第二章组织培养基本技术
组织培养基本技术与基本知识
组织培养基本技术与基本知识2005.10.15目录前言------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------5 第一章基本技术---------------------------------------------------------------------------------------------------6 第一节原代细胞单层静止培养的设备与器材准备--------------------------------------------------------------6一、设备与器材二、器材的清洗第二节原代细胞单层旋转瓶培养的设备与器材准备------------------------------------------------------11一、设备与器材二、器材的清洗第三节组织培养用水的制备和各种溶液的配制----------------------------------------------------------12一、水（双蒸水、三蒸水或去离子水）二、汉克氏（Hanks）原液和汉克氏液三、0.5%水解乳蛋白----汉克氏液（简称乳汉液）的配制四、7.5%的碳酸氢钠（NaHCO3）配制五、胰蛋白酶的配制六、犊牛血清的制备七、每毫升含1万单位双抗（青霉素与链霉素）的配制八、每毫升5万单位制霉菌素的配制九、营养液与维液的配制第四节器物与溶液的包装、灭菌和无菌操作-------------------------------------------------------------16一、包装与灭菌二、无菌操作第五节无菌检验---------------------------------------------------------------------------------------------------23 第六节原代单层细胞的制备------------------------------------------------------------------------------------24 第七节细胞计数和染色------------------------------------------------------------------------------------------26一、细胞计数二、细胞染色第八节培养细胞的观察---------------------------------------------------------------------------------------27一、培养细胞的生长和繁殖二、在单层细胞培养中细胞的形态观察第九节原代单层细胞培养中应注意的问题------------------------------------------------------------------29一、应注意的问题二、可能会出现的问题第二章在组织培养的细胞中病毒的接种与毒价的滴定（测定）--------------------------------------31 第一节在组织培养的细胞上病毒的接种方法--------------------------------------------------------------32一、用敏感细胞分离病毒二、病毒在敏感细胞中的传代三、接种后细胞病变（CPE）的观察与判定标准第二节在组织培养细胞中病毒毒价的测定----------------------------------------------------------------34一、病毒毒价测定操作方法二、半数细胞病变终点（TCID50）计算第三章基本知识-------------------------------------------------------------------------------------------------41 第一节影响离体细胞生长繁殖的一些因素-----------------------------------------------------------------41一、温度二、氢离子浓度三、水四、渗透压与无机盐类A、细胞所需无机盐离子的作用B、无机盐类对平衡渗透压和维持pH的作用五、气体六、细胞接种浓度七、容器转动速度第二节细胞的营养物质-----------------------------------------------------------------------------------------49一、碳水化合物二、氨基酸和水解乳白蛋白三、血清（一）、血清的作用（二）、与血清有关的几个问题四、维生素第三节消化液的应用--------------------------------------------------------------------------------------------56一、胰蛋白酶二、乙烯二胺四乙酸（Versene，EDTA）三、胶原酶四、P ronase第四节抗菌素的应用--------------------------------------------------------------------------------------------61一、青霉素二、链霉素第五节传代细胞与细胞悬浮培养-----------------------------------------------------------------------------62一、传代细胞二、细胞悬浮培养第四章附录--------------------------------------------------------------------------------------------------------65 附录Ⅰ猪瘟兔化弱毒细胞冻干疫苗（旋转瓶培养）制造及检验办法-----------------------65 附录Ⅱ禽苗的鸡胚细胞苗试制-------------------------------------------------------67 附录Ⅲ应用驴胎肺等二倍体细胞生产马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原操作方法—---------68前言为了适应我国畜牧业的发展，防止各种畜、禽流行病的爆发和流行，需要生产大量的家畜家禽的各种疫苗，而目前不少疫苗的生产尚未探取组织培养的方法，存在着成本高，费人力，劳动强度大，有些疫苗的原料比较难于得到或需要耗费较多的家畜或家禽，例如狂犬疫苗的生产，目前还是采用绵羊的脑子来制造，一只羊只有脑子能利用。
