ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键审批稿
Ellman’s assay
5,5－二硫二硝基苯甲酸 DTNB 现货供应产品描述：DTNB为Ellman试剂。
它用于比色法测定生物样品中巯基。
它易溶于水。
在巯基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。
由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412 nm处具有最大吸收，DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。
配置方法：准确称取0.198gDTNB用50mMNa2HPO4（pH＝7.0）配制成50ml溶液，存放于棕色瓶中，于暗处低温保存备用。
应该注意的是配置缓冲、浓度，储存时要避免见光。
应用举例：半胱氨酸中自由巯基的定量检测方法一、试剂的配制：1、Tris－HCL缓冲液（0.25M）：DDW准确配制后，用盐酸调节pH＝8.3；2、半胱氨酸标准溶液（1mM）：准确称取0.017563gL－半胱氨酸（175.63），用1ml甲酸溶解，以DDW定容至100ml；3、DTNB（分子量：396.35）标准溶液（10mM）：准确称取0.198175gDTNB用50mMNa2HPO4（pH＝7.0）配制成50ml溶液，存放于棕色瓶中，于暗处低温保存备用4、DTNB分析溶液（0.1mM）：由1体积10mMDTNB标准液加99体积0.25M的Tris缓冲液配制而成，现用现配。
二、标准曲线的制作;1、25℃条件下，用Tris缓冲液稀释半胱氨酸标准液配成梯度的稀释液（5.0ml），其浓度分别为：0.00mM、0.025mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM；2、取上述各浓度溶液1ml分别加入到5ml预先恒温于25℃水中的DTNB分析溶液，摇匀，准确静止10min，立即于波长412nm处测定吸光度值（A）。
根据目的蛋白的吸光度在标准曲线上读出对应的浓度即可Product Name:DTNBProduct Number:D8130Product Brand:SigmaCAS Number:69-78-3Molecular Formula:[-SC6H3(NO2)CO2H]2 Molecular Weight:396.35Ordering Information。
ellman测巯基
埃尔曼的试剂，5,5'二硫代双-（二硝基苯甲酸），5克分子量：396.35CAS号：69-78-3使用半胱氨酸标准精确量化巯基程序材料的制备1 反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH 8.0，含有1 mM的EDTA半胱氨酸标准品，分子量136.2 ：配成一定浓度梯度3 Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解DTNB程序3在各试管中加入250μL各浓度的标准工作液或待测物溶液注：对于未知的样品需要稀释，以便使其浓度标准曲线的工作范围之内（理想的浓度为0.1-1.0）。
4在室温混合和反应15分钟。
在412 nm处测量吸光度。
根据得到数值生成一个标准曲线，测定待测样品由标准曲线计算SH含量摩尔吸光系数的程序精确量化的巯基的材料的制备1 反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH 8.0，含有1 mM的EDTAEllman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解DTNB测量吸光度去若干试管，每管加入50μL的Ellman试剂溶液和2.5mL反应缓冲液。
加入250μL待测样品,空白添加250μL反应缓冲液在室温混合和反应15分钟。
分光光度计412nm测定吸光度。
根据TNB的摩尔消光系数(14,150)计算巯基含量该国能在412nm的合成，有一个相对比较激烈的吸光度同时二硫化物。
由于蛋白质的巯基，以国能形成化学计量为1:1，国能形成可以用来评估硫醇数目。
在变性剂的情况下，唯一能够找到的硫醇的反应，而残留的chaotropic代理人在场的总数减少胱氨酸目前可以衡量的。
经处理后减少的蛋白质与chaotropes及DTNB能够产生的半胱氨酸总数（半胱氨酸巯基加半胱氨酸-β-半胱氨酸）。
- -反应是敏感的碱性pH值（俄亥俄州）与RS竞争），酸性pH值（二硫化物可以打破），氧（R的巯基再氧化），以及温度（热致变色）。
因此，通常的反应是进行了过多的DTNB的蛋白质，在中性pH值固定的温度，erature，有时在厌氧条件。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
E L L M A N试剂法测定自由巯基和二硫键This manuscript was revised by the office on December 22, 2012E L L M A N试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。
ELLM试剂法测定自由巯基和二硫键
