lncRNA研究方案

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lncRNA 研究技术手册
一、lncRNA 概述
lncRNA (Long noncoding RNAs,lncRNAs)长链非编码RNA ，起初被认为是基因组转录的不具有生物学功能的“噪音”，是RNA 聚合酶II 转录的副产物。

然而，近年来的研究表明，lncRNA 参与了X 染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，lncRNA 的这些调控作用也开始引起人们广泛的关注。

随着研究的推进，各类lncRNA 的大量发现，lncRNA 的研究将是RNA 基因组研究非常吸引人的一个方向，使人们逐渐认识到基因组存在人类知之甚少的“暗物质”。

lncRNA 的功能分为3方面：
1）通过修饰染色体参与表观调节-与mRNA 相互作用；
2）通过与转录因子的相互作用参与转录调节-与蛋白（转录因子）相互作用；
3）通过影响mRNA 处理过程参与转录后调节-ceRNA 作用模式。

三种lncRNA 机制作用方式，1和2主要发生于细胞核，3则发生在胞质。

从研究难度来说，1>2>3：1）的RNA interaction 与array 并无成熟的研究模式；2）需要RIP 和RNA pull-down ，实验执行难度大风险高；3）转录后调节的研究方法-ceRNA 作用模式可行性及阳性率较高，是目前研究最热门的lncRNA 作用方式。

lncRNA 的ceRNA 作用模式：lncRNA 作为竞争性内源RNA(competing endogenousRNA ，ceRNA)，与microRNA 结合，在细胞中起到microRNA 海绵的作用。

从而降低microRNA 的活性，间接上调microRNA
相关靶基因的表达。

图：lncRNA 的ceRNA 作用模式
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二、汉恒生物-lncRNA 研究专家
汉恒生物lncRNA 研究团队，为您提供基于ceRNA 调控机制的lncRNA 系统研究方案。

大致流程如下：
1）验证lncRNA 的表达水平和细胞内亚定位；
2）通过网络数据库，预测lncRNA 可能结合的miRNAs ；
3）lncRNA 结合的miRNAs 的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证；
4）miRNA 靶基因预测与功能富集分析；
5）miRNA 靶基因的筛选、验证及相关功能研究；
6）lncRNA-miRNA-mRNA
调控网络的验证。

图2汉恒生物lncRNA 研究流程示意图
汉恒生物科技(上海)有限公司地址：上海市浦东新区蔡伦路150号1号楼2楼
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三、汉恒生物-lncRNA 研究实例
四、研究步骤解析：
1、验证lncRNA 的表达水平和细胞内亚定位：
汉恒生物拥有成熟的lncRNA-qPCR 验证技术，可验证HOTAIR 在不同样本中的表达差异性（如肺癌组织和癌旁组织样本），本例中，HOTAIR 在癌组织中的表达量高于癌旁组织。

qPCR 筛选HOTAIR 内源表达丰度高的肺癌细胞系用于后续细胞功能学实验。

由于
lncRNA-miRNA-mRNA 调控机制的前提是
lncRNA 在细胞质表达，汉恒生物提供的核质分离和qPCR 技术，可确定HOTAIR 是否在细胞质中表达。

2、通过网络数据库，预测HOTAIR 可能结合的miRNAs ：
3、lncRNA 结合的miRNAs 的信息学筛选及荧光素酶进一步筛选验证：
将HOTAIR 序列克隆构建至报告基因载体psiCHECK ，合成上述预测到的miRNA mimics 及对照，在293T 细胞内同时转染miRNA mimics 和psiCHECK-HOTAIR ，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，并筛选报告基因表达下调的miRNAs （可能有多个，本例中假定选择hsa-miR-17-5p 进行后续研究）。

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4、miRNA 靶基因预测与功能富集分析：
对hsa-miR-17-5p
进行靶基因预测，结果如下：
通过功能富集分析将肺癌相关的基因筛选出来：
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5、miRNA 靶基因的筛选、验证及相关功能研究：
（1）初筛：qPCR 验证靶基因在癌组织和癌旁组织中的表达量差异，筛选与lncRNA 表达呈正相关的靶基因（本例选择在癌组织中高表达的靶基因）；
（2）进一步筛选：在肺癌细胞系中下调HOTAIR 表达（使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），qPCR 验证上述靶基因表达水平。