植物组织培养基本技术
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2.细胞分裂素（CTK）： （1）作用： ①促进细胞分裂； ②诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长； ③抑制顶端优势，延缓离体组织衰老； ④对根的生长一般起抑制作用 （2）常用的细胞分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）
等。 （3）使用浓度：一般0.1~10.0mg/L
（4）有些生长调节物质不溶于水，2,4-D 、NAA 、 IAA 、GA3等在配制时可先用少量95%的乙醇溶 解。KT、6-BA等可先溶解于少量1mol/L的盐酸 中。叶酸则可先用少量稀氨水溶解。
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3、配制好的母液贴上标签 标签：注明母液的名称、配制倍数、配制日期、配制人员及配1L培养基时
应移取的量。 注意：母液要低温保存，储存时间不易过长，有沉淀或霉菌，则不可再用。
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（三）有机营养物质： 培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。 为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成 分主要有以下几类：
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1、碳水化合物——碳源： 可作为碳源的有蔗糖，葡萄糖和果糖最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用浓度
在2%—5%，常用3%（30g/L），即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用 2.5%。
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（三）计算： 1.欲配制1L MS＋6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L＋3%蔗糖+0.6%琼脂培养基，已知
MS母液已经配制完成，其浓度分别是：大量元素10倍，微量元素200倍，铁盐 100倍，有机物500倍， 1.0mg/ml 6-BA，0.1mg/ml NAA。 （1）计算各种母液、蔗糖和琼脂的用量 （2）叙述培养基的配制过程
第二章植物组织培养基本操作
教学目的：了解植物组织培养培养的培养基种类、成分及其特点，学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条件，以及炼苗移栽基本方法。
职业技能教学点：具有植物组织培养基本操作程序的认知。
能够识别各类培养基特点，熟悉MS培养基成分；具有制作培养基能力，具有选择外植体、表面灭菌、无菌接种等基本能力；具有植物组织培养条件控制基本能力；有进行组培苗驯化练苗的基本能力。
教学时间：10学时教学重点：各类培养基特点，固体培养基制作，外植体的选择及表面灭菌，外植体培养条件，组培苗驯化原则及常规移栽方法。
教学难点：各类培养基特点，培养基制作及高压灭菌操作，外植体的表面灭菌，外植体培养中易出现的问题及其解决办法，试管苗的特点。
教学内容：第一节培养基成分、种类及特点植物生长必需16种基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。
离体培养条件下，各种元素主要从培养基中获得：H 和O来源于水，C来源于添加的糖类，其它矿质元素来源于组成培养基的无机盐。
培养基是根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。
一、培养基的成分不同植物组织器官所需要的营养条件不完全一样，培养基营养成分也有差异，但总的来说，培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调节剂三大基本组成成分。
1、无机盐类离体组织生长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两类：大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十-几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
微量元素—植物所需元素的浓度小于10-5～10-7mol/L，Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。
除C、H、O外，其它矿质元素通常以一定浓度的无机化合物形式，按一定比例配制而成，溶于水中以离子态被吸收，N有硝态氮KNO3和铵态氮（NH4）2SO4两类提供。
2、有机化合物培养基中只有无机盐叫做基本培养基，为使培养物更好的生长，还需添加有机成分，常用有糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等。
植物组织培养基本技术
—
Fe SO4 ·7 H 2 O N a - Fe - E D T A FeCl3 · 6 H 2 O Fe2 ( SO 4 ) 3 N a2 - ED T A
K2 H P O4
M nSO 4 · 4 H 2 O ZnSO 4 · 7 H2 O NiCl2 · 6 H 2 O Zn ( 螯合体 )
MS
选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础 。 根据营养水平不同 , 培养基分为基本培养
