无菌检查法-2015版中国药典
2015年版《中国药典》无菌检查法解读
2015年版《中国药典》无菌检查法解读杨晓莉;李辉;绳金房;钱维清;胡昌勤【摘要】目的解读2015年版《中国药典》无菌检查法的主要增修订情况.方法对比2015年版《中国药典》无菌检查法与2010年版《中国药典》无菌检查法的主要差异.结果 2015年版《中国药典》无菌检查法在检查内容、检查方法、培养体系及质量控制理念等方面都作了较大修订.结论 2015年版《中国药典》将无菌检查法完善成为更加科学并与国际接轨的检查方法.【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2015(024)024【总页数】5页(P7-11)【关键词】无菌检查法;2015年版《中国药典》;无菌药品;培养体系;质量控制【作者】杨晓莉;李辉;绳金房;钱维清;胡昌勤【作者单位】陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;上海市食品药品检验所,上海 201203;中国食品药品检定研究院,北京 100050【正文语种】中文【中图分类】R954;R921.2无菌检查法是指用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的方法［1］，是药品微生物检查体系的重要组成部分，药品微生物是关系药品安全性的关键指标之一。
无菌药品的微生物污染是影响药品生产质量和引发临床不良事件的主要因素，近年来发生的“欣弗事件及刺五加事件”等严重药害事件都是无菌药品的微生物污染导致［2］。
目前，美国、欧盟、日本等国家或组织无菌检查法已协调一致［3］。
2010年版《中国药典》及之前版本收录的无菌检查法与国际通用的标准在检查理念、培养体系、方法要求等诸多方面有显著差异。
在国家药品安全规划与标准提高的目标下，2015年版《中国药典》借鉴国外药典先进技术经验，以新的控制理念为指导，结合我国国情对无菌检查法的检测范围及环境要求、培养体系、方法适用性、检查方法、偏差调查与过程控制等方面都做了较大修订，进一步完善了无菌检查法，修订后的无菌检查法正逐步与国际通用标准一致。
中国药典(2015年版)无菌检查法
中国药典(2015年版)无菌检查法是用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
如果供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。
只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。
薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器，无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45微米，直径约为50mm。
根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质，使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。
2015年版药典 无菌检查法
灵敏度检査 菌 种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代(从 菌 种 保 存 中 心 获 得 的 干 燥 菌 种 为 第 0 代 ），并 采 用 适 宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验 菌株的 生物 学特 性。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus ) C C M C C (B) 26 003〕 铜 绿 假 单 胞 菌 （Pseudomonas aeruginosa ) C C M C C ( B) 10 104〕 枯 草 芽 孢 杆 菌 仏 5)〔C M C C ( B ) 6 3 501〕 生 抱 梭 菌 sporogenes) C C M C C ( B ) 64 941〕 白 色 念 珠 菌 albicans) C C M C C ( F ) 98 001〕 黑 曲 霉 n ig e r) C C M C C ( F ) 98 003〕 苗 液 制 备 接 种 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单 胞 菌 、枯草 芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大 豆 胨 琼 脂 培 养 基 上 ，接 种 生 孢 梭 菌 的 新 鲜 培 养 物 至 硫 乙 醇 酸 盐 流 体 培 养 基 中 ，30〜 35°C培 养 18〜 2 4 小 时 ；接 种 白 色 念 珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖 琼 脂 培 养 基 上 ，20〜 25°C培 养 24〜 4 8 小 时 ，上 述 培 养 物 用 PH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9% 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 菌 数 小 于 lOOcfu( 菌 落 形 成 单 位 ）的 菌 悬 液 。接 种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上， 20〜25*C培 养 5〜7 天 ，加 人 3〜 5 m l含 a 0 5 % (m l/m l) 聚山 梨 酯 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 ，将 孢 子 洗 脱 。然 后 ，采 用 适 宜 的 方 法 吸 出 孢 子 悬 液 至 无 菌 试 管 内 ，用 含 0.05% ( m l/m l) 聚 山 梨 醋 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 孢 子 数 小 于 lOOcfu的 孢 子 悬 液 。 菌 悬 液 若 在 室 温 下 放 置 ，应 在 2 小 时 内 使 用 ；若 保 存 在 2〜8°C可 在 2 4 小 时 内 使 用 。