Protease Inhibitor Cocktail_用于真菌和酵母提取物,增加蛋白稳定性_DateSheet
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MCE抑制剂Cocktail家族全系列产品，为您的蛋白质检测保驾护航！“曾经，有一批待检蛋白摆在我的面前，我没有及时检测，等到它降解了，我才后悔莫及。
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HY-K0023Phosphatase Inhibitor Cocktail III (100X in DMSO)有效抑制碱性、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。
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第 9 -11页
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遗传变异检测产品
EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白)
三、凝胶滞留试验(EMSA)凝胶迁移滞留试验(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法,目前已经成为转录因子研究的经典方法,并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合,电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢,即表现为相对滞后。
(一)转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以GST标签为例。
裂解液:25mM pH7.8Tris-HCl、100mM NaCl、2 mM NaEDTA、1mM DTT和21×Complete Protease InhibitorCocktail。
洗脱液:50 mMpH7.8Tris-HCl、200mM NaCl、1mM DTT、0.02%(v/v)Triton X-100和10 mM还原性谷胱甘肽。
EDTA、1mM DTT和1×Complete 透析液:25mM pH8.0 Tris-HCl、1mM Na2Protease InhibitorCocktail。
1将转化了pGEX-4T-2载体或者pGEX-4T-2-目的基因重组载体的BL21大肠杆菌在5 mL含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中37℃、200 rpm震荡培养12 h。
2 取1 mL菌液加入100 mL 含100 μg mL-1氨苄青霉素的LB培养液中,37℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.5左右。
3 加入IPTG至终浓度为0.5 mM,28℃、200 rpm培养6 h。
4 冰上放置10 min,4℃、3000×g离心15 min,收集菌体并称重。
5 每克菌体加入3 mL裂解液,重悬菌体,加入溶菌酶至终浓度为0.5 mgmL-1,在冰上温和地搅动菌液30 min。
6 超声波破碎30 s(破碎10 s停10 s)。
Protease Inhibitor Cocktail(EDTA-Free,100X in DMSO)
引用文献1. M.R. Plewes, P.D. Burns. "Effect of fish oil on agonist-induced receptor internalization of the prostaglandin F 2α receptor and cell signaling in bovine luteal cells in vitro." Domestic Animal Endocrinology. 2017 December 122. Rana PS, Mudrak NJ, et al. "Phase separation in necrotic cells." Biochem Biophys Res Commun. 2017 Oct 21;492(3):300-303.相关生物数据相关生物数据产品描述在平衡状态下内源性蛋白质产生并降解，因此在稳定的环境条件下其细胞水平是稳定的。
粗细胞提取物含有许多能够降解提取物中的蛋白质的内源酶，例如磷 酸酶和蛋白酶。
当在体外从细胞和组织中提取蛋白质时，蛋白质产生被显著抑制，降解增加。
提高完整蛋白质产量的最佳方法是加入已知存在的那些酶的抑制剂。
蛋白酶抑制剂cocktail 用于细胞裂解物或组织提取物以提高蛋白质的稳定性。
该cocktail 起到抑制蛋白酶的作用，这种蛋白酶会降解非磷酸化或磷酸化蛋白质底物。
该蛋白酶抑制剂cocktail 包含单个组分，包括对半胱氨酸，丝氨酸，酸性蛋白酶和氨基肽酶具有广泛特异性的 AEBSF ，Aprotinin ，Bestatin ，E-64，Leupeptin 和 Pepstatin A 。
已经用哺乳动物细胞和组织提取物对这种蛋白酶抑制剂cocktail 进行了优化和测试。
该蛋白酶抑制剂cocktail 作为DMSO 即用溶液提供。
实验操作在室温下解冻，然后在实验前以1:100（v / v ）稀释至溶液样品（如细胞裂解物或组织提取物）。
蛋白酶及其抑制剂
蛋白酶及其抑制剂
一、蛋白酶－抑制剂对照表
二、蛋白酶抑制剂混合物选择表
三、抑制剂－蛋白酶对照表
想要寻找适合您的蛋白酶抑制剂？请参看以下蛋白酶－抑制剂对照表！
为了您实验方便，我们向您提供以下蛋白酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物表一、蛋白酶抑制剂混合物