组织 培 养 中 常 用 的 培 养 基 主 要 有 M S 、 W hite、 N6 、 B5 、 Heller 、 N it sch 、 M iller 和 SH
表3-1 几种常用培养基的配方 ( 1974 ) 2 830 463 — — — N6 ( 1968 ) 2 527 5 134 — — — B5 ( 1953) — — Heller ( 1972) 720 — 950 — Nitsc h 单位 : mg / L
中常用的氨基酸有丙氨酸 、 甘氨酸 、 谷氨酰胺 、 丝氨酸 、 酪氨酸 、 天冬酰胺 , 以及多种氨基酸
有机氮源 , 对植物外植体的芽 、 根 、 胚状体的生长 、 分化均有良好的促进作用 。 植物组织培养
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培养基及其配制
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丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体或不定芽的分化 ; 半胱氨酸可作为抗氧化剂 , 防止培养材 料褐化 , 延缓酚氧化 。 另外 , 植物组织培养中还加入一些天然的 有机物 , 如椰 子乳 ( CM ) 、 酵母 提取液 ( YE ) 、
( 7) 铁
( 6) 硫
官发育和提高抗逆性 。 缺锌时 , 叶子变黄 , 或出现白斑 , 叶子小 。 ( 10) 铜 叶缘向上卷曲黄化 , 变厚变脆 ; 顶芽死亡 。 ( 12) 钼 ( 13) 钴 ( 二) 有机养分 ( 11) 硼
植物组织培养ppt课件
1948年：Skoog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解 除生长素对芽生长的抑制作用。
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1952-1953年：美国科学家Steward F.C. 用胡萝卜根的细胞悬浮 培养，发现单个细胞能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完 整植抹，证实了植物细胞全能性学说。
1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获 得无病毒大丽花植株。
1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一 片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。
1956年：Miller分离出Kinetin，Kinetin/激动素
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组织培养的奠基人
植物组织培养是由于人为控制培养条件，
根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同
的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比
较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然植 物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于 植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说
成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗
或脱病毒种苗。
细胞全能性的高低：
受精卵>生殖细胞>体细胞
植物细胞>动物细胞
分化程度低的细胞>分化程度高的细胞
细胞分化的实质：基因的选择性表达。
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②全能性的表达
少数体细胞在发育过程中可能丢失一部分遗传物质, 因而失去全能性。如筛管细胞,它在发育过程中失去细胞 核,因而没有全能性。
目前还无法使所有的离体植物细胞都实现其全能性。
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3、 迅速发展阶段（1960-1980）
第2章植物组织培养的设备与培养条件
试管——特别适合于用少量培养基及试验各种不同配方 时选用，在茎尖培养及花药和单子叶植物分化长苗培 养时更显方便。有圆底的和平底的两种。 三角瓶——是植物组织培养中最常用的培养器皿，适合 于各种培养，固体或液体、大规模或小规模都行。 其优点是：采光好、瓶口较小不易失水和污染。 L形管和T形管——为专用的旋转式液体培养试管。 培养皿——适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培 养和无菌发芽。 角形培养瓶和圆形培养瓶——适于液体培养用。 果酱瓶或罐头瓶——常用于试管苗大量繁殖，200ml500ml规格 太空玻璃杯——可机械化洗瓶，适于工厂化生产
（3）磨口瓶 用于存装试剂、分装母液。 （4）滴瓶 盛装酸液（1N盐酸和1N氢氧化钠） （5）锅具：配置和熬制培养基
2.2.1.3计量容器 （1）容量瓶：培养基配置时定容 （2）移液管和移液枪 （3）量筒、量杯
2.2.2器械用具 组织培养所需要的器械用具，可选 用医疗器械和微生物实验所用的 器具。常用的器械用具如图： （1）镊子：可用于接种和转移植 物材料 （2）剪刀：一般在转移植株时用。 （3）解剖刀： （4）显微接种工具：包括接种针、 接种钩及接种铲，用来接种花药 或转移植物组织。
（1）功能：植物材料的灭菌、接种以及培养 物的继代转接等。 （2）仪器设备及用品： 超净工作台，紫外灯、小推车、搁架、接种 工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通 剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌 过滤器等），紫外灯，换气扇，空调。
超净工作台
接种工具