黑 曲 霉 孢 子 悬 液 可 保 存 在 2 〜 8°C，在 验 证 过 的 贮 存 期 内 使 用 。 培 养 基 接 种 取 每 管 装 量 为 12ml的硫乙醇酸盐流体培 养 基 7 支 ，分 别 接 种 小 于 lO O c fu 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单胞菌、生 孢 梭 菌 各 2 支 ，另 1 支 不 接 种 作 为 空 白 对 照 ，培 养 3 天 ；取 每 管 装 量 为 9 m l的 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 7 支 ，分 别接种小 于lOOcfu的 枯 草 芽 孢 杆 菌 、白 色 念 珠 菌 、黑 曲 霉 各 2 支，另 1 支不接种作为空白对照，培 养 5 天 。逐 日观 察结果。 结 果 判 定 空 白 对 照 管 应 无 菌 生 长 ，若 加 菌 的 培 养 基 管 均 生 长 良 好 ，判 该 培 养 基 的 灵 敏 度 检 查 符 合 规 定 。
中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典的差异分析与讨论_潘友文
中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典的差异分析与讨论潘友文（罗氏/基因泰克，美国南旧金山，94080）2016年07月29日摘要目的：分析中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典无菌检查法的之间的差异性，为评价不同药典中无菌检查法的等效性提供参考。
方法：对无菌检查法的主要实验步骤和参数进行一对一比较，对有差异的步骤和参数进行科学论证和评价。
结果：中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典无菌检查法的主要参数和步骤是一致的，但中国药典无菌检查法还需要做阳性对照和厌氧需氧菌的额外培养。
并且，中国药典用大肠埃希菌代替美、欧、日药典中的铜绿假单胞菌参与无菌检查法的适用性试验。
结论：各药典的无菌检查法是等效的。
在不影响方法等效性的前提下，中国药典2015版无菌检查法在阳性对照和培养方法上还可以进一步简化。
关键词:无菌检查法；中国药典；美国药典；欧洲药典；日本药典Gap Assessment and Discussion on Sterility Tests in Chinese Pharmacopoeia 2015, United States Pharmacopoeia, European Pharmacopoeia, and Japanese PharmacopoeiaYouwen Pan (Genentech, a Member of Roche, South San Francisco, USA 94080)Abstract Objective：Gap assessment and discussion on the sterility test methods in Chinese Pharmacopoeia 2015 edition (CP2015), United States Pharmacopoeia (USP), European Pharmacopoeia (EP), and Japanese Pharmacopoeia (JP). Method：The test procedures and key parameters in the sterility test methods in different pharmacopoeia were compared step by step and the differences were identified. The identified differences are scientifically evaluated for their impact to the equivalence of the methods. Result：The sterility test method in CP2015 is largely harmonized with that in USP, EP and JP except for a few differences. Positive control and extra incubation bacteria are required in CP2015 only, and Escherichia coli is used in method suitability test in CP2015 while Pseudomonas aeruginosa is used in USP/EP/JP. Conclusion：The Sterility Test Methods in CP2015, USP, EP, and JP are equivalent. The method in CP2015 could be simplified more without compromising the validity, accuracy and reliability of the method.Key words：sterility test；Chinese Pharmacopoeia 2015；United States Pharmacopoeia；European Pharmacopoeia； Japanese Pharmacopoeia无菌检查法是用于检查药典规定的无菌物品是否被微生物污染的检测方法。
9-钱文静-2015版中国药典无菌检查法
（二）、无菌检查的特点和意义 由于抽样概率的限制，通过无菌检查发现产品 微生物污染的可能性极低，而当前坚持无菌检查的 意义在于： 产品上市前发现重大污染事件的最后一道关口； 通过无菌检查的执行情况可以窥视其无菌控制存 在的问题。
三、无菌检查法的有关概念和新理念
(三)、无菌检查的新理念 1.全过程控制
2014-9-16
(一) 2015年版无菌检查法主要修订的内容 3、培养基 ⑶灵敏度检查－ ②菌液制备用培养基的修订
