薄膜过滤法微生物限度检查操作要点
微生物限度-薄膜过滤法
微生物限度（薄膜过滤法）
1、用到的设备和仪器：
微生物限度仪，一次性过滤杯，无菌滤膜（0.45um，Φ50mm）酒精灯，电子打火消毒喷枪，不锈钢镊子、无菌均质袋(无菌锥形瓶）、不锈钢剪刀、电子天平
2、环境要求：C+A检验前先开紫外灯和空调净化系统半小时。
3、样品外包装在准备室用75%乙醇或0.1%的新洁尔灭溶液浸泡10秒钟，然后通过传递窗传到检测室超净工作台内
4、供试液制备:在超净工作台内，用无菌剪刀打开外包装，根据样品稀释要求，称取适量供试品，加入稀释液。
（一般称取10g样品，加入90ml胰酪大豆胨液体培养基中）
5、过滤：先用消毒枪对过滤头消毒，然后用无菌镊子把无菌滤膜贴这绿色面朝上贴在过滤头上，在把一次性滤杯放在上面，先用稀释液20ml润湿滤膜，取样品1ml过滤，用适量冲洗液冲洗滤膜。
取下一次性滤杯，用无菌镊子小心取下滤膜，菌面朝上贴在放有胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基上。
6、培养：培养皿倒置于培养箱内，胰酪大豆胨琼脂培养基，33℃培养5天。
沙氏葡萄糖琼脂培养基，23℃培养7天。
注：1、操作过程中一定要有无菌意识，防止对样品和环境造成污染。
2、此操作没有具体到品种，如果要具体到品种，冲洗量要在符合药典和法规要求的同时通过方法验证来得到。
3、稀释倍数根据样品污染程度进行，次稀释倍数也要经过验证来得到。
微生物限度检查操作规程
1 目的规范微生物限度检查操作。
2 适用范围适用于微生物限度的检查。
3 职责质量检定部人员严格按本SOP操作。
4 工作程序4.1 仪器4.1.1 超净工作台4.1.2 微生物检测系统4.2 试剂所用培养基及缓冲液均按《中华人民共和国药典》2005版三部要求进行配制。
玫瑰红钠培养基、营养琼脂培养基4.3 试验方法采用薄膜过滤法4.4试验前准备试验过程中所有用的器材都应进行灭菌后方可使用；超净工作台使用前需进行紫外灭菌30min。
4.5 试验步骤4.5.1 将样品加入薄膜过滤器的滤杯中4.3.1.3 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响4.3.1.4 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃；控制菌培养温度为35～37℃。
4.3.1.5 检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告。
4.3.2 检验量4.3.2.1 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。
4.3.2.2 除另有规定外，一般供试品的检查量为10g或10ml；化学膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
4.3.3 供试液的制备供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
4.3.3.1液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨脂80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
4.3.4 细菌、霉菌及酵母菌计数4.3.4.1 检查法薄膜过滤法采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45um，直径约为50mm。
选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。
滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。
使用时，应保证滤膜再过滤前后的完整性。
微生物限度检查法标准操作规程完整
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查 供试品微生物计数中 所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性 试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法 适用性试验。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]
大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102])
乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50094]
白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]