表二、蛋白酶抑制剂（按蛋白酶抑制剂名称英文字母排序）：
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蛋白体外结合实验联合质谱分析鉴定Num1的互作蛋白
蛋白体外结合实验联合质谱分析鉴定Num1的互作蛋白唐仙英;肖瑶;海力【摘要】目的:为了解析芽殖酵母Num1蛋白在纺锤体定位和线粒体中的调节机制.方法:利用大肠杆菌原核表达并纯化了在Num1功能中起核心作用的补丁组装(PA)结构域的重组蛋白,通过蛋白体外结合实验(Pull-down)分离了酵母细胞中与PA结构域相结合的蛋白复合物,并对其进行了质谱分析.结果:鉴定了一系列新的Num1互作蛋白,包括核糖体蛋白,参与蛋白折叠、分配及转运的内质网和高尔基复合体蛋白,参与基因转录和翻译的核酸酶和蛋白酶,及其他功能的蛋白.结论:Num1的互作蛋白的鉴定为进一步研究Num1的作用机制奠定了基础.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(037)004【总页数】4页(P27-30)【关键词】芽殖酵母;动力蛋白;PA结构域;纺锤体定位【作者】唐仙英;肖瑶;海力【作者单位】中南民族大学生命科学学院,武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室,武汉430074;中南民族大学生命科学学院,武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室,武汉430074;中南民族大学生命科学学院,武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q26为确保细胞的命运决定因子准确地分配到每个子细胞，所有真核细胞均须正确定位有丝分裂纺锤体[1].细胞质动力蛋白Dynein在各类细胞的纺锤体定位过程中起关键作用[2-4].在芽殖酵母的不对称分裂过程中，为了能沿胞质微管产生拉力移动纺锤体，Dynein在与微管相连的同时，需被锚定在细胞膜上.Dynein在细胞膜上的锚定依赖于Num1(Nuclear migration 1，核迁移1)[5-7]，Num1是迄今为止所发现的参与纺锤体定位的唯一位于细胞膜上的因子.Num1蛋白大约313 kDa，由多个结构域组成.其中，位于其C末端的PH结构域通过与细胞膜上的磷酸肌醇PI(4,5)P2相互作用介导Num1与细胞膜结合[8,9]；而另一个位于其N末端含有两段预测的Coiled-coil序列的结构域则通过自我相互作用介导Num1在细胞膜上形成由14个分子组成的补丁状复合物，因此被命名为Patch Assembly(PA)结构域[10].此外，PA结构域也介导Num1与Dynein的相互作用[10].定位于细胞膜上的Num1复合物不具有运动性[8, 11]，除了在纺锤体定位中的作用，它还通过与线粒体膜上特定种类的脂类物质结合而介导线粒体与细胞膜的连接，并由此调节线粒体的分裂[12，13].Lackner 等[10, 12]发现线粒体与细胞膜的连接是由Num1的PA结构域尤其是其中预测的Coiled-coil序列所介导，但Num1在纺锤体定位与线粒体中的活性如何调节目前尚不清楚.本研究利用在BL21大肠杆菌细胞中表达纯化的PA结构域，通过Pull-down实验分离酵母细胞中与PA结构域相互作用的蛋白质，并进一步通过质谱分析完成鉴定，旨在通过鉴定Num1的互作蛋白，为揭示Num1的作用途径及机制奠定基础.1 材料与方法1.1 材料和仪器DH5α和BL21大肠杆菌细胞(北京鼎国昌盛)；蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail, Roche)，S蛋白琼脂糖(S protein agarose slurry)、Bugbuster蛋白提取反应液(Novagen)；氨苄青霉素、氯霉素、异丙基硫代半乳糖苷IPTG、苯甲基磺酰氟PMSF(BioSharp).高速冷冻离心机(CR22G型, HITACHI)；微量冷冻离心机(FC5515R型, OHAUS)；高压细胞破碎仪(BT40/TS2/AA型, Constant System Cell Disruptor)；凝胶成像分析仪(Universal Hood II型, BIO-RAD).1.2 质粒与酵母菌株编码Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z的质粒pXT65(PCN: PreScission蛋白酶酶切位点，S: S-tag, TEV: TEV蛋白酶酶切位点，Z: IgG binding motif)用于表达PA结构域与S-tag的融合蛋白，其构建方法如下：编码Num1 1-303 aa且在5′端含有一个Nco I限制性内切酶位点，3′端含有一个Not I限制性内切酶位点的DNA片段分别用正向引物5′-CCAGCCATGGCCTCCCACAACAACAGGCATAAAAAG-3′和反向引物5′-CCAGGCGGCCGCCAGATGTTACTGTAGTATCG-3′从酵母基因组DNA通过PCR 扩增，扩增的片段经Nco I和Not I酶切后与同样经Nco I和Not I酶切的载体pBSG01[10]连接并经测序确认，产生pXT65.pXT66(PCN-S-TEV-Z)为空载体对照.酵母菌株YWL555[10].基因型为MATα num1Δ∷HIS3 ura3-52 lys2-801 leu2-Δ1 his3-Δ200 trp1-Δ63.1.3 大肠杆菌细胞培养质粒制备或转化用DH5α细胞，重组蛋白表达和制备用BL21细胞[14].DH5α细胞用含氨苄青霉素的LB培养基于37 ℃培养.