2010年版 1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物 ——至营养肉汤培养基中或营养琼脂培 养基上； 2、接种生孢梭菌的新鲜培养物 ——至硫乙醇酸盐流体培养基中； 3、接种白色念珠菌的新鲜培养物 ——至改良马丁培养基中或改良马丁琼 脂培养基； 4、接种黑曲霉的新鲜培养物至 ——改良马丁琼脂斜面培养基上 ；
2010年版 1、硫乙醇酸盐流体培养基 ——金黄色葡萄球菌、铜绿 假单胞菌、枯草芽孢杆菌、 生孢梭菌 2、改良马丁培养基 ——白色念珠菌、黑曲霉 2015年版 1、硫乙醇酸盐流体培养基 ——生孢梭菌、金黄色葡萄球 菌、铜绿假单胞菌 2、胰酪大豆胨液体培养基 ——枯草芽孢杆菌、白色念珠 菌、黑曲霉
30
悬浮粒子最大允许数/立方米 洁 净 度 级 别 A级 B级 C级 D级 静态 ≥0.5 μm 3520 3520 352000
3520000
微生物监测的动态标准(1) 浮游 菌 cfu/ m3 1 10 100 200
沉降 菌 （ 90m m） cfu /4h(2)
动态 ≥5.0 μm 20 29 2900 ≥0.5 μm 3520 352000 3520000 ≥5.0 μm 20 2900 29000
2014-9-16
中国药典2015版-微生物限度检查解析
*
*
注*：限度未做统一规定。
控制菌
*
不得检出沙门菌 （10g） ； 耐胆盐革兰阴性菌应小 于104（1 g）
执行及制定标准的注意事项
执行范围： 生产、贮存、销售过程中的药品 药用原料、辅料 中药提取物、中药饮片 新药标准 进口药品标准复核 药品质量考察及仲裁
标准执行的注意事项： 药典标准出处：中国药典通则项下【微生
或菌株已无使用需要时应及时灭菌销毁”； • 管理：应有程序文件，包括申购、操作、转种传代、纯度特性确认记录，注明名称、标准号、
接种日期、代数、培养基和培养条件、保藏的位置和条件等。
环境
• 实验室的布局和运行 • 环境监测 • 清洁、消毒和卫生
设备
建立仪器设备管理制度 清洁保养制度 操作规程 使用、监控的记录
器、天平、量器等等） 3.供应商评估与现场审计 使用正确的、有严格质量保障的产品
《中国药典》2015年版-微生物限度标准修订解析
标准修订内容 修订思路1 《中国药典》2010年版一、二、三部限度标准的相关内容合并。 修订思路2 参考EP7.0，USP35，JP X V标准，修订中国药典的微生物限度标准。
胆盐革兰阴性菌应小102
不含豆豉、神曲等发酵 5×102 原粉
102
液体口服给药
制剂
含豆豉、神曲等
发酵原粉
103
102
不得检出大肠艾希菌 不得检出沙门菌
耐胆盐革兰阴性菌应小 于 101
固体局部给药 表皮或粘膜不完整
104
102
不得检出金黄色葡萄球
制剂
菌、
表皮或粘膜完整
103
102
铜绿假单胞菌 ；阴道、
药品微生物检验的现状与发展
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑶油脂类供试品
• 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶 解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌 聚山梨酯 80或其他无抑菌性的无菌表面 活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般 不超过 40℃（特殊情况下，最多不超过 45℃），小心混合，若需要可在水浴中进 行，然后加入预热的稀释液使成 1∶10供 试液，保温，混合，并在最短时间内形成 乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面 活性剂的稀释液进一步 10倍系列稀释。
– 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数 法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
• 菌数报告规则
– 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1 报 告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 供 试品）,或﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
《中国药典》2015版-抑菌效力检查法
培养基的制备 胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、 沙氏葡萄糖琼脂培养基 照无菌检查法（通则 1101）制备。 培养基的适用性检查 抑菌效力测定用培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱 水培养基或按处方配制的培养基均应检查。 菌种 试验所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保藏中心获得的冷 冻干燥菌种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株 的生物学特性。培养基适用性检查的菌种及新鲜菌体培养见表 1。
匀，凝固，置 30～35℃培养不超过 3 天，计数；分别接种不大于 100cfu 的白色
念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备 2 个平皿，
混匀，凝固，置 20～25℃培养不超过 5 天，计数；同时，用对应的对照培养基
替代被检培养基进行上述试验。
结果判定 若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上菌落平均数
表 1 培养基适用性检查、方法适用性试验、抑菌效力测定用的试验菌培 养条件
试验菌株
试验培养基aphylococcus aureus) 〔CMCC(B)26 003〕
铜绿假单胞菌
(Pseudomonas aeruginosa） 〔CMCC(B)10 104〕
大肠埃希菌
1121 抑菌效力检查法
抑菌剂是指抑制微生物生长的化学物质，有时也称防腐剂。抑菌效力检查法 系用于测定灭菌及非灭菌制剂的抑菌活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也 可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定。
