ELLM试剂法测定自由巯基和二硫键
Ellman方法说明书Word版
Ellman试剂介绍、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、1页半胱氨酸作为巯基基团的标准品、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、2页巯基基团的摩尔吸光度、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、2页故障排除、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、3页相关的赛默飞世尔科技产品、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、3页附加信息、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、4页参考文献、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、4页半胱氨酸作为巯基基团的标准品A.原料制备·反应缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液，PH=8.0，包含1mM EDTA·半胱氨酸一水合盐酸盐，分子量175.6·Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液溶解4mgDTNBB.步骤2、取若干试管，每个试管中包含50μL的Ellman试剂液和2.5ml的缓冲液。
3、在各试管中加入250μL各浓度的标准工作液或待测物溶液。
注：对于未知的样品需要稀释，以便使其浓度标准曲线的工作范围之内（理想的浓度为0.1-1.0）。
4、室温下反应15min。
5、测试412nm紫外吸收。
6、根据得到数值生成一个标准曲线，测定待测样品由标准曲线计算SH含量基于摩尔吸光系数精确测量巯基的基团A.原料制备·反应缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液，PH=8.0，包含1mM EDTA·Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液溶解4mgDTNBB.吸光度测试1、对于每一个未知样本进行测试,准备一个包含50μL的Ellman试剂液和2.5ml的缓冲液。
2、加入250μL待测样品,空白添加250μL反应缓冲液。
3、室温下反应15min。
4、测试412nm紫外吸收。
5、根据TNB的摩尔消光系数(14,150M-1cm-1)计算巯基含量。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
E L L M A N试剂法测定自由巯基和二硫键This manuscript was revised by the office on December 22, 2012E L L M A N试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自2-吸光度0.2来计算-*1cm）1.4*101.2.不3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12时，15min之内会完全降解[7,8]。
6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].试验方案主要材料：1.材料PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/mlG-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml小瓶。
NOB液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O3.仪器质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflexⅢ(厂内编号KC2007-011)Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039）Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003）反相柱：Symmetry C18 5um 300à高压液相仪器：，（UV/Visible Detector）试验过程：一、缓冲液替换PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM NH4HCO3，稀释中加入G-CSF+DTT相分离收样：SF+DTT相分离集到之间的交由崔文喜冻干四、ELLMAN试剂测定自由巯基由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