薄膜过滤法采用的滤膜孔径不大于。滤膜直径一般为50mm。滤器及滤膜使用 前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供 试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。为发挥滤膜的最大过滤效率，应 注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要 用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000m1；以免滤膜上的微生物受损伤。取照上述“供试液的制备”和“接种和 稀释”制备的供试液适量（一般取相当于1g、1ml、10cm2的供试品，若供试品 中所含菌数校对，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液总，混匀，过滤，用 适量的冲洗液冲洗滤膜。测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨 琼脂培养基平板上；测定霉菌和酵母菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖 琼脂培养基平板上，按规定条件培养、技术。每株试验菌每种培养基至少制备1张滤膜。同法测定供试品对照组和菌液对照组菌数。
微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案
微生物限度检查方法薄膜过滤法验证方案 Document number【SA80SAB-SAA9SYT-SAATC-SA6UT-SA18】微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
薄膜过滤微生物测试法
薄膜过滤微生物测试法一、培养皿的准备1．配备与待测样品数相同的无菌培养皿，另上一个作对照组（每种培养剂一个对照组），在每个培养皿上标上待测样品的记号2．用烧过的镊子将无菌吸收垫从包装袋中取出，放入每个培养皿中，每取一个吸收垫，镊子需用火烧一次3．打开培养皿盖子到刚能加上约1.8ml的培养剂在吸收垫上，强烈建议使用装有培养剂的小安瓿瓶、小瓶或小管，当处理大量样品时，可使用无菌的吸管来分配培养剂二、培养剂的种类：总菌数橙血清培养剂酵母和霉菌数橙血清培养剂大肠杆菌数MF-Endo培养剂粪便大肠杆菌数M-FC培养剂4应有足够的培养剂加入每个培养皿，使过滤膜能适当地粘附着吸收垫。
但过多的培养剂会引起菌落扩展重叠，常常得不到正确的计数结果。
有需要时，建议调整推荐的培养剂数，以便粘附和菌落生长。
三.过滤器支架的准备：1.打开预先灭菌的过滤器支架或将过滤器座、漏斗和漏斗盖在沸水中浸没一分钟作消毒。
若没有沸水，用95%酒精喷洒于漏斗和漏斗盖，然后将其点燃，在火熄灭以后，让过滤器冷却至40℃以下，如果必须使用酒精，漏斗必须用耐火材料制造。
2.用水煮过或火焰灭菌钳子，将无菌过滤器的底座部分安装于过滤烧瓶或真空管道上。
3.用火烧过的镊子放一张无菌薄膜在过滤器底座上，根据测试目的，使用特定的过滤膜：总菌数/大肠杆菌数：0.45um薄膜酵母菌和霉菌：0.80um薄膜4.用水煮过或火焰灭菌钳子，将过滤器漏斗和漏斗盖放置于底座上。
如漏斗盖带有管口，则在管口处装上过滤器，或予以封住。
待过滤器的温度低于40℃后才可加样品。
5.重复以上步骤，直到所有样品都完成过滤。
四.样品的过滤和平板培养1.无菌地将样品直接倒入消毒和冷却的过滤器漏斗中。
盖上过滤器漏斗的盖子。
若使用勺，须将勺放在95%的酒精的烧杯中。
2.施加真空，使样品通过薄膜。
无菌地打开装有无菌水的玻璃瓶，先用火烧螺纹处，然后倒入约20毫升无菌水于过滤漏斗内，进行冲洗。
施加真空，使无菌水通过薄膜。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
2015版药典薄膜过滤法
2015版药典薄膜过滤法摘要：一、概述二、薄膜过滤法的原理三、2015版药典薄膜过滤法操作步骤四、注意事项五、对照试验与验证正文：一、概述2015版药典薄膜过滤法是一种用于药品微生物限度检测的方法，该方法操作简便、准确度高，能够有效保障药品的安全性和质量。
本文将详细介绍薄膜过滤法的原理、操作步骤、注意事项以及对照试验与验证。
二、薄膜过滤法的原理薄膜过滤法是利用微孔膜对微生物进行筛选和捕捉，将样品中的微生物分离出来，然后进行培养、计数和鉴定。
微孔膜的孔径大小可以选择，以筛选出所需大小的微生物。
三、2015版药典薄膜过滤法操作步骤1.准备样品：按照药典规定，将待检测的药品制备成适当的溶液或悬浮液。
2.薄膜过滤：将制备好的样品过滤至微孔膜上，利用真空泵或其他方法将溶液中的微生物过滤出来。
3.冲洗：用无菌水冲洗过滤后的微孔膜，去除残留的样品。
4.培养：将冲洗后的微孔膜放入培养基中，进行培养。
培养条件可根据微生物的特性进行调整。
5.计数：培养后，对产生的菌落进行计数，计算微生物限度。
四、注意事项1.操作过程中应严格遵循无菌操作规程，避免微生物污染。
2.选择合适的微孔膜孔径，以保证筛选出目标微生物。
3.冲洗时要充分，避免微孔膜上的微生物残留。
4.培养条件要根据微生物的特性进行调整，以保证菌落的准确计数。
五、对照试验与验证对照试验是验证薄膜过滤法准确性的重要步骤。
通过与公认的微生物检测方法进行对照，评估薄膜过滤法的准确性和重复性。
对照试验可以参照相关标准进行操作。
总之，2015版药典薄膜过滤法是一种有效的微生物检测方法。