选择HOTAIR 干扰后，表达量也明显下调的靶基因作为研究对象，本例中假定为CDK6基因。

查询CDK6的功能，发现它主要与细胞周期相关。

（3）在肺癌细胞系中过表达hsa-miR-17-5p （使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），WB 和qPCR 检测CDK6的表达水平；
（4）在肺癌细胞系中过表达hsa-miR-17-5p （使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），通过细胞周期和细胞增殖等实验，确定hsa-miR-17-5p 对细胞功能的影响；
（5）双荧光素酶报告基因实验：构建CDK63’UTR 报告基因载体，将hsa-miR-17-5p mimics 与报告基因载体共转293T 工具细胞，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，阐明hsa-miR-17-5p 作用于CDK6的分子机制；
注：为了实验的严谨性，可加入CDK63’UTR 区hsa-miR-17-5p 预测结合区域的突变体作为对照，进一步说明问题。

6、肺癌细胞系中干扰HOTAIR ，检测CDK6表达水平及细胞功能学研究：
在肺癌细胞系中干扰HOTAIR （使用汉恒生物的慢病毒或腺病毒工具），然后分别进行如下实验：
1）WB 和qPCR 检测CDK6表达水平；
2）qPCR 检测hsa-miR-17-5p 表达水平；
3）细胞周期和细胞增殖等实验，研究HOTAIR 对细胞功能的影响；
7、lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络的验证：
汉恒生物-lncRNA-miRNA-mRNA 调控机制研究解决方案：基于ceRNA 作用方式和双荧光素酶报告基因实验，证明lncRNA 可rescue 下游miRNA 对其靶基因的抑制作用。

6本实例的具体流程如下：
（1）构建HOTAIR 报告基因载体，将它和hsa-miR-17-5p mimics 共转至293T 工具细胞中，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，直接证明HOTAIR 对hsa-miR-17-5p 的海绵吸附机制；
（2）使用步骤5（5）中构建的CDK63’UTR 报告基因载体，并构建HOTAIR 过表达载体，将两者共转至293T 工具细胞中，多功能酶标仪检测报告基因的表达水平，可间接证明HOTAIR 通过海绵吸附hsa-miR-17-5p ，从而上调CDK6靶基因的表达。

注：为了实验的严谨性，上述双荧光素酶实验可分别加入HOTAIR 序列或CDK63’UTR 区hsa-miR-17-5p 预测结合区域的突变体作为对照，进一步说明问题。

五、参考文献：
1、Long noncoding RNAs:functional surprises from the RNA world.Wilusz JE,Sunwoo H,Spector DL.Genes Dev.2009Jul 1;23(13):1494-504.
2、A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA.Cesana M,Cacchiarelli D,Legnini I,Santini T,Sthandier O,Chinappi M,Tramontano A,Bozzoni I.Cell.2011Oct 14;147(2):358-69.
3、The long noncoding RNA CASC2functions as a competing endogenous RNA by sponging miR-18a in colorectal cancer.Huang G,Wu X,Li S,Xu X,Zhu H,Chen X.Sci Rep.2016May 20;6:26524.
4、Long noncoding RNA BC032469,a novel competing endogenous RNA,upregulates hTERT expression by sponging miR-1207-5p and promotes proliferation in gastric cancer.LüMH,Tang B,Zeng S,Hu CJ,Xie R,Wu YY,Wang SM,He FT,Yang SM.Oncogene.2016Jul 7;35(27):3524-34.
5、Lnc RNA HOTAIR functions as a competing endogenous RNA to regulate HER2expression by sponging miR-331-3p in gastric cancer.Liu XH,Sun M,Nie FQ,Ge YB,Zhang EB,Yin DD,Kong R,Xia R,Lu KH,Li JH,De W,Wang KM,Wang ZX.Mol Cancer.2014Apr 28;13:92.。