E L L M A N试剂法测定自由巯基和二硫键标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]E L L M A N试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。
巯基化HA中巯基的取代度Ellman法详细步骤
首先制作半胱氨酸标准曲线，再用紫外分光光度法测定样品吸光度，计算出疏基含量，最终得出修饰率。
1、制作标准曲线：
缓冲液的配制：称取0.254gNaH2PO4与10.162gNa2HPO4于500ml容量瓶中，用
超纯水溶解，加入148.896mg的EDTA（乙二胺四乙酸），使其完全溶解，定容成500ml。
Ellman试剂的配制：称取4mgDTNB溶解在1ml缓冲液中。
取7只试管，分别在每只试管内加入50μL Ellman试剂与2.5ml磷酸钠缓冲溶液，混匀后，再在各试管内加入50μL标准溶液，混合均匀，在室温放置15min，以溶液G为空白，于波长412nm处测定半胱氨酸标准液的吸光度值(A)，如表9所示:
制作标准曲线如图10所示。
得标准曲线方程为y=0.1692x-0.0001，R2=09994，满足要求。
2、测量半胱氨酸透明质酸结合物的修饰率：
配制样品溶液：称取10.5mg半胱氨酸透明质酸结合物（含0.0274mmol伯醇羟基）用缓冲液溶解并定容至5ml；
配制空白对照溶液：称取10.5mg透明质酸（含0.0274mmol伯醇羟基）用缓冲液溶解并定容至5ml；
取2只试管，分别在每支试管内加入50μL Ellman试剂与2.5ml磷酸钠缓冲溶液，混匀后，再在各试管内加入50μL待测样品，混合均匀，在室温放置15min，以透明质酸溶液做空白，于波长412nm处测定待测样品的吸光度值(A)，如表10所示：
利用标准曲线和测得的样品溶液吸光度，计算样品中巯基的含量。
带入标准曲线计算：0.0385=0.1692x-0.0001，得出修饰率为3.5%（巯基数相对于透明质酸的双糖单位数）。
ellman's试剂比色法测定食品中蛋白质的巯基和二硫键
ellman's试剂比色法测定食品中蛋白质的巯基和二硫键
Ellman's试剂比色法是一种常用于测定食品中蛋白质的巯基和二硫键的方法。
该方法基于Ellman试剂对巯基和二硫键的选择性反应，将其转化为可检测的黄色产物。
实验中，首先将样品加入含有Ellman试剂的反应液中，在一定的反应时间后，使用紫外可见分光光度计测量反应液的吸光度，从而确定样品中的巯基和二硫键含量。
Ellman's试剂比色法具有灵敏度高、操作简便等优点，是一种常用的蛋白质含硫官能团测定方法。
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ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
ELLMAN 试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm 没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB ）[1]。
TNB 2-在412nm 有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
SS NO 2NO 2-OOC-OOC+SH S -SNO 2NO 2-OOC-OOC+SDTNB TNB 2- 根据文献记载，TNB 的吸光系数在13.6*103M -cm -~14.25*103M -cm -之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。
A=εbc ，其中A 为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol ·cm ）]。
以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M -cm -），需要TNB 的浓度为c=0.2/（14.15*103LM -cm -*1cm ）=1.4*10-5mol/L (1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml. 我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN 试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1. EDTA 的适量加入有助于TNB 显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2. 在不同缓冲液中，TNB 的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm 的吸收也不3. 同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB 的分光光度法分析对SDS 很敏感[6]。