E L L M试剂法测定自由巯基和二硫键Prepared on 22 November 2020ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-根据文献记载，TNB的吸光系数在*103M-cm-~*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限来计算（吸光系数取*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=（*103LM-cm-*1cm）=*10-5mol/L*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为*10-5mol/L*18790g/mol=L=ml.我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在，其降解速度为%/h，在5.pH值，其降解速度为%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。
6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].试验方案主要材料：1.材料PEG-G-CSF批号：080229浓度mlG-CSF批号：080126浓度ml10k超滤膜PALL2.试剂SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自2-吸光度0.2来计算-*1cm）1.4*101.2.不3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12时，15min之内会完全降解[7,8]。
6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].试验方案主要材料：1.材料PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/mlG-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml小瓶。
NOB液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O3.仪器质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflexⅢ(厂内编号KC2007-011)Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039）Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003）反相柱：Symmetry C18 5um 300à高压液相仪器：，（UV/Visible Detector）试验过程：一、缓冲液替换PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM NH4HCO3，稀释中加入G-CSF+DTT相分离收样：SF+DTT相分离集到之间的交由崔文喜冻干四、ELLMAN试剂测定自由巯基由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。
ellman测巯基
埃尔曼的试剂，5,5'二硫代双- （二硝基苯甲酸），5克分子量：396.35CAS号：69-78-3使用半胱氨酸标准精确量化巯基程序材料的制备1 反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH 8.0，含有1 mM的EDTA 半胱氨酸标准品，分子量136.2 ：配成一定浓度梯度3 Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解DTNB程序1用反应缓冲液配制一定浓度的半胱氨酸工作液Standard Volume of ReactionBuffer Amount of Cysteine(M.W. = 136.2)Final ConcentrationA 100 ml 20.43 mg 1.5 mMB 5 ml 25 ml of Standard A 1.25 mMC 10 ml 20 ml of Standard A 1.0 mMD 15 ml 15 ml of Standard A 0.75 mME 20 ml 10 ml of Standard A 0.5 mMF 25 ml 5 ml of Standard A 0.25 mMG 30 ml 0 ml 0.0 mM (Blank)2 取若干试管，每管含50μL Ellman试剂和2.5mL的反应缓冲液。
3在各试管中加入250μL各浓度的标准工作液或待测物溶液注：对于未知的样品需要稀释，以便使其浓度标准曲线的工作范围之内（理想的浓度为0.1-1.0）。
4在室温混合和反应15分钟。
在412 nm处测量吸光度。
根据得到数值生成一个标准曲线，测定待测样品由标准曲线计算SH含量摩尔吸光系数的程序精确量化的巯基的材料的制备1 反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH 8.0，含有1 mM的EDTAEllman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解DTNB测量吸光度去若干试管，每管加入50μL的Ellman试剂溶液和2.5mL反应缓冲液。
加入250μL待测样品,空白添加250μL反应缓冲液在室温混合和反应15分钟。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