用于制备重组蛋白的BL21细胞按下述方式培养：保存于-80 ℃的BL21大肠杆菌细胞在含氨苄青霉素的LB固体培养基上37 ℃过夜培养.次日从LB平板上挑取细胞接种到含氨苄青霉素和氯霉素的LB 液体培养基，37 ℃过夜培养.第3 d将液体培养基中的细胞稀释至OD600=0.1，25 ℃培养3 h，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5 mmol/L，20 ℃培养16 h诱导融合蛋白表达，离心收集细胞.1.4 蛋白可溶性检测按1.2培养的BL21细胞经离心收集后，按每0.01 g细胞加入50 μL Bugbuster 蛋白提取反应液，混匀，室温下轻摇15 min，4 ℃ 16000 g 离心20 min；分别取上清和沉淀加入蛋白上样缓冲液，沸水煮5 min.将上清和沉淀制备的蛋白样品分别经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后用考马斯亮兰染色，比较目的蛋白在上清和沉淀中的分配比例.1.5 Pull-down实验1.5.1 重组蛋白的制备携带pXT65和pXT66的BL21大肠杆菌按1.3各收集5 g细胞.按照每克细胞1 mL的比例加入Bind/Wash buffer [150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5), 0.05% TritonX-100, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, Protease Inhibitor Cocktail]，用高压细胞破碎仪(压力207 MPa, 4 ℃)破碎细胞.破碎的细胞4 ℃下12000 g 离心10 min，收集上清，此为大肠杆菌细胞裂解液.取100 μL S protein agrose悬液，1000 g离心1 min，除去上清，用Bind/Wash buffer洗3次，每次1 mL.加入大肠杆菌细胞裂解液，4 ℃旋转混合45 min，离心，除去上清.再用Bind/Wash buffer洗珠子3次，每次5 mL，洗过的珠子置于冰上. 1.5.2 酵母细胞裂解液的制备离心收集YPD液体培养基中旺盛生长的对数期YWL555细胞，每个pull-down 实验需要5 g湿细胞. 按1 mL/g的比例加入酵母裂解缓冲液[30 mmol/L HEPES (pH 7.4), 50 mmol/L乙酸钾, 2 mmol/L醋酸镁, 0.2 mmol/L EGTA, 0.05% Triton X-100, 1 mmol/L DTT, Protease Inhibitor Cocktail (Roche)]，用高压细胞破碎仪破碎细胞.破碎的细胞液10000 g离心5 min，上清即为酵母细胞裂解液.1.5.3 Pull-down反应将1.5.2中制备的酵母细胞裂解液加入到1.5.1中已结合了重组蛋白的S蛋白琼脂糖中，4 ℃旋转2 h，1000 g离心1 min，移去上清.用Wash buffer [10mmol/L Tris-Cl (pH 8.0), 150 mmol/L KCl, 10% Glycerol, 0.05% Triton X-100, 1 mmol/L DTT, Protease Inhibitor Cocktail (Roche)] 洗3次，每次8 mL，除去Wash buffer，加入100 μL 蛋白上样缓冲液，沸水煮5 min，收集上清保存于-20℃.1.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白鉴定所有的蛋白质样品均用10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测[15].其中Pull-down沉淀下来的酵母蛋白样品10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，再用考马斯亮蓝染色液染色，切下被PA结构域融合蛋白沉淀下来的特异性蛋白条带进行鸟枪法(shotgun)LC-MS质谱分析.2 结果与分析2.1 PA结构域重组蛋白的表达PA结构域是预测的Coiled-coil结构，高度不可溶.比较了不同培养条件下Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z融合蛋白在BL21大肠杆菌中的表达(见图1)，最后确定适宜的诱导条件为IPTG浓度0.5 mmol/L，20 ℃过夜培养，此时Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z存在于细胞裂解液上清的比例相对较高，图1中虚线框对应预期蛋白带，箭头指示为该蛋白在20 ℃条件下表达(图1b)较37 ℃下表达(图1a)时存在于裂解液上清中的比例高.1,3,5,7)上清；2,4,6,8) 沉淀a) 37 ℃, IPTG 0.5 mmol/L; b) 20 ℃, IPTG 0.5 mmol/L图1 不同条件下蛋白诱导表达结果Fig.1 Protein expression induced under different conditions2.2 PA结构域重组蛋白的纯化携带pXT65[Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z]或pXT66(PCN-S-TEV-Z)的BL21大肠杆菌细胞在含0.5 mmol/L IPTG浓度的培养基中20 ℃过夜培养诱导蛋白表达.由于诱导表达的Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白含有一个S-tag，因此可在裂解大肠杆菌细胞后，使其与S蛋白琼脂糖珠子结合而得到纯化，结果见图2.