4. DTNB 随着pH 的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h ，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12时，15min之内会完全降解[7,8]。
蛋白二硫键鉴定和定量分析
蛋白二硫键鉴定和定量分析BTP-蛋白二硫键鉴定和定量分析蛋白质鉴定和结构功能分析是现代生物学研究中的必要环节，而质谱已成为这一环节的支撑技术。
很多定位到细胞表面或分泌到胞外的蛋白质都有二硫键，例如免疫系统(immune system)产生的抗体、各类生长因子（growth factors）、内分泌系统产生的肽激素如胰岛素(insulin)，以及这些生长因子或激素的受体。
因为二硫键的正确形成对于这些蛋白质的稳定性和活性至关重要，而且很多蛋白质品以及生物制剂(Biopharmaceutical)的靶蛋白都有这些属性，所以二硫键配对状态的精确解析对于它们的结构功能研究和相关品的研发、质控有重要价值。
百泰派克公司采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，Orbitrap Fusion质谱平台，Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，推出蛋白二硫键分析解决方案，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的样品寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，提供蛋白二硫键位点的相关信息。
百泰派克公司基于发表在Nature Methods上的文章：mapping native disul de bonds at a proteome scale，结合自己的实验经验建立了针对于单个蛋白和组学水平上的蛋白二硫键分析解决方案，包括克服蛋白质二硫键体外交换、保持其天然结构的样品制备方法，二硫键交联肽段的有效质谱分析方法，以及配套的二硫键鉴定软件pLink-SS。
二硫键鉴定研究路线BTP-蛋白二硫键鉴定和定量分析研究案例该项目是某高校老师二硫键鉴定，得到的部分结果如下图所示：二硫键鉴定研究案例BTP-蛋白二硫键鉴定和定量分析样品要求1. 如果您提供的是组织样品，请您干冰将组织样品寄给我们；植物组织样本最少200mg，血液样品至少1ml(血浆注意用EDTA防凝)，血清0.2-0.5ml，尿液2ml，动物组织样品至少1g，细胞样品为1X107个细胞，酵母、微生物等干重200mg。
巯基化透明质酸包封的仿生交联基因微载体的构建
装 ，构建 了壳层二硫键仿生交联 的基 因超分 子组装体 （ Ｅ／ Ｎ ／ Ａ—Ｈ） Ｐ ＩＤ Ａ Ｈ Ｓ ．凝胶 电泳 结果表 明 ， 组装体 有 该 很好的 Ｄ Ａ缔合特性 ．壳层 的仿生交联使基 因超分子组装体在生理盐 溶液 中的稳定性 得到有效 改善 ，细胞 Ｎ 毒性显著降低 ，并能有效转染细胞 ，为非病毒基 因传递体 系的设计 提供了新途径．
胱 甘肽 对壳 层二 硫键 的“ 生物 开关 ” 效应 ， 有望 实 现细胞 内的解 组装 响应 ，为高效 安 全 的非 病 毒基 因载 体 的设 计提 供切 实 可行 的新 思路 ．
１ 实 验 部 分
１ １ 试 ． 剂
支 化 聚 乙烯 亚胺 （ Ｐ Ｉ ｂ Ｅ ，分 子 量 ２ ０ ０ 和 胱 胺 二 盐 酸盐 购 自 Ｓｇ — ｌｒ ｈ公 司 ；透 明 质 酸 钠 盐 ５０ ） ｉ Ａ ｄｉ ｍａ ｃ （ 子量 为 ２ ０ ０～ ０ ０ ０ 购 自山东 福瑞 达 生化 有 限公 司 ；１羟 基 苯 并 三唑 （ Ｏ ｔ 和 １（ 一 甲氨 基 分 ００ ４０ ０ ） 一 Ｈ Ｂ ） 一３ 二 丙基 ）３乙基 碳二 亚胺 盐 酸盐 （ Ｄ ・ Ｃ ） 自上 海延 长 生 化 科 技发 展 有 限公 司 ； 硫 苏 糖 醇 （ Ｔ ） 一一 Ｅ Ｃ Ｈ １购 二 Ｄ Ｔ
购 自 ＢｏＢ ｓ 公 司 ； Ｅ Ｆ （７ ３ ｐ 购 自 Ｃｏｅ ｃ 司 ； ５一 代 － 一２硝基 苯 甲酸 ） Ｄ Ｎ 购 ｉ ａｉ ｃ ｐ Ｇ Ｐ ４ ３ｂ ） ｌ ｔ ｈ公 ｎｅ ５， 二硫 双 （一 （ Ｔ Ｂ） 自 日本 株式 会社 同仁化 学研 究所 ；鱼精 Ｄ Ａ（ 盐 ，高纯 级 ） 羟 乙基 哌 嗪 乙磺 酸 （ ｅｅ） 自 Ａ ｒ Ｎ 钠 和 Ｈ ｐｓ 购 ｍｅ—
化妆品中巯基乙酸的检测方法
化妆品中巯基乙酸的检测方法嘿，说实话化妆品中巯基乙酸的检测方法这事儿，我一开始也是瞎摸索。
我试过好多办法，走了不少弯路呢。
我最开始想着就用那种很简单的化学显色反应来试试。
我就把化妆品样品和一些我觉得可能会起反应的试剂混合起来，看着那些试剂的说明，感觉挺靠谱的。