通过掌握操作原理和注意事项，可以确保检测结果的准确性。
微生物限度检测薄膜过滤器的工作原理 薄膜过滤器如何操作
微生物限度检测薄膜过滤器的工作原理薄膜过滤器如何操作微生物限度检查仪（微生物限度过滤系统）接受隔膜泵，不需要抽滤瓶，液体直接通过隔膜泵排出，削减了抽滤瓶使用上的繁琐，避开了连接不好造成抽滤速度慢，不占用操作空间。
微生物限度检查仪是杭州美卓依据药典相关规定设计制造的微生物限度检测专用设备，该产品体积小巧，使用便捷，内置高性能隔膜泵，直接排液，无需抽滤瓶，形成完整的薄膜过滤装置。
检测时将供试液通过薄膜过滤，将供试液内的微生物截留在滤膜上，然后培育形成肉眼可见的菌落并进行计数，以检测供试品内的含菌量。
微生物限度检测仪特别适用于纯化水和注射用水的微生物限度检测，也可以用于其他样品的微生物负载检测。
工作原理接受隔膜液泵负压抽滤原理，在滤杯内的微孔滤膜（使用前灭菌）上下面产生一个压差，滤杯内的受试品由于压差作用通过微孔滤膜。
微孔滤膜具有多而杂的蜂孔结构，即使0.45m以下的微生物亦可被拦截，从而高效地回收微生物，将受试品中可能存在的微生物截留在滤膜上。
0.45m滤膜的孔径利于微生物恢复，且培育基易透过滤膜，利于细菌培育。
微生物限度检验仪的用途不锈钢过滤系统是广泛应用于讨论单位、检验检疫机构、质量监控机构、天然矿泉水行业、饮用水行业、制药行业、制药行业、饮料行业等部门的滤膜法微生物检测、悬浮固形物检测、样品纯化的抽滤设备。
产品特点：内置进口隔膜液泵,效率更高；小巧的机身,削减对操作台面积的占用；过滤杯接受独特的唇形密封设？计,不使用夹钳和O型圈,确保无泄漏操作和均匀的微生物回收率；滤膜预先灭菌,即拆即用,可降低紧要污染物源,提高检测牢靠性；直接抽滤排液,无需抽滤瓶,安装使用便利；不锈钢防水按钮，掌控泵的工作状态，按钮带指示灯，泵开关状态一目了然；过滤头可快速拆装,能单独湿热灭菌；过滤头可以火焰快速灭菌,便利连续试验操作。
？？快捷的安装方式、非螺纹结构、非弹簧柱塞结构、无卫生死角薄膜过滤器依照中国药典2023年版之无菌检查法试验要求，参加国际通用标准设计而成，适用于除菌过滤，菌落检查及液体中微粒的测定。
薄膜过滤法微生物限度检查操作要点
薄膜过滤法微生物限度检查操作要点1. 设备、仪器1.1 无菌室微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。
1.1.1 操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9Pa。
操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。
1.1.2 缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。
缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。
1.1.3 在每次操作前、后，用75%乙醇溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。
然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。
1.1.4 无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～350C预培养48h，证明无菌落生长），以无菌方式移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min 后将盖盖上。
在30～350C培养箱内倒置培养48h，取出检查。
3个平板生长的平均菌落数不超过1个。
1.2 仪器1.2.1 恒温培养箱（30～350C）、生化培养箱（23～280C）、电冰箱、蒸汽灭菌器。
1.2.2 玻璃器皿烧杯、培养皿、量筒、试管及塞、吸管。
玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。
玻璃器皿均应用牛皮纸（或双层报纸）严密包裹置蒸汽灭菌器高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干。
或于160℃干热灭菌2h，备用。
2培养基及其制备方法2.1 营养琼脂培养基：取营养琼脂培养基34g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。
2.2 玫瑰红钠琼脂培养基：取玫瑰红钠琼脂培养基30.5g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。
2.3 胆盐乳糖培养基：取胆盐乳糖培养基36g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。
微生物限度-薄膜过滤法
微生物限度（薄膜过滤法）
1、用到的设备和仪器：
微生物限度仪，一次性过滤杯，无菌滤膜（0.45um，Φ50mm）酒精灯，电子打火消毒喷枪，不锈钢镊子、无菌均质袋(无菌锥形瓶）、不锈钢剪刀、电子天平
2、环境要求：C+A检验前先开紫外灯和空调净化系统半小时。
3、样品外包装在准备室用75%乙醇或0.1%的新洁尔灭溶液浸泡10秒钟，然后通过传递窗传到检测室超净工作台内