无菌操作室消毒的方法： 照射灭菌： 紫外灯， 15—20分钟（接种前） 熏蒸灭菌 ：甲醛加高锰酸钾（定期）（一般 每立方米用甲醛2mL、高锰酸钾1g。 ） 超净工作台的消毒方法： 每次接种前，用70%酒精药棉擦拭台面。
《组织培养基本技术》PPT课件
整理课件
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5、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养 基的培养器皿，放进工作台。
6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的 酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。
7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。
8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口 各部分都烧到。
与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受 到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养 基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体 部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影 响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个 重要问题。
超净工 作台
紫外灯 照射
70%—75% 的酒精擦洗
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空气消 毒灭菌
培养材料 的接种
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（6）外植体灭菌
流水冲洗10—20min 或更长时间
0.1%—0.2%氯化汞 液中浸泡10min左右
在10%的次氯酸钠、 饱和漂白粉浸泡 30min左右
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70%—75% 酒精中浸泡 30s
蒸馏水冲洗 4—5次
洗衣粉 洗涤
清水 冲洗
晾干 备用
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2、塑料用品洗涤
新的塑料器皿打开即用
已用过的 塑料器皿
2%NaOH浸泡 12h
蒸馏水 冲洗
清水 冲洗
晾干备用 整理课件
清水 冲洗
2%—5%盐 酸浸泡 30min
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3、金属用品洗涤
热洗衣粉水 洗净
冲洗
擦干
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五、灭菌技术
1、灭菌方法
物理方法： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、过滤
《植物组织培养技术》组培基本操作技术
《植物组织培养技术》组培基本操作技术模块介绍掌握组培基本操作技术是做好组织培养工作的前提和关键。
本模块介绍了培养基制备、无菌操作等组培基本操作技术，主要内容包括培养基的种类、成分、特点和配制技术，以及外植体处理、接种方法、无菌操作规程等理论知识和技术方法。
两个项目共设计6个工作任务，以工作任务为载体，开展项目实践活动，旨在培养学生无菌意识、团队精神和操作技能，使学生初步具备培养基制备工、接种工的基本素质与工作能力。
模块结构设计见表1。
表1 模块结构设计项目1 培养基制备一、学习目标（一）终极目标能够根据培养对象和培养目的准确配制培养基。
（二）促成目标1．准确识记组培药品及其作用；2．熟记植物激素的种类、生理作用、理化性质与配制要求；3．清楚常用基本培养基的种类与特点；4．掌握母液和培养基的配制目的与操作流程，能够熟练配制母液和培养基；5. 熟练使用相关设备与用具；6. 具备无菌意识，具有团队精神、创新意识和和责任心。
二、学习内容1．培养基的种类、特点与成分；2．激素种类、理化性质、生理作用与配制要求；3.母液配制目的与方法；4．培养基配制的目的与方法；5. 培养基灭菌方法。
三、知识点1．培养基的种类、特点与成分；2．母液配制目的与方法；3．培养基配制的目的与方法；4. 培养基灭菌方法。
四、技能点1.母液配制；2.培养基配制；3.培养基灭菌。
五、教学重点1.培养基的种类、成分与特点；2.激素种类、理化性质、生理作用；3.母液和培养基配制的目的与方法；4.培养基灭菌方法。
六、教学难点1.MS大量元素母液、激素母液和铁盐母液的配制；2.培养基配制操作的规范度和熟练度；3.影响培养基湿热灭菌效果的因素；4.培养基中加入活性炭、抗生素的作用；5.配制螯合铁的目的。
七、教学设计八、拓展学习1.MS干粉培养基；2.螯合剂与鳌合物；3.培养基保存；4.培养基不凝固的原因；5.无土栽培营养液与组培培养基的区别。
九、学习建议1.重视培养基制备。
组织培养的知识基础
四、建立细胞系
（一）细胞培养物的分类 1.原代培养细胞 2.细胞系（cell line）：经传代培养的细胞群 已鉴定的细胞系：经培养获得的，形态相对均一，生 长增殖稳定，生物性状清楚的细胞系。经有关专家鉴 定，可纳入有关细胞库，贮存。供研究使用，可作为 商品选用。 有限细胞系 无限细胞系：一般转化细胞系 恶性转化细胞系：在一定条件下可以 无限传代，且具有肿瘤细胞的特性。
（二）、温度：人和哺乳类细胞 最适温度：36.5℃± 0.5 ℃
偏高温度：37-39 ℃， 代谢强度过大呈正比 39-40 ℃ ，1h 细胞受损 但仍可恢复 41-42 ℃， 1h细胞严重损伤 少量可复活 43 ℃以上，1h细胞全部死亡 偏低温度：35-25 ℃ ， 细胞仍可生存，生长不良 4 ℃左右 ，几小时，回到37 ℃仍可继续生长 0 ℃以下，细胞死亡 加保护剂，-196 ℃液氮中，可长期冻存，复苏后细胞 有较高成活率。
