烟草的组织培养技术

烟草的组织培养技术
一、目的与要求
1.验证“植物细胞全能性”理论。

2.学习用生长调节剂对植物器官发生的诱导方法。

二、实验原理
植物组织培养是指在无菌条件下，分离、并在培养基中培养离体植物组织（器官或细胞）的技术。

植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个活细胞都有相同的遗传组成，在适当条件下具有繁殖出完整植株的能力。

植物组织当中原本已经分化的细胞，组织、器官一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出细胞的全能性，从已经分化的细胞通过脱分化，成为重新具有分裂能力的胚性细胞，并能再分化重新生长发育成完整的植株。

愈伤组织：是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的细胞团。

脱分化：已经分化的细胞，发生生理、生化的改变，退回到胚性细胞的过程。

再分化：经过脱分化的细胞或组织再次获得分化成不同功能的细胞、组织、器官或完整植物体。

三、材料和用具
1.材料：无菌烟草叶盘（已经诱导成芽），拟南芥。

2.用具：超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、电子天平、移液器、手术解
剖刀、大、小镊子、30ml烧杯、500ml烧杯、药勺、玻璃棒、培养
瓶、平皿、试纸（PH5.4-7），报纸等。

3.试剂：MS培养基、0.5mol/LNaOH、1mol/L HCl。

四、操作步骤
（一）诱导培养基配制（见表1）
1.加MS储液（储液配置见附表）
大量元素和微量元素的母液都是高浓度的，为防止混合后发生沉淀，建议加完大量元素后先加水（约总体积3/4），再加各微量元素和有机成分。

铁盐也是微量元素，因为易发生沉淀，所以与其它微量元素分开配。

储液中的铁盐存于棕色瓶中。

配好的储液应当4℃保存。

表1是4瓶培养基（1组）的配置方案。

表1 诱导培养基配制表
成分实际称取量
蒸馏水120 ml
MS母液15 mL
蔗糖 4.5 g
用蒸馏水粗略定容至100ml
pH值 5.8
琼脂 1.2 g
2.加蔗糖（3%）（m/v）。

