基因转录调控方面(激活或抑制基因转录)。
而RNA一度被认为是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明RNA在生命的进程中扮演的角色远比早前的设想重要，晚近发现一系列小分子非编码RNA(small noncoding RNA)，包括miRNA (micrornA)，siRNA (small interfering RNA)，piRNA (piwi-interacting RNA)和esiRNA (endogenous siRNA)等，这些小RNA组成了RNA调控网络，在转录水平、转录后及表观遗传等水平控制基因的表达，参与调控包括细胞增殖、分化和凋亡等进程，影响着生物体的生长发育和多种病理过程。
小RNA的发现也揭示了真核生物全新的基因表达调控方式。
miRNAs是一类重要的内源性小的非编码rna分子，大约由21-25个核苷酸组成。
miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过抑制翻译或降解靶标mRNAs而调节基因的表达。
人类基因组中大约存在超过1000条miRNA，其在多种人体细胞类型中大量表达，估计其调节超过60%的哺乳动物基因。
miRNA在植物界和后生动物界间表现不同的特性。
在植物中，miRNA 与其靶基因通过近乎完美互补的方式相结合;而在后生动物中，经常是一条miRNA可以和靶基因的多个位点相结合，或是一条miRNA调节多种靶基因。
另外,在后生生物中，miRNA 靶位点位于mRNA的3’UTR，而在植物中，miRNA靶位点可以位于3’UTR，更多情况下是位于mRNA的编码区内。
microRNA简介
microRNA简介转录本的类型是多种多样的，除了编码蛋⽩的RNA外，还有很多⾮编码蛋⽩的RNA, noncoding RNA, 简称ncRNA。
在ncRNA中，根据长度⼜分成两类，长链⾮编码RNA, 指的是长度在200bp以上的⾮编码RNA, 缩写为lncRNA; 对于长度在50bp以下的RNA, 统称为small RNA。
small RNA包含了很多类型的⼩RNA, ⽐如miRNA, siRNA等，其中miRNA是研究的最为官⽅，最为成熟的⼩RNA。
miRNA是⼀类长度在18到36bp的⾮编码RNA, 关于miRNA长度的范围有很多说法，也有说是20到24bp之间的，⼤部分miRNA的长度在21或者22bp左右，miRNA的形成过程如下⾸先由miRNA gene转录⽣成初级miRNA转录本，简称pri-miRNA, pri-miRNA的长度在300到10kbp之间,然后进⼀步加⼯⽣成带有茎环结构stem-loop的miRNA前体，简称pre-miRNA, pre-miRNA长度在70到90bp之间，最后在Dicer酶切作⽤下，从pre-miRNA的5’端和3’端分别剪切形成成熟的miRNA, 即mature miRNA, 所以⼀个pre-miRNA可能产⽣两个成熟的miRNA。
关于miRNA的作⽤机制，研究的也⽐较清楚。
miRNA的功能属于转后后修饰调控，主要通过和mRNA的3’UTR区进⾏结合，结合区域称之为`seed`，当结合区域的序列完全配对时，诱导mRNA降解，当只有部分序列配对时，抑制mRNA的翻译，从⽽发挥⼀个负调控的机制，⽰意图如下对于miRNA⽽⾔，除了研究其表达⽔平上的组织特异性，时间，空间特异性之外，miRNA靶标基因的研究也是重要的⼀环，由于miRNA研究起步早，研究热度⾼，有很多数据库可供参考，在后续⽂章中会详细介绍。
·e n d·。
microRNA简介
MicroRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21－25个核苷酸组成。
这些小的miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达、microRNA的发现（Discovery）1993年，Lee，Feinbaum和Ambros等人发现在线虫体内存在一种RNA （lin-4），是一种不编码蛋白但可以生成一对小的RNA转录本，每一个转录本能在翻译水平通过抑制一种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。
对于出现这种现象的原因，科学家们猜测是由于基因lin-14的mRNA的3'UTR 区独特的重复序列和lin-4之间有部分的序列互补造成的。
在第一幼虫阶段的末期降低lin-14的表达将启动发育进程进入第二幼虫阶段。
7年后科学家又发现了第二个miRNA－let-7，let-7相似于lin-4，同样可以调节线虫的发育进程。
自从let-7发现以来，应用随机克隆和测序、生物信息学预测的方式，又分别在众多生物体如病毒、家蚕和灵长类动物中发现了成千的miRNAs。
被鉴定的miRNAs均被miRBase网站整理并加以注释。
此网站由著名的Sanger研究所主办，并对公众开放。
（/）microRNA的生物起源（Biogenesis）miRNAs起源于内源性表达转录本，是长约21-25nt的双链RNA分子，其典型特征是具有发卡结构。
图1表述了对当前miRNA和siRNA起源的理解。
miRNA 途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA（PrimarymiRNA）转录本（step 1）；这个70－100nt的发卡RNAs（pri-miRNA）在核内被核糖核酸酶Drosha加工处理而最终成为pre-miRNA（Precursor miRNA，）（step 2）；之后pre-miRNA 被核输出蛋白exportin 5转运入胞质（step 3），接着被第二个核糖核酸酶Dicer 消化为21－25nt的miRNA（step 4）或在胞核被CAF(Dicer酶的同族物)加工成成熟的20～24nt miRNA；这个阶段的miRNA可以结合RISC（RNA-Induced Silencing Complex，RISC可以将双链的miRNAs解离为单链）并与靶标mRNA互补并列（step5－6）；miRNA和靶序列的互补程度决定了靶基因mRNA要不在翻译水平被部分抑制，要不完全断裂（step 7）。
microRNA简介
micro RNAMicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。
到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有28645 个miRNA 分子(Release 21: June 2014) 。
大多数miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster) 的形式存在于基因组中(Lagos2Quintanaet al , 2001 ; Lau et al , 2001) 。
