ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键

ELLMAN试剂测定自由巯基

试验基于的原理：

5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自

2-

吸光度

0.2来计算-*1cm）

1.4*10

1.

2.

不

3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏

感[6]。

4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在

5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12

时，15min之内会完全降解[7,8]。

6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].

试验方案

主要材料：

1.材料

PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/ml

G-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml

小瓶。

NO

B液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O

3.仪器

质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflexⅢ(厂内编号

KC2007-011)

Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039）

Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）

恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003）

反相柱：Symmetry C18 5um 300à

高压液相仪器：，（UV/Visible Detector）

试验过程：

一、缓冲液替换

PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM NH4HCO3，

稀释

中加入

G-CSF

+DTT

相分离

收样：

SF

+DTT

相分离

集到

之间的

交由崔

文喜冻

干

四、ELLMAN试剂测定自由巯基

由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。

根据我们所查找到得文献，采用的参数如下：

反应缓冲液：0.10M 磷酸钠+0.001M EDTA ，pH 7.27

温度：25℃

在这些参数下，摩尔吸收光系数为14.15±0.09*103LM-cm-[9].

1)标准曲线

用反应缓冲液配制10umDTT，20 umDTT，40 umDTT，80 umDTT，160 umDTT，

320 umDTT。用缓冲液配制10mM 的ELLMAN试剂。准备两个比色皿。

①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收

值调节到0.

412nm final DTNB buffer

参考文献：

1)THEODOREW.T et al.Sensitive Quantitative Analysis of Disulfide Bonds in Polypeptides and Proteins. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138, 18 1- I88 ( 1984).

2) W. L. ANDERSON AND D. B. WETLAUFER .A New Method for

Disulfide Analysis of Peptides. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 67.493-502 ( 1975).

3) Ellman, G.L., Arch. Biochem. Biophys., 74, 443. (1958).

4) Peter Eyer,et al. Molar absorption coe?cients for the reduced Ellman reagent: reassessment.. Analytical Biochemistry 312 (2003) 224–227

5) for

8)

9)

Anal.