4、供试液制备:在超净工作台内，用无菌剪刀打开外包装，根据样品稀释要求，称取适量供试品，加入稀释液。
（一般称取10g样品，加入90ml胰酪大豆胨液体培养基中）
5、过滤：先用消毒枪对过滤头消毒，然后用无菌镊子把无菌滤膜贴这绿色面朝上贴在过滤头上，在把一次性滤杯放在上面，先用稀释液20ml润湿滤膜，取样品1ml过滤，用适量冲洗液冲洗滤膜。
取下一次性滤杯，用无菌镊子小心取下滤膜，菌面朝上贴在放有胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基上。
6、培养：培养皿倒置于培养箱内，胰酪大豆胨琼脂培养基，33℃培养5天。
沙氏葡萄糖琼脂培养基，23℃培养7天。
注：1、操作过程中一定要有无菌意识，防止对样品和环境造成污染。
2、此操作没有具体到品种，如果要具体到品种，冲洗量要在符合药典和法规要求的同时通过方法验证来得到。
3、稀释倍数根据样品污染程度进行，次稀释倍数也要经过验证来得到。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至 10ml 的无菌营养肉汤中在 30�35℃下培 养 18�24 小时�将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中�在 23�28℃下培养 24�48 小时。将黑 曲霉接种至改良马丁液体培养基中�在 23�28℃下培养 5�7 天。将上述培养物用 0.9%的无菌氯化钠 溶液制成每 1ml 含菌落数为 50�100cfu 的菌悬液。 4.2 实验方法
有效期至
改良马丁琼脂培养基
玫瑰红钠琼脂培养基
胆盐乳糖增菌培养基
营养琼脂培养基 3.1.5 稀释液�PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
以上经 115℃高压蒸汽灭菌 30min。 3.1.6 验证用微生物名称及其编号
实验菌株的来源�
菌株名称
内控编号
大肠埃希菌 CMCC(B) 44102
Ec-
金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26003
日期
批准人�
批准日期�
二、验证方案
1.验证目的和原理 1.1 验证目的
为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定�特制定本方案。验证过程应
严格按照本方案规定的内容进行�若因特殊原因确需要变更时�应报验证委员会批准。
1.2 原理 通过比较试验 4 组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2
药品生产、质量管理文件
判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3 试验结果可接受标准�用标准菌株评价方法“
”的微生物限度检查对检品中微生物的
抑制性�试验结果应显示 3 次独立的平行试验中�稀释剂对照组的菌回收率应不小于 70%�试验组回
收率也不低于 70%。
微生物限度检验标准操作规程要点
1 目的规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠。
2 依据《中国药典》2010版。
3 范围本标准适用于微生物限度检验。
4 责任中心化验室负责人：对本规程的实施负责。
中心化验室检验人员：严格按照本规程执行检验操作。
5 程序5.1 执行标准：《中国药典》2010版。
5.2 抽样：照《取样标准操作规程》进行。
6 细菌、霉菌及酵母菌计数计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。
检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。
6.1 设备、仪器及用具6.1.1 设备微生物限度检测室室、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、生化培养箱（23-280C）、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等。
6.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、薄膜过滤器等。
6.1.3 用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.2 试液6.2.1 消毒液A．0.1% 新洁尔灭溶液：供手消毒、擦拭操作台面用。
B．75%乙醇溶液6.2.2 稀释液、试剂及配制A．PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g，加纯化水1000ml，微温溶解，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。
B．聚山梨酯80C．吐温80D．单硬脂酸甘油酯6.3 培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基6.4 操作方法6.4.1 试验前准备6.4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至传递窗内。