G0f2(G0 of function 2)：是终末分化细胞，长期处 于G0期，始终完成分化功能。如：神经细胞、骨 骼肌细胞等。在体外难培养成功。 ⑤细胞脱离了增殖态，经功能态，再一次进入增殖 态后称为一个细胞增殖周期，这不同于传统的细 胞周期概念 ⑥离体培养细胞，必须进入持续增殖状态才能生存， G0i时间很短，但营养不良，生长因子缺乏，可停 留于G0i状态，如及时补加营养因子，可进入增殖 状态，否则细胞会因长期滞留在G0i态而死亡。
（四）基本营养需求
1.碳水化合物 2.氨基酸类 3.维生素类 4.激素类 5.微量元素 6.促细胞生长因子 天然培养基：血清、血浆、胎汁等 人工合成培养基：+血清 （P16血清的作用）
（五）针对不同细胞培养物，培养条件的多样性
1.培养条件因培养对象不同而异 培养基：广普培养基和特殊针对性培养基。P17-18 血清：小牛血清、胎牛血清、无血清培养基+ 纯化促细胞生长因子 各种特殊添加剂：针对不同培养物和不同实验目的 如： 外周血淋巴细胞：多种广谱性培地均可（1640） +小牛血清（20%） +植物血凝素（PHA）
植物的组织培养技术
果树脱病毒技术的实践与应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
植物组织培养技术可用于果树的脱病毒处理，提高果树的 抗病各种病毒病，导致产 量下降、品质变劣等问题。植物组织培养技术可以用于果 树的脱病毒处理，通过将感染病毒的果树组织进行离体培 养，再从中选择和繁殖出无病毒的植株。这种方法可以提 高果树的抗病性和产量，改善果实品质，对于果树的健康 生产和经济效益具有重要意义。
03 植物组织培养的操作流程
外植体的选择与处理
外植体的选择
选择健康、无病虫害的植物组织 作为外植体，如根、茎、叶、花 、胚等。
外植体的处理
清洗、切割、消毒等步骤，确保 外植体无菌，为后续培养提供良 好的基础。
无菌操作技术
无菌操作环境
在无菌操作室内进行，确保空气经过过滤，减少微生物污染 。
无菌操作工具
智能化监控与管理
借助物联网和大数据技术，实 现植物组织培养过程的智能监
控与管理，提高培养效率。
对环境与伦理的考虑
环境影响
植物组织培养技术的发展和应用需要考虑其 对环境的影响，如能源消耗、废弃物处理等 。
伦理问题
在应用植物组织培养技术时，需要关注伦理 问题，如基因改造和克隆技术的道德争议等 。
06 植物组织培养技术案例分析
VS
有机化学品生产
通过植物组织培养技术，可以生产具有工 业用途的有机化学品，如香精油、色素等 。
植物的脱病毒与复壮
脱病毒
通过植物组织培养技术，可以从感染病毒的植株中分离出无病毒的植株，提高植株的健 康水平。
复壮
通过植物组织培养技术，可以繁殖出具有优良性状的植株，恢复或提高植物的种质资源 价值。
组织培养 植物组织培养基本操作
一、培养基的成分 培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调
节剂三大基本组成成分。 1、无机盐类 功能 离体组织生长发育的基本成分
根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两 类：
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大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十 -几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、 生物素-VH、维生素C-Vc。
⑶肌醇 功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用，对 胚状体和芽的形成有良好影响。 用量一般50-100mg/L。
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⑷腺嘌呤 合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细 胞分裂，促进芽的形成和生长。 ⑸氨基酸 蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸 和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。 ⑹其它复合成分 成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、 酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。
休眠以及诱导单性结实等。 与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞
胚进一步发育成植株。 有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。
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4、水 离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又
是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般
应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净
水。
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5、其它附加成分 ⑴琼脂
功能 来自海藻的多糖类物质，组织培养中 最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支 持物。
常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。 卡拉胶 海藻提取物，含杂质少纯度更高， 凝固后培养基透明，利于材料观察。
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组织培养基本原理和设施
4. 温室