E L L M A N试剂法测定自由巯基和二硫键标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]E L L M A N试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。
自由巯基定量
自由巯基定量自由巯基是半胱氨酸中的硫原子形成的一种特殊结构。
自由巯基非常活泼，可以与其他蛋白质结合而改变其结构和功能，也可以与氧分子反应产生氧化物损害细胞和组织。
自由巯基定量是抗体等蛋白质类生物制品的一个重要检测项目。
例如，含有自由巯基的抗体的生物学功能有时比完整抗体会有所下降，甚至差距很大。
因此，快速响应并精确定量蛋白质类生物制品中的自由巯基，对产品的早期工艺开发和后期生产监控都至关重要。
自由巯基定量。
巯基和二硫键往往以活性基团形式参与酶催化、辅助因子结合以及蛋白质活性构象的维持。
自由巯基含量对蛋白的性质和存在方式有很大关系，是生物制药过程中质量检测的重要环节。
Ellman法是检测自由巯基浓度的常规方法，原理为DTNB试剂与游离巯基反应生成2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB-），若在中性或碱性pH条件下的水中可以离子化，生成TNB2-二价阴离子。
这种TNB2-离子呈现黄色，通过测定在412nm可见光吸光度就可以定量TNB2-，然后可以用半胱氨酸标准品定量巯基或者基于摩尔吸收率定量巯基的方法对自由巯基进行定量。
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ellman's试剂比色法测定食品中蛋白质的巯基和二硫键
ellman's试剂比色法测定食品中蛋白质的巯基和二硫键
Ellman's试剂比色法是一种常用于测定食品中蛋白质的巯基和二硫键的方法。
该方法基于Ellman试剂对巯基和二硫键的选择性反应，将其转化为可检测的黄色产物。
实验中，首先将样品加入含有Ellman试剂的反应液中，在一定的反应时间后，使用紫外可见分光光度计测量反应液的吸光度，从而确定样品中的巯基和二硫键含量。
Ellman's试剂比色法具有灵敏度高、操作简便等优点，是一种常用的蛋白质含硫官能团测定方法。
- 1 -。
Ellman's法测定鲜、冻鱼糜的巯基含量
Ellman's法测定鲜、冻鱼糜的巯基含量
林良美;朱礼艳;吴雅萍;林艺菁
【期刊名称】《现代食品》
【年(卷),期】2023(29)1
【摘要】鱼糜在冷藏过程中容易发生变性从而影响其凝胶强度。
为探究鲜、冻鱼糜变性程度,本文以鲜、冻鱼糜为原料,以巯基含量作为衡量蛋白变性指标,采用Ellman’s法对鱼糜巯基含量进行测定。
通过单因素条件优化试验,得到总巯基最佳测定条件为含EDTA的稀释液,DTNB的添加量为100μL,反应时间为45 min,反应温度为25℃;游离巯基最佳测定条件为含EDTA的稀释液,DTNB的添加量为200μL,反应时间为60 min,反应温度为40℃。
使用最优条件对鲜、冻鱼糜进行巯基含量测定,结果显示鲜鱼糜的总巯基和游离巯基的含量均高于冻鱼糜,这也在一定程度上证明了冻藏会导致鱼糜部分蛋白变性。
【总页数】4页(P222-225)
【作者】林良美;朱礼艳;吴雅萍;林艺菁
【作者单位】漳州职业技术学院食品工程学院;安井食品集团股份有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】TS254.7
【相关文献】
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ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
ELLMAN 试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm 没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB ）[1]。
TNB 2-在412nm 有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
SS NO 2NO 2-OOC-OOC+SH S -SNO 2NO 2-OOC-OOC+SDTNB TNB 2- 根据文献记载，TNB 的吸光系数在13.6*103M -cm -~14.25*103M -cm -之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。
A=εbc ，其中A 为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol ·cm ）]。
以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M -cm -），需要TNB 的浓度为c=0.2/（14.15*103LM -cm -*1cm ）=1.4*10-5mol/L (1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml. 我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN 试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1. EDTA 的适量加入有助于TNB 显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2. 在不同缓冲液中，TNB 的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm 的吸收也不3. 同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB 的分光光度法分析对SDS 很敏感[6]。