中文名MicroRNA性质非编码单链RNA 分子特点由内源基因编码的长度等缩写miRNA简介MicroRNA (miRNA) 是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。
每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。
这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。
据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。
最近的研究表明大约70 %的哺乳动物miRNA 是位于TUs区( transcriptionmicro RNA units , TUs ) ( Rodriguez et al ,2004) , 且其中大部分是位于内含子区( Kim &Nam , 2006) 。
一些内含子miRNA 的位置在不同的物种中是高度保守的。
miRNA 不仅在基因位置上保守, 序列上也呈现出高度的同源性(Pasquinelli etal , 2000 ; Ruvkun et al , 2001 ; Lee & Ambros ,2001) 。
miRNA 高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。
miRNA 与其靶基因的进化有着密切的联系, 研究其进化历史有助于进一步了解其作用机制和功能。
MicroRNAMicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，几个miRNAs也可以调节同一个基因。
microRNA检测方法
microRNA检测方法miRNA（MicroRNA）是一类短链非编码RNA分子，通常由21-24个核苷酸组成。
它们在转录后被Drosha和Dicer等内切酶处理，形成成熟的miRNA。
miRNA通过与靶基因的mRNA结合，调控基因表达的下降，从而在细胞的生物学过程中发挥重要作用。
因此，miRNA的检测方法对于研究miRNA的功能和作用机制具有重要意义。
目前，有多种方法可以用来检测miRNA，其中包括实验室技术和计算机模拟方法。
实验室技术主要有定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、北方印迹、原位杂交和测序等。
这些方法都有各自的优势和限制，可以根据研究的目的和需求选择合适的方法。
qRT-PCR是一种常用的miRNA检测方法。
这种方法通过逆转录将miRNA转化为cDNA，然后使用特异性引物进行扩增和定量测量。
qRT-PCR 具有灵敏度高、特异性强和准确性高的特点，可以快速检测和定量miRNA 的表达水平。
此外，由于qRT-PCR可以同时检测多个miRNA，因此可以用于高通量分析。
北方印迹是另一种常用的miRNA检测方法。
它通过将miRNA转移到膜上，然后使用与miRNA互补的探针进行杂交，最后使用化学发光或放射性同位素进行检测。
北方印迹具有高度特异性和准确性，可以检测低水平的miRNA。
然而，这种方法的操作复杂，需要较长的时间和高成本，且不能进行定量分析。
原位杂交是一种通过与miRNA互补的探针进行杂交来检测miRNA的方法。
该方法将miRNA直接定位在细胞或组织的位置，从而可以研究miRNA的空间表达模式。
原位杂交具有高分辨率和高空间特异性的特点，可以用于观察miRNA在发育和疾病过程中的动态变化。
测序是一种较新的miRNA检测方法，它通过高通量测序技术对miRNA 进行定量和高效检测。
该方法可以检测整个miRNA组的表达水平，并且可以发现新的miRNA序列和剪接变异。
测序技术的发展使得对miRNA的全面研究成为可能，但也存在一些挑战，如测序误差和数据处理的复杂性。
详细全面：microRNA研究的解决方案
详细全面：microRNA研究的解决方案献给科研小白的入门介绍，大牛自动跳过一、MicroRNA的研究背景1、MicroRNA简介：（1）microRNA(miRNA) 是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。
（2）在细胞核内转录成前体转录本(pri-miRNA)（3）被Rnase III 核酸酶Drosha/pasha加工成约70-90nt的发夹状pre-miRNA（4）转运到细胞质被Dicer加工成成熟的miRNA（5）双链miRNA 分子被解链，单链的miRNA 进入一个核糖蛋白复合体miRNP (RISC，RNA-inducedsilencing complex) （6）通过与靶基因mRNA的3’UTR或者CDS序列配对，促进mRNA的降解或抑制的翻译，从而抑制靶基因的表达。
二、miRNA的发现、功能、分子机制思路高通量筛选（miRNA微阵列芯片、miRNA测序）中低通量定量：miRNA定量qPCR高通量筛选--------miRNA微阵列芯片：1、Agilent和Affymetrix 两大miRNA芯片平台简介：Agilent microRNA芯片技术特点：（1）通过特殊的探针设计区分成熟miRNA和miRNA前体；（2）无需分离miRNA，直接用T otal RNA进行实验，只需100ng的T otal RNA 即可用来进行标记实验；（3）组织、血清、血浆、FFPE、冰冻切片组织、脱落细胞等均可进行实验；（4）高特异性：特殊的专利探针设计能区别一个碱基的差异；（5）高灵敏度：检测丰度跨4个log，最高可达6个log，只要存在6000个拷贝的分子就可以检出；（6）数据来源于Sanger miRBase，并方便及时更新。
2、微阵列芯片技术在microRNA研究中的案例解析案例1：microRNA芯片筛选发现miR-146a促进肝细胞癌化的内皮细胞血管新生MiR-146a enhancesangiogenic activity of endothelial cells in hepatocellular carcinoma bypromoting PDGFRA expression复旦大学孙惠川教授与周俭教授研究课题组研究表明，人类miRNA-146a 可以调控血小板衍生生长因子受体(PDGFRA)蛋白的表现，进而促进肝细胞癌化过程之内皮细胞血管新生能力。
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Victor R. Ambros
C. elegans
lin-4 ,first discovered , control the developmental time of C. elegans.