在具备温室条件的地方，可以在温室栽培
材料，供植物组织培养取材只用。温室为植 物提供良好的生长环境，可以根据需要随时 栽培，也可以为组织培养提供健康的植物材 料，从而使初代污染得到有效控制。同时， 温室也为试管苗的移栽提供良好的炼苗场所， 温室内应配置有温度控制装置、通风口、喷 雾装置、光照调节装置、杀菌杀虫工具及相 应药剂等。
（2）培养设备 培养设备是为培养物创造适宜的光、
温、水、气等条件的设备. ① 空调 ② 加湿器或去湿机。 ③ 定时器。 ④ 培养架。 ⑤ 摇床或旋转床 ⑥ 恒温恒湿光照培养箱。
（3）药品贮存和配制仪器设备 ① 冰箱。 ② 天平。 ③ 酸度计。 ④ 微波炉或电磁——用以融化琼脂。
倒置显微镜 原生质体观察
普通显微镜 染色体和叶片气孔观察
荧光显微镜 细胞活力观察
解剖显微镜
立体观察
需配备光学相机或数码相机。
（5）其他仪器设备 ① 离心机。进行原生质体分离时，需要
离心机。 ② 蒸馏水制备装置。需要时，还可进行重
蒸馏水来获得纯度更高的蒸馏水。 除此之外，电炉、水浴锅、药品柜和晾
冰箱 陈列于制备室中
作用：低温保存材料，存放药品、培养基
母液、激素、酶制剂。 天平
陈列于制备室中
作用：称取大量元素、微量元素、
酶制剂
酸度计
陈列于制备室中
作用：测定培养基及酶制剂的ｐＨ值
PHS-802中文台式酸度计 通用型或经济型酸度计
（4）观察分析仪器设备
陈列于观察室中
类型：
体视显微镜 用以植物组织形态分化的实 体观察，不定芽、不定胚的早期识别，植 物茎尖的切取
（二）主要仪器和设备 1、常用设备
（1） 无菌操作设备 包括超净工作台、高压蒸汽灭菌和烘箱等。
组织培养基本技术与基本知识
组织培养基本技术与基本知识2005.10.15目录前言------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------5 第一章基本技术---------------------------------------------------------------------------------------------------6 第一节原代细胞单层静止培养的设备与器材准备--------------------------------------------------------------6一、设备与器材二、器材的清洗第二节原代细胞单层旋转瓶培养的设备与器材准备------------------------------------------------------11一、设备与器材二、器材的清洗第三节组织培养用水的制备和各种溶液的配制----------------------------------------------------------12一、水（双蒸水、三蒸水或去离子水）二、汉克氏（Hanks）原液和汉克氏液三、0.5%水解乳蛋白----汉克氏液（简称乳汉液）的配制四、7.5%的碳酸氢钠（NaHCO3）配制五、胰蛋白酶的配制六、犊牛血清的制备七、每毫升含1万单位双抗（青霉素与链霉素）的配制八、每毫升5万单位制霉菌素的配制九、营养液与维液的配制第四节器物与溶液的包装、灭菌和无菌操作-------------------------------------------------------------16一、包装与灭菌二、无菌操作第五节无菌检验---------------------------------------------------------------------------------------------------23 第六节原代单层细胞的制备------------------------------------------------------------------------------------24 第七节细胞计数和染色------------------------------------------------------------------------------------------26一、细胞计数二、细胞染色第八节培养细胞的观察---------------------------------------------------------------------------------------27一、培养细胞的生长和繁殖二、在单层细胞培养中细胞的形态观察第九节原代单层细胞培养中应注意的问题------------------------------------------------------------------29一、应注意的问题二、可能会出现的问题第二章在组织培养的细胞中病毒的接种与毒价的滴定（测定）--------------------------------------31 第一节在组织培养的细胞上病毒的接种方法--------------------------------------------------------------32一、用敏感细胞分离病毒二、病毒在敏感细胞中的传代三、接种后细胞病变（CPE）的观察与判定标准第二节在组织培养细胞中病毒毒价的测定----------------------------------------------------------------34一、病毒毒价测定操作方法二、半数细胞病变终点（TCID50）计算第三章基本知识-------------------------------------------------------------------------------------------------41 第一节影响离体细胞生长繁殖的一些因素-----------------------------------------------------------------41一、温度二、氢离子浓度三、水四、渗透压与无机盐类A、细胞所需无机盐离子的作用B、无机盐类对平衡渗透压和维持pH的作用五、气体六、细胞接种浓度七、容器转动速度第二节细胞的营养物质-----------------------------------------------------------------------------------------49一、碳水化合物二、氨基酸和水解乳白蛋白三、血清（一）、血清的作用（二）、与血清有关的几个问题四、维生素第三节消化液的应用--------------------------------------------------------------------------------------------56一、胰蛋白酶二、乙烯二胺四乙酸（Versene，EDTA）三、胶原酶四、P