可是这真的就是碰运气，有时候颜色变化很微弱，我都不确定到底有没有巯基乙酸，就这么失败了好多次。
后来我想，那得精确一点啊。
然后我就听闻了高效液相色谱法HPLC。
这东西听起来挺高大上的。
我就开始捣鼓。
就像搭建一个很复杂的拼图一样，要把那个色谱柱弄好，流动相的选择那可是折磨死我了。
我试了好多种流动相的组合，就像在试不同口味的饮料搭配，看哪种能让检测结果更清楚。
一开始我没注意流动相的比例，那检测出来的峰啊，乱得像一团麻线，根本没法辨别巯基乙酸的峰在哪里。
后来我就慢慢调整，一点点试，哎呀，终于峰型好看了，能准确的找到巯基乙酸对应的峰了。
不过呢，用这个HPLC的时候，样品的前处理也超级重要。
就像给食物进行预处理一样，如果处理不好杂质很多，就跟炒菜里混了好多沙子一样讨厌。
我最开始没处理好样品，出来的色谱图那叫一个惨不忍睹啊，各种各样的杂峰到处都是。
后来我就学聪明了，我会先对化妆品进行萃取啊，过滤之类的处理，然后再进样检测。
每一个小步骤都要很仔细，少一点细心都不行。
还有那个进样量也要注意，少了检测不到，多了色谱柱压力可能太大，这就像给饭碗盛饭，少了吃不饱，多了会洒出来一样的道理。
不过说实在的，这个方法虽然能准确检测，但是要花不少钱，仪器很贵的。
我还听说有用气相色谱法的，但是我没实际试过这个方法，不是特别确定这个方法的效果还有具体操作难度啥的。
我感觉要是想检测化妆品里的巯基乙酸，要是设备允许的话，高效液相色谱法只要把那些小细节注意好，慢慢摸索，还是比较可靠的。
当然对样品前处理是重中之重，就像盖房子打地基一样重要啊。
总之大家要是尝试检测的话，可要耐心细心一点，不要像我最开始那样，莽莽撞撞的，那只会浪费时间和试剂。
蛋白质二硫键检测：选择适用的方法解决技术难题
蛋白质二硫键检测：选择适用的方法解决技术难题蛋白质是生物体内重要的功能分子，其结构和功能受到二硫键的影响。
二硫键是两个半胱氨酸残基之间的共价键，对于蛋白质的稳定性和结构起着至关重要的作用。
因此，准确检测和定量蛋白质中的二硫键是生物药物研发和质量控制中的关键问题之一。
本文将介绍几种常用的蛋白质二硫键检测方法，帮助读者选择适用的方法解决技术难题。
方法一：二硫键还原与还原态电泳二硫键的检测最常用的方法之一是通过还原二硫键，将蛋白质还原为其还原态形式，然后使用还原态电泳进行分析。
这种方法适用于检测蛋白质中的内源性二硫键，但对于外源性二硫键的检测效果较差。
图1。
方法二：质谱分析质谱分析是一种高灵敏度的蛋白质二硫键检测方法。
通过将蛋白质进行酶解，得到含有二硫键的肽段，然后使用质谱仪进行分析。
质谱分析可以准确地确定二硫键的位置和数量，但需要复杂的样品前处理和专业的仪器操作。
方法三：荧光探针法荧光探针法是一种简单、快速的蛋白质二硫键检测方法。
该方法利用特定的荧光探针与二硫键发生反应，产生荧光信号。
通过测量荧光信号的强度可以定量分析蛋白质中的二硫键含量。
荧光探针法操作简便，适用于高通量的蛋白质二硫键检测。
方法四：生物传感器技术生物传感器技术是一种新兴的蛋白质二硫键检测方法。
该方法利用生物传感器与蛋白质中的二硫键发生特异性的相互作用，产生信号响应。
生物传感器技术具有高灵敏度、高选择性和实时监测的优势，但需要专业的设备和操作。
蛋白质二硫键检测是生物药物研发和质量控制中的重要环节。
根据实际需求，选择适用的方法解决技术难题至关重要。
二硫键还原与还原态电泳适用于内源性二硫键的检测，质谱分析可以准确确定二硫键的位置和数量，荧光探针法操作简便适用于高通量检测，而生物传感器技术具有高灵敏度和实时监测的优势。
在实际应用中，可以根据需求和实验条件选择合适的方法进行蛋白质二硫键检测。
Ellman’s assay
5,5－二硫二硝基苯甲酸 DTNB 现货供应产品描述：DTNB为Ellman试剂。
它用于比色法测定生物样品中巯基。
它易溶于水。
在巯基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。
由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412 nm处具有最大吸收，DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。
配置方法：准确称取0.198gDTNB用50mMNa2HPO4（pH＝7.0）配制成50ml溶液，存放于棕色瓶中，于暗处低温保存备用。
应该注意的是配置缓冲、浓度，储存时要避免见光。
应用举例：半胱氨酸中自由巯基的定量检测方法一、试剂的配制：1、Tris－HCL缓冲液（0.25M）：DDW准确配制后，用盐酸调节pH＝8.3；2、半胱氨酸标准溶液（1mM）：准确称取0.017563gL－半胱氨酸（175.63），用1ml甲酸溶解，以DDW定容至100ml；3、DTNB（分子量：396.35）标准溶液（10mM）：准确称取0.198175gDTNB用50mMNa2HPO4（pH＝7.0）配制成50ml溶液，存放于棕色瓶中，于暗处低温保存备用4、DTNB分析溶液（0.1mM）：由1体积10mMDTNB标准液加99体积0.25M的Tris缓冲液配制而成，现用现配。