如果药物本身不具有充分的抗菌效力，那么应根据制剂特性（如水溶性制剂） 添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏或使用过程中可能发生的微生物污染 和繁殖使药物变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。
2015版中国药典关于微生物检验有关变化的解读
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
目
录
1 2
3
概况及背景 标准修订内容
执行及制定标准的注意事项
4 5
标准与方法 国外药典的标准收载情况
一、概况及背景
参照欧、美药典中“微生物限度”相关内容的组织形 式，将原“微生物限度检查法”修订后拆分为3个附录， 并在药典会网站上公示： -1、非无菌产品微生物检查：微生物计数法（一、二、 三部相同） -2、非无菌产品微生物检查：控制菌检查法（一、二、 三部相同） -3、药品微生物限度标准（一部；二部同三部）
在2005版chp收载微生物限度标准的基 础上，眼用制剂修订为无菌要求；阴 道、尿道给药制剂增加白色念珠菌 的控制；增加了贴膏剂的控制菌检查。
二、标准修订内容
1、药典标准的修订思路 （1）三部药典的合并 现行2010版《中国药典》三部分在微生物限度标准有 重叠，一部多于二部、三部。
一部标准为 基础
二、标准修订内容
非无菌药用原料及辅料微生物限度标准中药提取物及中药饮片微生物限度标准
制剂类型
TAMC
TYMC
控制菌
药用原料及辅料
103
102
未统一要求
中药提取物
103
102
未统一要求
中药饮片
未统一要 未统一要 求 求
不得检出沙门菌(10g)，耐胆盐 的阴性菌应小于104(1g)
二、标准修订内容
（4）实验环境的重大修订 ①无菌检查环境洁净度规定 GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准 无菌检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内或隔离系统中进行。 2015年版：应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区 域内或隔离系统中进行。 ②微生物限度检查环境洁净度规定 微生物限度检查： 2010年版：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流 空气区域内进行。 2015年版：应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不 低于B级单向流空气区域内进行。
2015年版中国药典微生物限度检查法
1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要 求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境 、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进 行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检 出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监 测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜 选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为 菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最 高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供 试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低 稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小 于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌 数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进 一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也 可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株 试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌 〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌 〔CMCC（B)10 104〕 枯草芽孢杆菌 〔CMCC(B) 63 501〕 白色念珠菌 〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培 养基 【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时
无菌检测方法
四川乐至贵均卫生材料有限公司医疗器械产品无菌检测方法1.目的建立无菌检测标准规程，对灭菌后的医疗器械产品进行无菌检测，以确定灭菌的有效性。
2.范围本规程适用于本公司对医疗器械产品的无菌检测。
3.依据《中国药典》2015版4.设备、器皿、药品的准备4.1 设备的准备电子天平、干热灭菌箱、高压灭菌箱、洁净工作台、放大镜、移液枪、电热培养箱、霉菌培养箱、冰箱、斜口钳、接种环、酒精灯4.2 器皿的准备锥心瓶（500ml）、烧杯（1000ml）、试剂瓶（60ml）、量筒（50ml、1000ml）、培养皿（Ф90mm ×15mm）、斜口钳、玻璃棒。
4.3 药品的准备硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、纯化水、pH7.0 无菌氯化钠溶液。
5.器皿的清洗将所需的锥形瓶、烧杯、试剂瓶、培养皿、玻璃棒放入超声波清洗机中用纯化水清洗两次，每次15分钟，将清洗完的器皿在180℃条件下进行干热灭菌2小时。