4. DTNB 随着pH 的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h ，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12时，15min之内会完全降解[7,8]。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
E L L M A N试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。
6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].试验方案主要材料：1.材料PEG-G-CSF批号：080229浓度4.32mg/mlG-CSF批号：080126浓度6.9mg/ml10k超滤膜PALL2.试剂SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。
单抗中自由巯基测定方法
单抗中自由巯基测定方法说实话单抗中自由巯基测定方法这事，我一开始也是瞎摸索。
当时就知道这个自由巯基测定肯定不简单，但也得硬着头皮上呀。
我试过好多方法呢。
最开始我就想按照那种常规的化学反应测定的套路来，感觉就是能找到一种试剂和自由巯基反应，然后看看生成物或者反应的现象来确定它的含量。
我找了好多化学试剂啊，就像那种在化学试剂的大仓库里来回乱翻似的。
我试过那种碘量法。
第一次做的时候，完全就是按照书上的步骤来的。
可是呢，怎么都得不到正确的结果。
后来才发现啊，是我对实验条件控制得不好。
就像是炒菜的时候，火候和调料的量没弄对，菜的味道就不对。
那碘量法对温度、pH值要求可严格了，稍微有点变化，整个反应就乱套了。
我还犯过一个特别低级的错误，就是在量取溶液的时候，没把滴管洗干净，残留的其他物质就影响了这个测定。
后来又试了埃尔曼试剂法。
这个方法在理论上是很靠谱的。
但是在实际操作中，我一开始对试剂的浓度把握得不好。
我就觉得好像是随便抓一把盐放进菜里，根本不知道多少才合适。
我是一次次慢慢地调整埃尔曼试剂的浓度，才慢慢摸索出比较合适的浓度范围。
而且这个反应的时间也需要精准控制，就像熬粥一样，时间短了不熟，时间长了就糊了。
如果反应时间过长，测出来的数据就不准了。
还有就是样品的处理环节。
我一开始没太在意这个，就直接拿单抗溶液就开始测。
结果可想而知，特别不准确。
后来我才知道，原来在测量之前得对样品进行预处理，就像洗水果要洗干净表皮的脏东西一样，得把一些可能干扰测定的杂质去掉。
我现在也不敢说就完全把这个自由巯基测定方法搞透了，但是目前我用埃尔曼试剂法，在严格控制实验条件、处理好样品的情况下，测定出来的结果还是比较靠谱的。
不过呢，对于具体的不同单抗或者不同实验要求，这个测定方法可能还得再调整。
反正就是个不断摸索的过程嘛。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-在/（摩TNB 1.4*10-51.2.3.4.5.之6.1.材料PEG-G-CSF批号：080229浓度4.32mg/mlG-CSF批号：080126浓度6.9mg/ml10k超滤膜PALL2.试剂SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。
20ug/小瓶。
加入20ul50mMNH4HCO3，pH7.8溶解，配成1ug/ul的酶液。
1MDTT刘春凤提供TFA（三氟乙酸）：TEDIALot#705114乙腈：FisherScientificLot#055848StarterkitforMALDI-TOFMS：BRUKERDALTONICS，LotNO2007-208241-001(includingα-Cyano-4-hydroxycinnamicacid(HCCA),peptidecalibrationstandard,proteincalibrationstandardI,proteincalibrationstandardⅡ)PEG肽段反相分离流动相A液：0.1%TFA/H2OB液：1）取取2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin10ul，往G-CSF中加入Trypsin10ul，同时各加入1ul1MDTT使终浓度为5mM。
另做一空白对照，往300ul50mMNH4HCO3中加入Trypsin15ul。
37℃反应，开始时间为。
三、肽段反相分离收样：TT离喜冻干四、温度：①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值A DTNB。
一种快速测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法[发明专利]