每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。
6.4.1.2 开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。
6.4.1.3 操作人员进入一更，用洗手液或肥皂洗手，烘干。
纯化水微生物限度检查标准操作规程
纯化水微生物限度检查标准操作规程1目的规定纯化水微生物限度检查操作。
2适用范围本文件适用于纯化水微生物限度检查操作。
3职责微生物限度检查操作人员。
4微生物限度检查方法纯化水采用薄膜过滤法进行检查。
滤膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50mm。
5内容5.1设备洁净工作台、恒温培养箱（30~35℃）、恒温水浴锅、电热干燥箱（250~300℃）、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。
5.2仪器及器皿5.2.1薄膜过滤器、放大镜、显微镜。
5.2.2玻璃器皿：蓝盖试剂瓶（250ml）、培养皿（90mm）、吸管（l0ml分度0.l）、载玻片、盖玻片。
玻璃器皿用前应洗涤干净无残留抗菌物质。
吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或用牛皮纸包好。
玻璃器皿，均于高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用。
5.3用具5.3.1大、小橡皮胶头（放于干净带盖的容器中，并应定期用75%乙醇溶液浸泡）。
纯化水微生物限度检查标准操作规程5.3.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。
也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。
5.3.3酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、试管架、无菌滤杯、无菌滤膜、打火机、记号笔、接种环、灭菌抹布等。
5.4消毒液5.4.10.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。
5.4.275%乙醇溶液5.4.33~5%来苏尔溶液5.5培养基R2A琼脂培养基5.5.1灭菌前后应对培养基的pH值进行校验。
5.5.2配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤灭菌后使用。
5.5.3培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。
包装时，塞子必须塞紧以免松动或脱落造成染菌。
5.5.4培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。
5.5.5灭菌后的培养基在2~8℃处保存备用，放置时间不能过长，以免水分散失及染菌。
已熔化的培养基应一次用完，开启后不宜再用。
微生物限度检测仪操作说明和注意事项 检测仪技术指标
微生物限度检测仪操作说明和注意事项检测仪技术指标微生物限度检测仪，微生物薄膜过滤器微生物限度检测仪是将供试品注入微生物限度培育器内，通过检验仪自带内置进口隔膜液泵负压抽滤，将供试品中微生物截留在滤膜上，用取膜器取出滤膜，转移至配置好的固体培育基上，菌面朝上，平贴。
盖上盖子形成封闭的培育盒，置于相应的恒温培育箱内培育并计数。
试验准备：取硅胶管一根，将一端套在过滤装置的出液口，另一端套在收集瓶的进液口（不锈嘴）；再取另一根硅胶管，一端套在收集瓶的抽气端（白色塑料嘴），另一端通过不锈钢宝塔接头与真空泵相连（1）试验前，应先将滤杯清洗干净、晾干、取滤膜（50mm）侵泡到纯化水里3～5min，滤杯及滤膜支撑网消毒备用（可接受火焰灭菌器快速消毒）。
（2）用镊子夹住滤膜放在抽滤装置的滤网上。
（3）将其供试品注入过滤杯内，然后启动真空泵，再打开相应阀门，实施过滤集菌。
（4）供试品过滤集菌结束后（滤膜上没有水珠），关闭真空泵开关，用无菌镊子取出密封圈，在用无菌镊子取出滤膜。
（5）将滤膜贴到事先准备好的培育基上，菌面朝上，平贴，不得有气泡。
相应的液体培育基注入滤杯内，培育基覆盖滤膜表面即可。
（6）盖上盖子放置在生化培育箱及恒温培育箱中，按规定温度和时间进行培育，逐日察看、计数。
（7）仪器正常性检测:取600ml～1200ml纯化水，每个滤杯注入100ml纯化水,接通真空泵电源，再分别打开相对应的阀门，实施抽滤（抽滤时间1～5min为正常范围），依据速度将准备好的纯化水加入滤杯中，纯水顺畅地从排液口流出，即视为仪器可正常工作,假如过滤速度过慢或无法过滤，请检查: A.管路连接是否漏气，滤杯密封性是否良好； B.检品是否含有较多不溶性的颗粒，悬浮物等；C.检查不锈钢网片是否堵塞，不锈钢底座出液孔是否堵塞。
若属其他原因，请与厂家联系。