6.取样按灭菌批次或者生产批次进行取样，随机抽取同一型号的产品4件作无菌检测样品7.培养基的制备7.1 硫乙醇酸盐流体培养基的制备取15g硫乙醇酸盐流体培养基和1000ml纯化水于烧杯中混合，加热至微沸（注意加热过程中要不断地搅拌，使其混合均匀）用棉花塞塞紧复用无尘布和绳子绑好后转移至高压灭菌锅内灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间30分钟。
灭菌后摇均，冷却至45℃待用。
7.2 胰酪大豆胨液体培养基的制备取15g胰酪大豆胨和1000ml纯化水于烧杯中混合，操作方法同6.1。
8. 培养基灵敏度检查8.1 菌种的要求培养基灵敏度检查所用的菌株（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）传代次数不得超过5代。
8.2 菌液的制备接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基上，30-35℃培养24小时；接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基上，20-25℃培养24小时。
将上述经24小时培养后的培养物用0.9﹪无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu(菌落形成单位)的菌悬液。
中国药典 无菌检查法
中国药典无菌检查法在当今的医药行业中，无菌检查法是确保药品安全性和有效性的重要手段。
中国药典作为我国药品质量标准的权威法规，对于无菌检查法的规定和实践具有极其重要的指导意义。
本文将详细阐述中国药典中无菌检查法的相关内容，以期为药品生产和质量控制提供有益的参考。
一、中国药典无菌检查法概述中国药典无菌检查法是针对药品中微生物污染进行检查和评估的标准方法。
该方法通过对样品进行适当的处理、培养和观察，以确定样品中是否存在微生物。
无菌检查法对于保证药品质量和安全性具有至关重要的作用，因为微生物污染可能导致药品失效、不良反应甚至危害患者健康。
二、无菌检查法的实践操作1.样品采集与处理在进行无菌检查之前，必须对样品进行适当的采集和处理。
采集的样品应当具有代表性，能够反映药品的整体质量。
处理过程中应避免交叉污染和外界微生物的引入。
2.培养基的选择与制备无菌检查中使用的培养基必须符合中国药典的规定，具有良好的选择性、灵敏度和特异性。
培养基的制备过程需严格按照配方进行，确保质量和稳定性。
3.接种与培养将处理后的样品接种于适宜的培养基中，按照规定的温度和时间进行培养。
接种过程中要保证无菌操作，防止污染。
4.观察与结果判定在规定的培养期结束后，对培养基进行仔细观察，记录任何可见的微生物生长情况。
根据观察结果进行无菌检查的判定，确定药品是否符合无菌要求。
三、无菌检查法的质量控制为确保无菌检查法的准确性和可靠性，必须加强实验室的质量控制。
这包括对实验人员的培训、实验设备的维护与校准、实验环境的监控以及实验过程的规范化和标准化。
同时，应定期进行内部审核和外部质量评估，以确保无菌检查法的执行符合中国药典的要求。
四、结论与展望无菌检查法作为药品质量保证的重要环节，在医药行业中具有举足轻重的地位。
中国药典作为我国药品质量的法规性文件，对于无菌检查法的规定和实践提供了明确的指导。
通过深入理解和严格执行中国药典的相关要求，我们能够更好地保障药品的安全性和有效性，为公众健康事业做出积极贡献。
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8. 附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准*未做统一规定。
(1)．“—”为不得检出。
(2)．目测霉变者以不合格论。
说明：1．“—”为每100 cm中不得检出。
2．目测霉变者以不合格论。
3．“无”为标准依据或无相应规定。
2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。
2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。
《中国药典》2015年版通则
0100本制剂通则中原料药物系指用于制剂制备的活性物质，包括中药、化学药、生物制品原料药物。
中药原料药物系指 饮片、植物油脂、提取物、有效成分或有效部位》化学药原料药物系指化学合成、或来源于天然物质或采用生物技术获 得的有效成分（即原料药）；生物制品原料药物系指生物制品原液或将生物制品原液干燥后制成的原粉。
本制剂通则中各剂型、亚剂型并不适用于所有原料药物，而应取决于原料药物特性、临床给药需求以及药品的安 全性、有效性和稳定性等。
本制剂通则适用于中药、化学药和治疗用生物制品（包 括血液制品、免疫血清、细胞因子、单克隆抗体、免疫调节 剂、微生态制剂等）。
预防类生物制品，应符合本版药典三部相应品种项下的有关要求。
除另有规定外，生物制品应于2〜8X：避光贮存和运输。
片剂系指原料药物或与适宜的辅料制成的圆形或异形的 片状固体制剂。
中药还有浸膏片、半浸膏片和全粉片等。
片剂以口服普通片为主，另有含片、舌下片、口腔貼 片、咀嚼片、分散片、可溶片、泡腾片、阴道片、阴道泡腾 片、缓释片、控释片、肠溶片与口崩片等。
含片系指含于口腔中缓慢溶化产生局部或全身作用的片剂。
含片中的原料药物一般是易溶性的，主要起局部消炎、杀菌、收敛、止痛或局部麻醉等作用。
舌下片系指置于舌下能迅速溶化，药物经舌下黏膜吸 收发挥全身作用的片剂。
舌下片中的原料药物应易于直接吸收，主要适用于急症 的治疗。
口腔貼片系指粘贴于口腔，经黏膜吸收后起局部或全身作用的片剂。
口腔貼片应进行溶出度或释放度(通则0931)检查。
咀嚼片系指于口腔中咀嚼后吞服的片剂。
咀嚼片一般应选择甘露醇、山梨醉、蔗糖等水溶性辅料作填充剂和黏合剂。
咀嚼片的硬度应适宜。
分散片系指在水中能迅速崩解并均勻分散的片剂。
分散片中的原料药物应是难溶性的。
分散片可加水分散 后口服，也可将分散片含于口中吮服或吞服。
分散片应进行溶出度（通则0931)和分散均匀性检查。
可溶片系指临用前能溶解于水的非包衣片或薄膜包衣片剂。
中国药典2015版无菌检查方法适用性试验（直接接种法）