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(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510903038.4(22)申请日 2015.12.10G01N 21/31(2006.01)G01N 21/78(2006.01)(71)申请人河南工业大学地址450001 河南省郑州市高新区莲花街河南工业大学粮油食品学院(72)发明人郭兴凤 孙小红 陈复生 王瑞红白云(54)发明名称一种快速测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法(57)摘要本发明提供了一种利用标准曲线法快速测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法，包括以下步骤：(1)用缓冲溶液配制不同浓度的L-半胱氨酸标准溶液，添加显色剂显色后用分光光度计测定其在412nm 处的吸光度，并绘制其吸光度与L-半胱氨酸浓度的标准曲线；(2)先将面团用缓冲溶液溶解后取上清液，再加入显色剂显色后用分光光度计测定其吸光度，再依据第一步中所得的标准曲线计算得到面团中游离巯基的含量；(3)面团溶液用巯基乙醇还原二硫键，通过三氯乙酸沉淀，再用缓冲溶液复溶，测定总巯基含量，通过计算得到面团中二硫键含量。
本发明具有测量快速方便、精密度、准确度高，重现性好、设备比较简单、实用性强等特点。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 105548040 A 2016.05.04C N 105548040A1.一种快速测定面团中游离巯基和二硫键含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：a、绘制L-半胱氨酸标准曲线：用0.2M Tris-Gly缓冲溶液将L-半胱氨酸配制成不同浓度的标准溶液，测定不同浓度的L-半胱氨酸在412nm处的吸光度，以吸光度值为横坐标，对应的L-半胱氨酸标准溶液浓度为纵坐标，绘制L-半胱氨酸标准曲线。
b、测定面团中游离巯基含量：取新鲜小麦粉面团，研磨后溶解于0.2M Tris-Gly缓冲溶液中，离心得到上清液；上清液显色后于波长412nm处测定吸光度；通过L-半胱氨酸工作曲线计算得到面团中游离巯基的含量。
生物制品表征之自由巯基定量
生物制品表征之自由巯基定量巯基和二硫键在生物化学和分子生物学中扮演重要角色，它们常以活性功能基的形式参与酶催化、辅助因子结合以及蛋白质构象的维持。
研究巯基的数量和性质是获取特定结构信息的重要手段之一。
巯基定量常用的方法之一是利用Ellman法检测自由巯基浓度。
该方法的原理是将DTNB试剂与游离巯基发生反应，生成2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB-）。
在中性或碱性pH条件下，TNB-可以进一步离子化形成二价阴离子TNB2-。
该TNB2-离子呈现黄色，在412nm波长处可见光吸收，因此可以定量测定TNB2-的浓度。
通过使用半胱氨酸标准品或基于摩尔吸光系数的方法，可以对自由巯基进行定量分析。
北京百泰派克生物科技BTP基于该方法建立了自由巯基含量检测平台，获得CNAS实验室认可，可以准确测定样品中的自由巯基含量，为巯基相关研究提供有力支持。
BTP可提供全面的解决方案，包括方法学的建立、验证以及后续样品检测。
一、自由巯基定量的方法及原理：1. 使用半胱氨酸标准品进行定量。
该方法通过将不同浓度的半胱氨酸标准品和待测样品与DTNB试剂反应，然后测定在412nm处的吸光值。
通过使用半胱氨酸标准品的吸光值绘制标准曲线，将待测样品的吸光值代入标准曲线中，就可以得到自由巯基的浓度。
2. 基于摩尔吸光系数的定量。
该方法基于一个基本原理，即添加1摩尔的巯基会释放1摩尔的TNB。
通过测定在412nm处的可见光吸光度，可以定量测定TNB2-的浓度。
由于在不同缓冲液中消光系数不同，可以使用以下公式计算样品中自由巯基的浓度：消光系数 = 吸光度 / （比色皿宽度（cm） * 摩尔浓度（mol/L））。
表1 在不同缓冲液中的消光系数。
以上两种方法都可以准确测定样品中的自由巯基含量，根据实际需求选择适合的方法进行分析。
二、实验仪器。
紫外-可见分光光度计。
三、应用。
自由巯基的含量与某些蛋白质的性质和存在方式密切相关，影响抗体的生物学功能。
血清中总巯基与非蛋白巯基含量分别测定研究
血清中总巯基与非蛋白巯基含量分别测定研究
陈震阳;苏春云
【期刊名称】《卫生毒理学杂志》
【年(卷),期】1990(004)004
【摘要】巯基化合物在机体内具有重要的解毒功能,可与烯烃类、氢氰酸、醛类、环氧化物、砷和很多重金属起反应。
因此,在接触某些化学毒物后,巯基含量有可能降低,其中非蛋白巯基成分下降得更快。
巯基测定国外利用Ellman试剂反应法,国内最早是经亚硝化、重氮化,再与二盐酸N-(1-萘基)-乙烯二胺反应比色测定.后来陈震阳等人引进了Ellman反应的方法,周鼎、孙晋柏也都应用了该方法。
用极谱手段分析巯基,有较好的分析灵敏度,也有用HPLC作分析研究的。
【总页数】2页(P268-269)
【作者】陈震阳;苏春云
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R115
【相关文献】
1.一氧化碳中毒病人血清总巯基含量的动态观察 [J], 孔繁军;刘惠玲
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3.羊毛角蛋白中巯基含量的测定及其应用 [J], 陈光;袁久刚;向宇;范雪荣;王平;王强