（8）清洗:仪器长期没有使用,再次使用前仪器管路应对管路进行消毒，可接受以下消毒剂：A乙醇 B新洁尔灭 C甲醛 D次氯酸溶液．消毒方法：准备100ml消毒剂、200ml无菌水（不需微孔滤膜）；先将100ml消毒剂过滤，保持3～5分钟，再将200ml无菌水进行过滤，即可完成管路消毒。
微生物限度薄膜过滤法操作步骤
微生物限度薄膜过滤法操作步骤嘿，咱今儿就来唠唠这微生物限度薄膜过滤法的操作步骤哈！这可真是个精细活儿呢！
先得把那些个要检测的样品准备好呀，就像要上战场的士兵，得先把武器装备齐了不是？然后呢，选好合适的滤膜，这滤膜就好比是个筛子，专门把那些微生物给筛出来。
接下来，把样品小心地倒在过滤装置上，让它慢慢地渗过滤膜。
这过程可不能急，得慢慢来，就像绣花一样，得有耐心。
你想啊，如果太着急了，把滤膜给弄破了，那不就前功尽弃啦！
等样品都过滤完了，可别以为就大功告成了哦。
还得用合适的冲洗液把滤膜冲洗干净呢，把那些可能残留的杂质啥的都给冲掉。
这就好比是给滤膜洗个澡，让它干干净净的。
然后呢，把滤膜取下来，放到合适的培养基上培养。
这培养基就像是微生物的家，让它们能在里面舒舒服服地生长。
这时候就得等啦，等这些微生物慢慢地长大。
在等待的过程中，你可别闲着呀，可以想象一下那些微生物在培养基上一点点长大的样子，是不是还挺有意思的？
等培养好了，就可以观察结果啦！看看都有哪些微生物，数量有多少。
这就像是开奖一样，充满了期待呢！
哎呀，这微生物限度薄膜过滤法说起来简单，做起来可不容易呢！每一步都得小心翼翼的，不能有丝毫的马虎。
就像走钢丝一样，稍有不慎就可能掉下去。
但只要咱认真对待，按照步骤一步一步来，肯定能得到准确的结果呀！这可关系到很多产品的质量和安全呢，可不能小瞧了它！所以呀，大家在操作的时候一定要打起十二分的精神，把每个细节都做好，这样才能保证结果的可靠呀！你说是不是呢？。
2015版药典薄膜过滤法
2015版药典薄膜过滤法
2015版药典中的薄膜过滤法主要应用于药物制剂中的微生物
限度测试。
该方法使用薄膜滤器将药物制剂中的微生物过滤掉，并在培养基上培养，以便观察和计数微生物。
具体操作步骤如下：
1. 准备薄膜滤器和培养基。
通常使用0.45微米的薄膜滤器和
适当的培养基。
2. 准备药物制剂样品。
样品应适当稀释以确保过滤和培养的合适菌落计数范围。
样品也需要适当的温度和时间来杀灭可能存在的抑制因子。
3. 将薄膜滤器安装在过滤设备中，并将药物制剂样品通过滤器过滤。
确保采取一定的预处理步骤来减少样品中可能存在的微生物负荷。
4. 将过滤后的薄膜滤器转移到含有适当培养基的培养皿中。
5. 将培养皿放置在适当的培养条件下进行培养，通常是在适当的温度下，通常是25-30℃下培养48-72小时。
6. 在培养结束后，观察培养皿上的菌落，并进行计数。
薄膜过滤法是一种常用的微生物限度测试方法，可以快速、有效地检测药物制剂中的微生物污染。
这种方法适用于液体制剂和一些溶液制剂，但对于含有高粘度或高浑浊度的制剂可能不适用。
在使用过程中需要注意操作的严谨性，以确保结果的可靠性。
薄膜过滤法微生物限度检查操作要点
薄膜过滤法微死物极限查看支配重心之阳早格格创做1. 设备、仪器1.1 无菌室微死物极限查看应有单独的无菌室，每个无菌室应有独力的净化气氛系统.1.1.1 支配间支配间应拆置气氛除菌过滤层流拆置.环境净净度没有该矮于10000级，局部净净度为100级（或者搁置共等第净化处事台）.支配间或者净化处事台的净净气氛应脆持对于环境产死正压，没有矮于4.9Pa.支配台上备有电子天仄，乙醇灯，洋火，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等.1.1.2 慢冲间慢冲间内应有洗脚盆，无菌衣、帽、心罩、拖鞋等.慢冲间内没有得搁置培植箱战其余纯物.1.1.3 正在屡屡支配前、后，用75%乙醇溶液或者其余消毒液揩拭支配台及大概传染的死角.而后开用层流净化拆置，共时用紫中杀菌灯映照30min.1.1.4 无菌室支配台消毒揩拭后，先开用层流净化拆置30min，将备妥的营养琼脂仄板3个（经30～350C预培植48h，说明无菌降死少），以无菌办法移进支配间，置净化台左、中、左各1个，开盖，表露30min后将盖盖上.正在30～350C培植箱内倒置培植48h，与出查看.3个仄板死少的仄衡菌降数没有超出1个.1.2 仪器1.2.1 恒温培植箱（30～350C）、死化培植箱（23～280C）、电冰箱、蒸汽灭菌器.1.2.2 玻璃器皿烧杯、培植皿、量筒、试管及塞、吸管.玻璃器皿用前应洗涤搞净，吸管、量筒没有挂火滴，无残留抗菌物量.玻璃器皿均应用牛皮纸（或者单层报纸）周到包裹置蒸汽灭菌器下压蒸汽121℃灭菌30min，烘搞.或者于160℃搞热灭菌2h，备用.2培植基及其造备要领2.1 营养琼脂培植基：与营养琼脂培植基34g，加1000ml蒸馏火，加热溶解，分拆，121℃下压灭菌15分钟.2.2 玫瑰黑钠琼脂培植基：与玫瑰黑钠琼脂培植基30.5g，加1000ml蒸馏火，加热溶解，分拆，121℃下压灭菌15分钟.2.3 胆盐乳糖培植基：与胆盐乳糖培植基36g，加1000ml蒸馏火，加热溶解，分拆，121℃下压灭菌15分钟.3稀释剂3.1 0.9%无菌氯化钠溶液：与氯化钠，加火溶解使成1000ml，121℃灭菌20分钟.3.2PH7.0无菌氯化钠-蛋黑胨慢冲液：与磷酸两氢钾，磷酸氢两钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋黑胨1.0g，加火1000ml，微温溶解，分拆，过滤，灭菌.4 供试液的造备4.1与供试品10g，加经搞热灭菌的5%吐温-80 0.2ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋黑胨慢冲液稀释至100ml，边加边振摇使成混悬液，停行5分钟使分层，倾与上浑液置离心机中500r/min离心5分钟，与上浑液动做供试品溶液.5 查看要领采与薄膜过滤法，滤膜孔径为0.45um，曲径为50mm.