ronase第四节抗菌素的应用--------------------------------------------------------------------------------------------61一、青霉素二、链霉素第五节传代细胞与细胞悬浮培养-----------------------------------------------------------------------------62一、传代细胞二、细胞悬浮培养第四章附录--------------------------------------------------------------------------------------------------------65 附录Ⅰ猪瘟兔化弱毒细胞冻干疫苗（旋转瓶培养）制造及检验办法-----------------------65 附录Ⅱ禽苗的鸡胚细胞苗试制-------------------------------------------------------67 附录Ⅲ应用驴胎肺等二倍体细胞生产马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原操作方法—---------68前言为了适应我国畜牧业的发展，防止各种畜、禽流行病的爆发和流行，需要生产大量的家畜家禽的各种疫苗，而目前不少疫苗的生产尚未探取组织培养的方法，存在着成本高，费人力，劳动强度大，有些疫苗的原料比较难于得到或需要耗费较多的家畜或家禽，例如狂犬疫苗的生产，目前还是采用绵羊的脑子来制造，一只羊只有脑子能利用。
《植物生物技术导论》
《植物生物技术导论》自学指导中国农业大学继续教育学院内容体系本课程内容主要涵盖植物细胞组织培养技术、植物分子标记技术以及植物基因克隆技术等核心知识。
重点介绍植物组织器官培养；茎尖分生组织培养；细胞培养；体细胞杂交；种质保存的方法、原理及应用；植物遗传转化的方法、原理及应用；植物分子标记技术以及植物基因克隆技术。
内容要点课程共分十个章节讲述，每章内容及要求如下：绪论讲授植物生物技术的一般概念、发展简史及在农业中的作用。
要求掌握基本概念。
第一章植物细胞组织培养的基本技术主要内容包括基本设备，培养基的主要成分及制备，外植体的种类、消毒及培养，培养条件，继代培养。
要求掌握培养基的制备，外植体的选择、消毒与培养及适宜培养条件的选择。
第二章植物组织器官培养主要内容包括植物组织培养的关键环节、植物组织和器官培养的影响因素和人工种子的制备。
重点讲授器官分化及体细胞胚胎发生的影响因素及实验方法和人工种子制备的具体方法。
要求掌握植物组织培养的关键环节、植物组织和器官培养的影响因素及人工种子的制备。
第三章花药、花粉培养主要内容包括花药培养和花粉培养基本概念、培养方法和培养意义。
要求掌握花药、花粉的培养方法。
第四章细胞培养主要内容包括植物细胞培养方法及植物细胞培养的应用。
要求掌握细胞培养的方法。
第五章原生质体的分离、培养和体细胞杂交主要内容包括原生质体的分离、培养技术及体细胞杂交方法。
要求掌握原生质体分离机体细胞杂交方法。
第六章植物遗传转化主要内容包括植物基因工程的基本原理，农杆菌介导法、基因枪法、电击法等常用的几种遗传转化方法。
要求掌握农杆菌介导法、基因枪法转化的基本原理及方法。
第七章种质离体保存主要内容包括种质离体保存的意义、原理及方法。
要求掌握冷冻保存、低温保存的方法及原理。
第八章植物基因克隆主要内容包括植物基因克隆的方法。
要求掌握常用的克隆基因的方法及步骤。
第九章DNA分子标记主要内容包括DNA分子标记的概念及分子标记的种类。
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9、取下接种器械，在火焰上消毒。
10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。
11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。
注意：操作期间应经常用70%—75%的酒精擦拭工 作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡 和在火焰上消毒。
第二节 植物组织培养所需的环境 条件及营养成分
一、环境条件
与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受 到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养 基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植 体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的 影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一 个重要问题。
第二章 植物组织培养基本技术
第一节 实验室设置及基本技术 第二节 组织培养所需的环境条件及营养成分 第三节 培养基的配制与灭菌 第四节 外植体的选择和灭菌 第五节 外植体的接种和培养 第六节 外植体的褐变及其预防措施 第七节 玻璃化现象及其预防措施 第八节 试管苗的驯化和移栽
第一节 实验室设置及基本技术
搁 水槽 架
搁
实
4.0m 架
验
台
电
炉
准备室
门
4.5m
冰箱 无菌台
药 品 及 无菌台 仪
器 无菌室
柜
缓冲室
搁
拉 窗
培养架
培养架
架 培养室
培
培
养
养
架
架
3.0m
3.5m
组织培养准备实验室
缓冲室
器设备
1、基本仪器设备136 6912 1358
冰箱、电（磁）炉、酸度计、纯 水器、天平、移液器、解剖镜、光照 培养箱、摇床、生化培养箱、培养基 分装器、搅拌器等。
HZC-250恒温振荡培养箱
光学显微镜
5、细胞学鉴定设备