二、标准曲线的制作;1、25℃条件下，用Tris缓冲液稀释半胱氨酸标准液配成梯度的稀释液（5.0ml），其浓度分别为：0.00mM、0.025mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM；2、取上述各浓度溶液1ml分别加入到5ml预先恒温于25℃水中的DTNB分析溶液，摇匀，准确静止10min，立即于波长412nm处测定吸光度值（A）。
根据目的蛋白的吸光度在标准曲线上读出对应的浓度即可Product Name:DTNBProduct Number:D8130Product Brand:SigmaCAS Number:69-78-3Molecular Formula:[-SC6H3(NO2)CO2H]2 Molecular Weight:396.35Ordering Information。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-在/（摩TNB 1.4*10-51.2.3.4.5.之6.1.材料PEG-G-CSF批号：080229浓度4.32mg/mlG-CSF批号：080126浓度6.9mg/ml10k超滤膜PALL2.试剂SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。
20ug/小瓶。
加入20ul50mMNH4HCO3，pH7.8溶解，配成1ug/ul的酶液。
1MDTT刘春凤提供TFA（三氟乙酸）：TEDIALot#705114乙腈：FisherScientificLot#055848StarterkitforMALDI-TOFMS：BRUKERDALTONICS，LotNO2007-208241-001(includingα-Cyano-4-hydroxycinnamicacid(HCCA),peptidecalibrationstandard,proteincalibrationstandardI,proteincalibrationstandardⅡ)PEG肽段反相分离流动相A液：0.1%TFA/H2OB液：1）取取2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin10ul，往G-CSF中加入Trypsin10ul，同时各加入1ul1MDTT使终浓度为5mM。
另做一空白对照，往300ul50mMNH4HCO3中加入Trypsin15ul。
37℃反应，开始时间为。
三、肽段反相分离收样：TT离喜冻干四、温度：①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值A DTNB。
蛋白质二硫键测定方法
蛋白质二硫键测定方法蛋白质二硫键是蛋白质分子中一种重要的非共价化学键。
它能够使蛋白质分子保持稳定的三维构象，从而维持其生物学功能。
因此，测定蛋白质二硫键含量和位置对于了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。
目前，常用的蛋白质二硫键测定方法有以下几种。
1. 正硫氰酸乙酯还原法正硫氰酸乙酯还原法是最早应用于测定蛋白质二硫键的方法之一。
该方法的基本原理是：使用正硫氰酸乙酯将蛋白质中的二硫键氧化成假二硫键，再加入还原剂来将假二硫键还原成真正的二硫键。
在这个过程中，还原剂会受到氧化，因此可以通过测定还原剂的氧化量来计算出蛋白质中的二硫键含量。
由于该方法操作简单，所需试剂也相对易得，因此目前仍被广泛应用于蛋白质二硫键的测定。
2. 二硫亚胺染色法二硫亚胺染色法是一种比较先进、高效的蛋白质二硫键定量方法。
该方法依靠二硫亚胺与二硫键的特异性反应来将二硫键中的硫与试剂结合成硫蓝染色产物，再利用紫外光谱法或比色法来测定染色产物的吸光度，从而计算出蛋白质中二硫键的含量。
与正硫氰酸乙酯还原法相比，二硫亚胺染色法具有更高的灵敏度和特异性。
该方法的主要缺点是在试剂中添加硫蓝前需要去除蛋白质中的还原剂和其他干扰物，操作较为繁琐。
3. 高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种基于化学分析原理的高端技术。
它是一种将蛋白质在透过某些特定的化学变化后进行旋转分离的方法。
在这个方法中，蛋白质要与某个特定溶剂混合，以便进行分离。
使用该方法时，蛋白质分子中包含的二硫键可以被还原为假二硫键，然后将其在分离管中通过特定的溶剂与分离材料分离。
分离出的产品再通过色谱法分离出各个成分，并测定各个组分的相对含量。
总之，以上三种方法都是目前应用较广泛的测定蛋白质二硫键含量和位置的方法。
在选择具体的测定方法时，需要根据实验需求和所得数据的精度要求来进行选择。
二硫键定量方法 探针