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勇;崔胜云
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巯基化HA中巯基的取代度Ellman法详细步骤
首先制作半胱氨酸标准曲线，再用紫外分光光度法测定样品吸光度，计算出疏基含量，最终得出修饰率。
1、制作标准曲线：
缓冲液的配制：称取0.254gNaH2PO4与10.162gNa2HPO4于500ml容量瓶中，用
超纯水溶解，加入148.896mg的EDTA（乙二胺四乙酸），使其完全溶解，定容成500ml。
Ellman试剂的配制：称取4mgDTNB溶解在1ml缓冲液中。
取7只试管，分别在每只试管内加入50μL Ellman试剂与2.5ml磷酸钠缓冲溶液，混匀后，再在各试管内加入50μL标准溶液，混合均匀，在室温放置15min，以溶液G为空白，于波长412nm处测定半胱氨酸标准液的吸光度值(A)，如表9所示:
制作标准曲线如图10所示。
得标准曲线方程为y=0.1692x-0.0001，R2=09994，满足要求。
2、测量半胱氨酸透明质酸结合物的修饰率：
配制样品溶液：称取10.5mg半胱氨酸透明质酸结合物（含0.0274mmol伯醇羟基）用缓冲液溶解并定容至5ml；
配制空白对照溶液：称取10.5mg透明质酸（含0.0274mmol伯醇羟基）用缓冲液溶解并定容至5ml；
取2只试管，分别在每支试管内加入50μL Ellman试剂与2.5ml磷酸钠缓冲溶液，混匀后，再在各试管内加入50μL待测样品，混合均匀，在室温放置15min，以透明质酸溶液做空白，于波长412nm处测定待测样品的吸光度值(A)，如表10所示：
利用标准曲线和测得的样品溶液吸光度，计算样品中巯基的含量。
带入标准曲线计算：0.0385=0.1692x-0.0001，得出修饰率为3.5%（巯基数相对于透明质酸的双糖单位数）。
Ellman's试剂测定脱脂豆粕中巯基含量
Ellman's试剂测定脱脂豆粕中巯基含量
田其英;谌卉;华欲飞
【期刊名称】《食品与生物技术学报》
【年(卷),期】2008(027)006
【摘要】采用3种不同方法对干热处理后的脱脂豆粕进行处理,再加入Ellman's 试剂来测定脱脂豆粕中的巯基含量.通过理论和数据分析得到,方法二即脱脂豆粕、尿素-SDS溶液和Ellman's试剂相混合反应可用于测定脱脂豆粕中的巯基含量.【总页数】4页(P107-110)
【作者】田其英;谌卉;华欲飞
【作者单位】江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122;江南大学食品学院,江苏,无锡,214122
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.21
【相关文献】
1.混合试剂消化法测定豆粕中蛋白质 [J], 张爱民;甄霞
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4.血清中总巯基与非蛋白巯基含量分别测定研究 [J], 陈震阳;苏春云
5.Ellman试剂显色法测定药物中乙酰半胱氨酸含量研究 [J], 唐文力;李宜航
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E L L M A N试剂法测定
自由巯基和二硫键 YKK standardization office【 YKK5AB- YKK08- YKK2C- YKK18】
ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：
5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)
5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
S
S
NO2NO2
-OOC-OOC
+
SH
S-
S
NO2
NO2
-OOC
-OOC
+
S
DTNB TNB2-
根据文献记载，TNB的吸光系数在*103M-cm-~*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限来计算（吸光系数取*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=（*103LM-cm-*1cm）=*10-5mol/L *10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为*10-5mol/L*18790g/mol=L=ml.
我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：
1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm
的吸收也不
3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对
SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在，其降解速度为%/h，在
5.pH值，其降解速度为%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12
时，15min之内会完全降解[7,8]。
6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].