中国药典2015版⽆菌检查⽅法适⽤性试验（直接接种法）*********公司*********产品⽆菌检查⽅法适⽤性试验1、样品信息2、培养基及试剂3、菌种基本信息：4、菌液制备：2.1接种⾦黄⾊葡萄球菌、⼤肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨培养基中或胰酪⼤⾖胨脂培养基上，30～35℃培养18～24⼩时，培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.2接种⽣孢梭菌的新鲜培养物⾄硫⼄醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24⼩时，培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.3接种⽩⾊念珠菌的新鲜培养物⾄沙⽒葡萄糖液体培养基或沙⽒葡萄糖琼脂斜⾯培养基上，20～25℃培养24～48⼩时，培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.4接种⿊曲霉菌的新鲜培养物接种⾄沙⽒葡萄糖琼脂斜⾯培养基上，20～25℃培养5～7天，加⼊3～5ml含0.05%（ml/ml）聚⼭梨酯80的0.9%⽆菌氯化钠溶液，将孢⼦洗脱。
然后，采⽤适宜的⽅法吸出孢⼦悬液⾄⽆菌试管内，⽤含0.05%（ml/ml）聚⼭梨酯80的0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌孢⼦悬液。
6、⽆菌检查直接接种法⽅法适⽤性试验6.1供试品制备：描述供试品制备过程（主要为每个样品的取样部位及⽤量）。
6.2试验组：取装量为 ml硫⼄醇酸盐流体培养基，接种规定的供试品量（同6.1），并接种⼩于100cfu的⾦黄⾊葡萄球菌；⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌、枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉按照上述步骤操作，其中⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌加⼊硫⼄醇酸盐流体培养基，枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉加⼊胰酪⼤⾖胨液体培养基。
6.3对照组：取装量为 ml硫⼄醇酸盐流体培养基3管，分别接种⼩于100cfu的⾦黄⾊葡萄球菌、⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌；取相同装量的胰酪⼤⾖胨培养基3管，分别接种⼩于100cfu枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉。
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无菌检查法-2015版中国药典无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。
培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1. 硫乙醇酸盐流体培养基酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1% 刃天青溶液1.0ml硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g(或硫乙醇酸) （0.3 ml) 纯化水1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。
2. 胰酪大豆胨液体培养基胰酪胨17.0g 氯化钠 5.0g大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0g 磷酸氢二钾2.5g葡萄糖（一水合/无水）2.5g （2.3g）纯化水1000mL除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.2，加入葡萄糖，分装，灭菌。
胰酪大豆胨液体培养基置20～25℃培养。
3. 选择性培养基按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。
4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）胨10.0g 氯化钠5.0g葡萄糖 5.0g 水1000 ml牛肉浸出粉3.0g除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.2±0.2，分装，灭菌。
5. 胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪胨15.0g 氯化钠5.0g大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g 琼脂15.0g纯化水1000ml除琼脂外，取上述成分，混合。
微温溶解，调节pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.2，加入琼脂，加热溶化后，摇匀，分装，灭菌。
6.沙氏葡萄糖液体培养基动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物10.0g葡萄糖20.0g 纯化水1000mL除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为5.6±0.2，加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
7. 沙氏葡萄糖琼脂培养基动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物10.0g葡萄糖40.0g 纯化水1000mL琼脂15.0g除葡萄糖、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后在25℃的pH值为5.6±0.2，加入琼脂,加热溶化后, 再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
培养基的适用性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。