蔗糖是碳源，同时起到维持渗透压的作用。

3.调pH=5.8。

pH过低，高温处里时间过长，都可能会使培养基不凝。

4.加琼脂（0.7-0.8%）（m/v）琼脂粉是固化剂、支持物。

（二）灭菌
1.培养基、解剖刀、镊子、平皿需在高压灭菌锅120℃，灭菌15min。

2.接种前打开无菌间和超净台紫外灯照射30min。

3.用肥皂洗手和手腕。

进入无菌间，先用70%酒精或新洁尔灭喷手。

关掉
无菌间棚顶紫外灯，打开超净台风机，关掉超净工作台上的紫外灯。

（三）接种
1.坐在超净工作台前，用70%酒精棉球擦拭双手、培养瓶和超净台面。

2.待手上的酒精干了，点燃酒精灯。

3.将培养瓶的盖子旋松，但不要打开，放到无菌风道侧面备用。

将镊子、解剖刀在酒精灯外焰上灼烧，待其冷却后，放到培养皿上备用。

4.用镊子和解剖刀取出一块叶盘，放到平皿上，切取烟草叶芽1-2块，插
入培养基。

5.用酒精灯火焰上灼烧瓶口，瓶盖数秒（阻断微生物进入），拧上瓶盖，不
必太紧。

注意：无菌操作时不要讲话，以免污染。

用酒精对双手消毒时，务必待酒精彻底挥发后再靠近
酒精灯火焰，以免火焰伤手。

进出无菌间关好缓冲间的推拉门。

培养4周，25℃，光照16小时，暗8小时，湿度70%-80%。

五实验结果
1.第二周生长情况
拟南芥1：1号拟南芥种子开始膨胀，略微膨大，但是并未发芽，无明显变化。

拟南芥2：2号拟南芥中有一至二个种子开始发芽，芽的形状不规则，并且显得略微发黄。

芽只是茎的部分露出培养基的上方，芽与根都在培养基中，推测原因是种子相对于培养基的位置影响，发芽的一面面朝培养基，故芽孢向培养基中生长。

烟草1：生长状态较好，发育较快，已经占据了整个培养瓶的空间，茎秆粗壮，叶片绿色略带黄色，根系较发达，伸张至整个培养瓶的培养基。

烟草2：生长状态较好，同1号烟草。

区别在于根系更发达，有部分根伸张到培养基的表面，暴露在空气中。

2.第三周生长情况
拟南芥1：同第二周时的状态，无明显变化。

拟南芥2：最初生长出的芽死了几个，只有一个芽显浅黄色，其它已发的颜色渐渐变深，显现出与培养基相近的褐色。

表明色素对拟南芥种子的发芽有影响，可以渗透到萌发的芽中。

烟草1：生长情况与第二周时相同。

有限的培养瓶生长空间与培养基中有限的营
养物质，限制了烟草苗的进一步生长。

但染料的颜色略微变浅。

烟草2：生长情况与第二周相似，只是叶片的大小有长大。

最明显的变化是培养基的颜色，最初的深红色此时已成了浅红，颜色变化较大。

3.第四周生长情况
拟南芥1：依旧无萌芽，只是种子更加膨大。

拟南芥2：芽的大小与前两周相同，无明显变化。

推测原因是温度较低，抑制了芽的萌发于继续生长。

烟草1：室内培养两周后，叶片开始显得发黄，茎秆开始变细，为缺乏光照和营养物质的表现，需要移种到外部环境中。

烟草2：叶片变小、发黄，整体状态不及前一周。

染料的颜色继续变浅，根毛的颜色加深。

六思考题
1．什么是细胞全能性？
答：细胞的全能性是指细胞经分裂和分化后仍具有形成完整有机体的潜能或特性。

具有以下两大特点：
①高度分化的植物体细胞具有全能性，植物细胞在离体的情况下，在一定营养的物质，激素和其他适宜的外界条件下，才能表现其全能性。

②高度分化的动物体细胞也具有全能性。

动物细胞（如成纤维细胞）在离体的情况下，在一定营养物质、因子（包括特定转录因子或小分子化合物）的诱导下，可被重编程为诱导多能干细胞（iPSC），并发育成新的个体。

根据动物细胞全能性大小，可分为全能性细胞（如动物早期胚胎细胞），多能性（如原肠胚细胞），专能性（如造血干细胞）；根据植物细胞表达全能性大小排列是：受精卵、生殖细胞、体细胞；全能性的物质基础是细胞内含有本物种全套遗传物质。

一个生活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的遗传基础，在一个适当的条件下可以通过分裂、分化再生成一个完整植株，这就是所谓的植物细胞全能性。

这是植物组织培养的理论基础。

出师表
两汉：诸葛亮
先帝创业未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此诚危急存亡之秋也。

然侍卫之臣不懈于内，忠志之士忘身于外者，盖追先帝之殊遇，欲报之于陛下也。

诚宜开张圣听，以光先帝遗德，恢弘志士之气，不宜妄自菲薄，引喻失义，以塞忠谏之路也。

宫中府中，俱为一体；陟罚臧否，不宜异同。

若有作奸犯科及为忠善者，宜付有司论其刑赏，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使内外异法也。

侍中、侍郎郭攸之、费祎、董允等，此皆良实，志虑忠纯，是以先帝简拔以遗陛下：愚以为宫中之事，事无大小，悉以咨之，然后施行，必能裨补阙漏，有所广益。

将军向宠，性行淑均，晓畅军事，试用于昔日，先帝称之曰“能”，是以众议举宠为督：愚以为营中之事，悉以咨之，必能使行阵和睦，优劣得所。

亲贤臣，远小人，此先汉所以兴隆也；亲小人，远贤臣，此后汉所以倾颓也。

先帝在时，每与臣论此事，未尝不叹息痛恨于桓、灵也。

侍中、尚书、长史、参军，此悉贞良死节之臣，愿陛下亲之、信之，则汉室之隆，可计日而待也。

臣本布衣，躬耕于南阳，苟全性命于乱世，不求闻达于诸侯。

先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顾臣于草庐之中，咨臣以当世之事，由是感激，遂许先帝以驱驰。

后值倾覆，受任于败军之际，奉命于危难之间，尔来二十有一年矣。

先帝知臣谨慎，故临崩寄臣以大事也。

受命以来，夙夜忧叹，恐托付不效，以伤先帝之明；故五月渡泸，深入不毛。

今南方已定，兵甲已足，当奖率三军，北定中原，庶竭驽钝，攘除奸凶，兴复汉室，还于旧都。

此臣所以报先帝而忠陛下之职分也。

至于斟酌损益，进尽忠言，则攸之、祎、允之任也。

愿陛下托臣以讨贼兴复之效，不效，则治臣之罪，以告先帝之灵。

若无兴德之言，则责攸之、祎、允等之慢，以彰其咎；陛下亦宜自谋，以咨诹善道，察纳雅言，深追先帝遗诏。

臣不胜受恩感激。

今当远离，临表涕零，不知所言。