滤膜及滤器正在使用前采与121℃下压灭菌30钟.考查历程中，应脆持滤膜前后的完备性.将造备佳的供试液过滤，而后用100mlPH7.0无菌氯化钠-蛋黑胨慢冲液（注意脆持供试品溶液覆盖所有滤膜表面）.浑洗后，用镊子与出滤膜，菌里往上揭于营养琼脂培植基或者玫瑰黑钠琼脂培植基仄板上培植.细菌于30～35℃培植48小时，霉菌于23～28℃培植72小时.。
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薄膜过滤法微生物限度检查操作要点
1. 设备、仪器
1.1 无菌室微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。
1.1.1 操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9Pa。
操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。
1.1.2 缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。
缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。
1.1.3 在每次操作前、后，用75%乙醇溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。
然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。
1.1.4 无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～350C预培养48h，证明无菌落生长），以无菌方式移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min 后将盖盖上。
在30～350C培养箱内倒置培养48h，取出检查。
3个平板生长的平均菌落数不超过1个。
1.2 仪器
1.2.1 恒温培养箱（30～350C）、生化培养箱（23～280C）、电冰箱、蒸汽灭菌器。
1.2.2 玻璃器皿烧杯、培养皿、量筒、试管及塞、吸管。
玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。
玻璃器皿均应用牛皮纸（或双层报纸）严密包裹置蒸汽灭菌器高压蒸汽121
℃灭菌30min，烘干。
或于160℃干热灭菌2h，备用。
2培养基及其制备方法
2.1 营养琼脂培养基：取营养琼脂培养基34g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。
2.2 玫瑰红钠琼脂培养基：取玫瑰红钠琼脂培养基30.5g，加1000ml 蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。
2.3 胆盐乳糖培养基：取胆盐乳糖培养基36g，加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟。
3 稀释剂
3.1 0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃灭菌20分钟。
3.2 PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠
4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，分装，过滤，灭菌。
4 供试液的制备
4.1 取供试品10g，加经干热灭菌的5%吐温-80 0.2ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，边加边振摇使成混悬液，静止5分钟使分层，倾取上清液置离心机中500r/min离心5分钟，取上清液作为供试品溶液。
5 检查方法
采用薄膜过滤法，滤膜孔径为0.45um，直径为50mm。
滤膜及滤器在使用前采用121℃高压灭菌30钟。
试验过程中，应保持滤膜前后的完整性。
将制备好的供试液过滤，然后用100mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（注意保持供试品溶液覆盖整个滤膜表面）。
冲洗后，用镊子取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。
细菌于30～35℃培养48小时，霉菌于23～28℃培养72小时。
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