本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
无菌性检查每批培养基随机取不少于5 支（瓶），置各培养基规定的温度培养14 天，应无菌生长。
灵敏度检查菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养24～48 小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100CFU（菌落形成单位）的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7 天，加入3～5ml 含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数小于100CFU 的孢子悬液。
菌悬液在室温下放置应在2 小时内使用，若保存在2～8℃可在24 小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
培养基接种取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基7 支，分别接种小于100CFU 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2 支，另1 支不接种作为空白对照，培养3 天；取每管装量为9ml 的胰酪大豆胨液体培养基7 支,分别接种小于100CFU 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接种作为空白对照，培养5 天。
逐日观察结果。
结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
1.0.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH 值至7.1±0.2，分装，灭菌。
2．pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
3. 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液(如0.9%无菌氯化钠溶液)。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
方法适用性试验当进行产品无菌检查法时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。
方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。
对每一试验菌应逐一进行方法确认。
菌种及菌液制备除大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。
大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。
薄膜过滤法取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU 的试验菌，过滤。
加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。
另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。
置规定温度培养3～5 天，各试验菌同法操作。
直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6 管，分别接入小于100CFU 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2 管，取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6 管，分别接入小于100CFU 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 管。
其中1 管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1 管作为对照，置规定的温度培养3～5 天。
结果判断与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。
如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。
方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。
供试品的无菌检查无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。
只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。
供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。
无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
检验数量检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。
除另有规定外，出厂产品按表1 规定；上市产品监督检验按表2 规定。
表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。
检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g 或ml）。
除另有规定外,供试品检验量按表3 规定。
若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。
采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。
阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。
阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100CFU，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。