ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键审批稿

E L L M A N试剂法测定

自由巯基和二硫键 YKK standardization office【 YKK5AB- YKK08- YKK2C- YKK18】

ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：

5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)

5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。

S

S

NO2NO2

-OOC-OOC

+

SH

S-

S

NO2

NO2

-OOC

-OOC

+

S

DTNB TNB2-

根据文献记载，TNB的吸光系数在*103M-cm-~*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在之间。A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。以吸光度下限来计算（吸光系数取*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=（*103LM-cm-*1cm）=*10-5mol/L *10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为*10-5mol/L*18790g/mol=L=ml.

我们的条件可以达到这个检测限度。

ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：

1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。

2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm

的吸收也不

3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对

SDS很敏感[6]。

4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在，其降解速度为%/h，在

5.pH值，其降解速度为%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12

时，15min之内会完全降解[7,8]。

6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].

试验方案

主要材料：

1.材料

PEG-G-CSF 批号：080229 浓度ml

G-CSF 批号：080126 浓度ml

10k超滤膜 PALL

2.试剂

Sequencing Grade Modified Trypsin,Promega，lot#237826。20 ug/小瓶。

加入20 ul 50mM NH4HCO3，溶解，配成1 ug/ ul的酶液。

1M DTT 刘春凤提供

TFA（三氟乙酸）：TEDIA Lot# 705114

乙腈：Fisher Scientific Lot# 055848

Starter kit for MALDI-TOF MS：BRUKER DALTONICS，Lot NO

2007-208241-001(including α-Cyano-4-hydroxycinnamic

acid(HCCA),peptide calibration standard,protein calibration standard

I,protein calibration standard Ⅱ)

PEG肽段反相分离流动相

A液：%TFA/H2O

B液：%TFA/90%乙腈/H2O

3.仪器

质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflexⅢ(厂内编

号KC2007-011)

Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039）

Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）

恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003）

反相柱：Symmetry C18 5um 300à *150mm， Lot NO 01，内部编号

1655

高压液相仪器：，（UV/Visible Detector）

试验过程：

一、缓冲液替换

PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM

NH4HCO3，pH 。使用50mM NH4HCO3作为空白对照，样品用

50mM NH4HCO3稀释一倍后在DU-800 紫外分光光度计上测浓度。

PEG-G-CSF的浓度约ml，G-CSF的浓度约ml。

二、酶切处理

1）取37ul G-CSF,共400ug，加入 50mM NH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。

取 PEG-G-CSF,共400ug，加入152ul 50mM NH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。

2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin 10ul，往G-CSF中加入Trypsin 10ul，同时各加入1ul 1M DTT使终浓度为5mM。另做一空白

对照，往300ul 50mM NH4HCO3中加入Trypsin 15ul。

37℃反应，开始时间为。

三、肽段反相分离

G-CSF Trypsin+DTT 反相分离

收样：

PEG-G-CSF Trypsin+DTT 反相分离

收集到之间的信号峰，交由崔文喜冻干

四、ELLMAN试剂测定自由巯基

由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。

根据我们所查找到得文献，采用的参数如下：

反应缓冲液：磷酸钠+ EDTA ，pH

温度：25℃

在这些参数下，摩尔吸收光系数为±*103LM-cm-[9].

1)标准曲线

用反应缓冲液配制10umDTT，20 umDTT，40 umDTT，80 umDTT，

160 umDTT，320 umDTT。用缓冲液配制10mM 的ELLMAN试剂。

准备两个比色皿。

①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收

值，吸收值调节到0.

②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ul ELLMAN试剂到样品

管中，在412nm测定吸收值A DTNB。