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lin-4 and lin-14 control timing of larval development and regulate life span in C.elegans
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miRNA Registry
/Software/Rfam/mi rna/index.shtml
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Function
500 400 300 200 100 0
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007.8
Year of miRNA Publications
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Introduction
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The mature miRNA sequence /Software/Rfam/mirna/ Identify the targets of miRNAs /targetscan Gene Ontology (GO) annotations http:// /
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Prediction
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Methods
3’-UTR sequence retrieval; ENSEMBL website http:// www.
miRNAs indentified in viral genomes
Let-7 , a second miRNA discovered by Gary Ruvkun's group
miRNAs implicated in cancer
Sanger Release 10.0 contains 5071 hairpin precursor miRNAs, expressing 4922 mature miRNA products, in primates, rodents, birds, fish, worms , flies, plants and viruses in August 2007
Cancer genomics: Small RNAs with big impacts Nature 435, 745-746(9 June 2005)
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miRNA Genes
TU :transcriptional unit
The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 1993 :75(5):843-854
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A Developmental Timing MicroRNA and Its Target Regulate Life Span in C. elegans Science 23 December 2005:Vol. 310. no. 5756, pp. 1954 - 1957
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miRNA gene prediction algorithms
Genomics of microRNA TRENDS in Genetics vol.22 No.3 March 2006
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Up to 88% of randomly selected predicted miRNA targets were proved to be real targets
Cell, Vol. 123, Issue 6, pp. 1133-1146
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miRNA Introduction
naturally in plants and animals Originate from capped & polyadenylated full length precursors (pri-miRNA) Hairpin precursor ~70 nt (pre-miRNA) Mature miRNA (miRNA)
Single stranded RNAs ◆ 19~25 nt, non-coding RNAs ◆ A single miRNA may target up to hundreds of mRNAs ◆ Inhibition of translational (animal) or Degradation of target RNA (plants) ◆ Regulation of cell proliferation, differentiation, apoptosis, carcinogenesis and viral infection ◆ Evolutionarily conserved
The lin-4 miRNA is shown with its complementary site in Lin-14(a) and Lin-28(b);The microRNA lin-4 and its target- lin-14, control the timing of larval development in Caenorhabditis elegans,also regulate life span in the adult. Reducing the activity of lin-4 shortened life span and accelerated tissue aging, whereas overexpressing lin-4 or reducing the activity of lin-14 extended life span .
Genomics of microRNA TRENDS in Genetics vol.22 No.3 2006
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MicroRNAs in Gene Regulation: When the Smallest Governs It All J 易生物-领先的生物医药商务平台 Biomed Biotechnol. 2006; : 69616.
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miRNA controls some plant phenotype
Control of leaf morphogenesis by microRNAs. Nature 2003, 425: 257–263Nature, 2003 易生物-领先的生物医药商务平台
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miRNA controls the differentiation of the hematopoietic stem cell
MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. 易生物-领先的生物医药商务平台 Science 2004,303, 83–86
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miRNA Publications(NCBI)
700 600
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Number of miRNA Publications Number of miRNA Publications
Timeline for miRNA Dicsoveries
lin-4 , First discovered in C.elegan by Victor Ambros ,mediated repression of lin-14 mRNA miRNAs discovered in human ,mouse and Drosophila
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Differences in miRNA Mode of Action
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miRNA in C. elegans development
◆
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miRNA processing
miRNA genes are transcribed by RNA polymerase II into primary miRNAs (pri-miRNAs). pri-miRNAs are processed into 60 to 70 nt miRNA precursors (pre-miRNAs within the microprocessor complex. exported via exportin-5, pre-miRNAs are cleaved by Dicer, generate an imperfect miRNA:miRNA duplex. mature 22 nt miRNAs are towards specific mRNAs ,the targeted mRNA will be initially subjected either to cleavage or translation repression.