二硫键定量方法探针Quantifying disulfide bonds in proteins is a crucial step in understanding their structure and function. Disulfide bonds play a key role in stabilizing the native structure of many proteins, and their disruption can lead to a loss of function or misfolding. Therefore, the development of accurate and reliable methods for quantifying disulfide bonds is essential for advancing our understanding of protein structure and function.在蛋白质中定量二硫键是理解其结构和功能的关键一步。
二硫键在稳定许多蛋白质的天然结构中发挥着关键作用，它们的破坏可能导致功能的丧失或错误折叠。
因此，开发准确可靠的二硫键定量方法对于推动我们对蛋白质结构和功能的理解至关重要。
One commonly used method for quantifying disulfide bonds in proteins is the use of disulfide bond cleavage agents, such as DTT (dithiothreitol) or TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine). These agents act to reduce disulfide bonds to free sulfhydryl groups, allowing for the quantification of the disulfide bonds present in a protein sample. However, it is important to note that the use of these agents requirescareful optimization to ensure that all disulfide bonds are fully reduced without introducing unwanted side reactions.一个常用的蛋白质中定量二硫键的方法是使用二硫键裂解试剂，比如DTT （二硫苏糖醇）或TCEP（三(2-羧乙基)磷），这些试剂能够将二硫键还原为游离巯基，从而可以对蛋白质样品中的二硫键进行定量。
二硫键和巯基在蛋白质结构功能中的作用及分析方法
二硫键和巯基在蛋白质结构功能中的作用及分析方法
田悦;杜军保
【期刊名称】《中华实用儿科临床杂志》
【年(卷),期】2007(022)019
【摘要】本文总结了二硫键和巯基在稳定蛋白质结构、实现蛋白质功能中的主要作用及二硫键和巯基在体内外各种条件下相互转化的影响因素.本文还综述了拉曼光谱这一结构生物学中重要研究手段的原理及在二硫键和巯基研究领域中应用.【总页数】3页(P1499-1501)
【作者】田悦;杜军保
【作者单位】北京大学第一医院,儿科,北京,100034;北京大学第一医院,儿科,北京,100034
【正文语种】中文
【中图分类】R729
【相关文献】
1.基于图的匹配方法预测蛋白质结构中的二硫键 [J], 史晓红;王燕;张凯;罗亮;许进
2.支持向量机方法预测蛋白质结构中的二硫键 [J], 王宝文;王水星;刘文远;于家新
3.中药合剂CB在晶状体白内障形成中对巯基及二硫键的作用 [J], 王克维
4.面条加工过程中蛋白质中巯基和二硫键的变化规律 [J], 李翠翠;马宇翔;闫慧丽;刘紫鹏
5.LVQ神经网络方法预测蛋白质结构中的二硫键 [J], 罗亮;史晓红;许进
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E L L M试剂法测定自由巯基
和二硫键
Prepared on 22 November 2020
ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：
5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)
5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-
根据文献记载，TNB的吸光系数在*103M-cm-~*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限来计算（吸光系数取*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=（*103LM-cm-*1cm）=*10-5mol/L*10-
8mol/ml)，需要蛋白浓度为*10-5mol/L*18790g/mol=L=ml.