试验方案
主要材料：
1.材料
PEG-G-CSF 批号：080229 浓度ml
G-CSF 批号：080126 浓度ml
10k超滤膜 PALL
2.试剂
Sequencing Grade Modified Trypsin,Promega，lot#237826。
20 ug/小瓶。
加入20 ul 50mM NH4HCO3，溶解，配成1 ug/ ul的酶液。
1M DTT 刘春凤提供
TFA（三氟乙酸）：TEDIA Lot# 705114
乙腈：Fisher Scientific Lot# 055848
Starter kit for MALDI-TOF MS：BRUKER DALTONICS，Lot NO
2007-208241-001(including α-Cyano-4-hydroxycinnamic
acid(HCCA),peptide calibration standard,protein calibration standard
I,protein calibration standard Ⅱ)
PEG肽段反相分离流动相
A液：%TFA/H2O
B液：%TFA/90%乙腈/H2O
3.仪器
质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflexⅢ(厂内编
号KC2007-011)
Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039）
Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）
恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003）
反相柱：Symmetry C18 5um 300à *150mm， Lot NO 01，内部编号
1655
高压液相仪器：，（UV/Visible Detector）
试验过程：
一、缓冲液替换
PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM
NH4HCO3，pH 。
使用50mM NH4HCO3作为空白对照，样品用
50mM NH4HCO3稀释一倍后在DU-800 紫外分光光度计上测浓度。
PEG-G-CSF的浓度约ml，G-CSF的浓度约ml。
二、酶切处理
1）取37ul G-CSF,共400ug，加入 50mM NH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。
取 PEG-G-CSF,共400ug，加入152ul 50mM NH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。
2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin 10ul，往G-CSF中加入Trypsin 10ul，同时各加入1ul 1M DTT使终浓度为5mM。
另做一空白
对照，往300ul 50mM NH4HCO3中加入Trypsin 15ul。
37℃反应，开始时间为。
三、肽段反相分离
G-CSF Trypsin+DTT 反相分离
收样：
PEG-G-CSF Trypsin+DTT 反相分离
收集到之间的信号峰，交由崔文喜冻干
四、ELLMAN试剂测定自由巯基
由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。
根据我们所查找到得文献，采用的参数如下：
反应缓冲液：磷酸钠+ EDTA ，pH
温度：25℃
在这些参数下，摩尔吸收光系数为±*103LM-cm-[9].
1)标准曲线
用反应缓冲液配制10umDTT，20 umDTT，40 umDTT，80 umDTT，
160 umDTT，320 umDTT。
用缓冲液配制10mM 的ELLMAN试剂。
准备两个比色皿。
①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收
值，吸收值调节到0.
②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ul ELLMAN试剂到样品
管中，在412nm测定吸收值A DTNB。
③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A final。
④A412nm=A final-（）(A DTNB-A buffer),制作标准曲线。
2）样品巯基测定
①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.
②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ul ELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值A DTNB。
③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A final。
④A412nm=A final-（）(A DTNB-A buffer)，根据标准曲线测定巯基。
参考文献：
1) et Quantitative Analysis of Disulfide Bonds in Polypeptides and Proteins. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138, 18 1- I88 ( 1984).
2) W. L. ANDERSON AND D. B. WETLAUFER .A New Method for Disulfide Analysis of Peptides. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY ( 1975).
3) Ellman, ., Arch. Biochem. Biophys., 74, 443. (1958).
4) Peter Eyer,et al. Molar absorption coe?cients for the reduced Ellman reagent: reassessment.. Analytical Biochemistry 312 (2003) 224–227
5) W. L. ANDERSON AND D. B. WETLAUFER .A New Method for Disulfide Analysis of Peptides. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY ( 1975).
6)Sigma 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 产品说明书。
7) Riddles, . et al., Anal. Biochem., 94, 75 (1979)
8) Danehy, , Elia, . and Lavelle, ., J. Org. Chem., 36, 1003 (1971).
9) . Riddles, . Blakeley, B. Zerner, Ellmans reagent:5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)—a reexamination, Anal. Bio-chem. 94 (1979) 75–81.。