光学显微镜、体视 显微镜、倒置显微镜
倒置显微镜
三、培养器皿及实验用具
1、玻璃器皿
三角瓶 培养皿 培养瓶
2、金属材质用具
接种针 镊子 解剖刀
四、洗涤技术
1、玻璃器皿洗涤
新购置玻 璃器皿
1%稀HCl
浸渍12h
已用过的 玻璃器皿
洗衣粉 洗涤
清水 冲洗
3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面 和四周的台壁。
4、用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手。
5、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养 基的培养器皿，放进工作台。
6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95% 的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。
7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。
8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶 口各部分都烧到。
一、实验室组成 二、仪器设备 三、培养器皿及实验用具 四、洗涤技术 五、灭菌技术 六、无菌操作
一、实验室组成
组织培养实验室布局的总体要求
便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察
实验室 组成
基本实验室
准备室 缓冲室 无菌操作室 培养室
细胞生物学实验室 辅助实验室 温 室
生化分析实验室
基本实验室布局平面图
晾干 备用
2、塑料用品洗涤
新的塑料器皿打开即用
已用过的 塑料器皿
2%NaOH浸泡 12h
蒸馏水 冲洗
清水 冲洗
晾干备用
清水 冲洗
2%—5%盐 酸浸泡 30min
3、金属用品洗涤
热洗衣粉水 洗净
冲洗
擦干
五、灭菌技术
1、灭菌方法
物理方法： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、过滤
除菌等 化学方法：
消毒剂、抗菌素灭菌
0
100
2
103.6
4
106.9
6
109.8
8
112.6
10 115.2
12 117.6
14 119.9
15
121.0
1.055
16
122.0
1.125
18
124.1
1.266
20
126.0
1.406
22
127.8
1.543
24
129.6
1.681
30
134.5
50
147.6
（3）塑料器皿灭菌： 多采用高压蒸汽消毒灭菌
70%—75% 酒精中浸泡 30s
蒸馏水冲洗 4—5次
备用
常用消毒剂消毒灭菌比较表
消毒剂
使用浓度 （%）
去除难易
消毒时间 （min）
效果
次氯酸钙 次氯酸钠
漂白粉 溴水
过氧化氢 升汞 酒精
抗生素 硝酸银
9~10 2
饱和溶液
1~2 10~12 0.1~1 70~75 4~5（mg/L
1
易 易 易 易 最易 较难 易 中 较难
5~30 5~30 5~30 2~10 5~15 2~10 0.2~2 30~60 5~30
很好 很好 很好 很好 好 最好 好 较好 好
六、无菌操作
实验员消毒 实验室、无 菌台灭菌
实验台 卫生
实验器材 的灭菌
消毒
无菌接种
培养室 培养
1、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接 种室。
2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯， 照射40min左右，后关闭。
冰箱 电炉
酸度计
纯水器 天平
培养基分装器
搅拌器
2、灭菌设备
蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、 过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。
蒸汽压力灭菌锅
干热消毒柜
无菌瓶顶过滤装置
（参考图）
喷雾消毒器
（参考图）
3、无菌操作设备
超净工作台
无菌接种箱
4、细胞培养设备
摇床
培养架
150C 250D 光照培养箱
环境条件
温度 光照 湿度 气体 渗透压 pH值
一般最适温度在25±2℃之间
最常用的是光照16h，黑暗8h
一般情况下，培养器内相对湿度应达100%， 培养室内环境的相对湿度在70%—80%
氧气是愈伤组织生长所必需的 调节渗透压常常从糖入手 培养基的pH值大多在5.0—6.5，5.8
二、营养成分
植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素 在植物体内起到一定的生理作用：
2、灭菌
（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在9.8×104—10.8×104Pa 温度在121℃ 灭菌20—30min
（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌
饱和蒸汽压力与其对应的温度
饱和蒸汽压力
kg/cm2
1b/m2
温度（℃）
饱和蒸汽压力
kg/cm2
1b/m2
温度（℃）
0.0 0.141 0.281 0.442 0.563 0.703 0.844 0.984
（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷
却后使用
（5）接种室灭菌
接种室
紫外灯 照射
超净工 作台
紫外灯 照射
70%—75% 的酒精擦洗
空气消 毒灭菌
培养材料 的接种
（6）外植体灭 菌
流水冲洗10—20min 或更长时间
0.1%—0.2%氯化汞 液中浸泡10min左右
在10%的次氯酸钠、 饱和漂白粉浸泡 30min左右
a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质； b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢； c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