我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：
1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm
的吸收也不
3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对
SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在，其降解速度为%/h，在
5.pH值，其降解速度为%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12
时，15min之内会完全降解[7,8]。
6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].
试验方案
主要材料：
1.材料
PEG-G-CSF批号：080229浓度ml
G-CSF批号：080126浓度ml
10k超滤膜PALL
2.试剂
SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。
20ug/小瓶。
加
入20ul50mMNH4HCO3，溶解，配成1ug/ul的酶液。
1MDTT刘春凤提供
TFA（三氟乙酸）：TEDIALot#705114
乙腈：FisherScientificLot#055848
StarterkitforMALDI-TOFMS：BRUKERDALTONICS，LotNO2007-
208241-001(includingα-Cyano-4-
hydroxycinnamicacid(HCCA),peptidecalibrationstandard,proteincalibratio
nstandardI,proteincalibrationstandardⅡ)
PEG肽段反相分离流动相
A液：%TFA/H2O
B液：%TFA/90%乙腈/H2O
3.仪器
质谱仪：BRUKERDALTONICSMALTI-TOF-TOFautoflexⅢ(厂内编号
KC2007-011)
Beckman22R台式离心机（厂内编号AM-039）
BeckmanDU-800紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）
恒温循环仪：JULABOF12-ED（厂内编号KC2008-003）
反相柱：SymmetryC185um300à*150mm，LotNO
高压液相仪器：，（UV/VisibleDetector）
试验过程：
一、缓冲液替换
PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为
50mMNH4HCO3，。
使用50mMNH4HCO3作为空白对照，样品用
50mMNH4HCO3稀释一倍后在DU-800紫外分光光度计上测浓度。
PEG-G-CSF的浓度约ml，G-CSF的浓度约ml。
二、酶切处理
1）取37ulG-CSF,共400ug，加入稀释为终浓度为2mg/ml。
取,共400ug，加入152ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。
2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin10ul，往G-CSF中加入Trypsin10ul，同时各加入1ul1MDTT使终浓度为5mM。
另做一空白对
照，往300ul50mMNH4HCO3中加入Trypsin15ul。
37℃反应，开始时间为。
三、肽段反相分离
G-CSFTrypsin+DTT反相分离
收样：
PEG-G-CSFTrypsin+DTT反相分离
四、ELLMAN试剂测定自由巯基
由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。
根据我们所查找到得文献，采用的参数如下：
反应缓冲液：磷酸钠+，
温度：25℃
在这些参数下，摩尔吸收光系数为±*103LM-cm-[9].
1)标准曲线
用反应缓冲液配制10umDTT，20umDTT，40umDTT，80umDTT，
160umDTT，320umDTT。
用缓冲液配制10mM的ELLMAN试剂。
准
备两个比色皿。
①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收
值，吸收值调节到0.
②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品
管中，在412nm测定吸收值A DTNB。
③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品
管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A final。
④A412nm=A final-（）(A DTNB-A buffer),制作标准曲线。
2）样品巯基测定
①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收
值，吸收值调节到0.
②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品
管中，在412nm测定吸收值A DTNB。
③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品
管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A final。
④A412nm=A final-（）(A DTNB-A buffer)，根据标准曲线测定巯基。
参考文献：
1)产品说明书。
7)Riddles,—areexamination,。