如图2所示：S蛋白琼脂糖能从表达pXT65的大肠杆菌细胞裂解液中沉淀下来Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白(箭头所示)，而未从表达空载体pXT66的大肠杆菌细胞裂解液中沉淀下来蛋白.图2 Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白的纯化Fig.2 Purification ofNum1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z protein2.3 PA结构域重组蛋白与酵母蛋白的离体结合为分离与PA结构域相互作用的酵母蛋白，用结合在S蛋白琼脂糖珠子上的Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白与酵母细胞裂解液进行了离体结合实验，即Pull-down实验.由于PA结构域具有自我相互结合的特性[10]，为防止PA结构域与酵母内源的Num1蛋白相结合，酵母细胞裂解液从已敲除了野生型NUM1基因的酵母菌株(num1Δ，即YWL555)中制备.洗去非特异性结合的蛋白质，即获得了结合在S蛋白琼脂糖珠子上的Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z及与其结合的其他蛋白质的复合物.此蛋白复合物样品经SDS-PAGE分离后用考马斯亮蓝染色，结果见图3.如图3所示：上箭头为Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z蛋白，下箭头是被Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z特异性沉淀下来的蛋白复合物(即pXT66的Pull-down样品中缺乏的蛋白)，将其切割下来进行质谱分析，用于鉴定与PA 结构域互作的蛋白.图3 Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z的Pull-down蛋白检测Fig.3 Detection of proteins pulled down by Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z 2.4 互作蛋白的鉴定通过对Pull-down沉淀下来的蛋白复合物进行鸟枪法(shotgun)LC-MS质谱分析，鉴定出一系列新的与Num1相互作用的蛋白，按照参与的细胞功能分组如表1.3 结语位于Num1 N末端的PA结构域(1-303 aa)在Num1的功能中起核心作用，缺失了PA结构域的Num1将同时失去其在纺锤体定位和线粒体中的功能[10,12,13].为分离Num1的互作蛋白，在大肠杆菌细胞中表达了PA结构域和纯化标签的融合蛋白Num1PA(1-303)-PCN-S-TEV-Z，并用S protein agarose对其进行了纯化.结合在S protein agarose珠子上的重组蛋白用于从不表达内源Num1蛋白的酵母细胞裂解液中沉淀PA结构域的互作蛋白.通过对沉淀下来的蛋白进行鸟枪法LC-MS质谱分析，鉴定了一系列新的Num1的互作蛋白，包括大量的核糖体蛋白和参与蛋白折叠转运的蛋白，参与基因转录和翻译的核酸酶和蛋白酶，及其他功能各异的蛋白质.这些结果为进一步揭示Num1在纺锤体定位及线粒体中的作用机制奠定了基础，也为此过程的调控机制提供了更多思路.表1 Num1的互作蛋白Tab.1 Proteins interacting with Num1参考文献【相关文献】[1] Torres E M, Williams B R, Amon A. Aneuploidy: cells losing their balance[J].Genetics, 2008, 179(2): 737-746.[2] Nguyen-Ngoc T, Afshar K, Gönczy P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans [J]. Nat Cell Bio, 2007, 9(11): 1294-1302.[3] Siller K H, Cabernard C, Doe C Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts [J]. Nat Cell Biol, 2006, 8(6): 594-600.[4] Du Q, Macara I G. Mammalian Pins is a conformational switch that links NuMA to heterotrimeric G proteins [J]. Cell, 2004, 119(4): 503-516.[5] Bloom K. Nuclear migration: cortical anchors for cytoplasmic dynein [J]. Curr Biol, 2001, 11(8): 326-329.[6] Farkasovsky M, Kuntzel H. Cortical Num1 interacts with the dynein intermediate chain Pac11p and cytoplasmic microtubules in budding yeast [J]. J Cell Biol, 2001, 152(2): 251-262.[7] Markus S M, Punch J J, Lee W L. Motor- and tail-dependent targeting of dynein to microtubule plus ends and the cell cortex [J]. Curr Biol, 2009, 19(3): 196-205.[8] Farkasovsky M, Kuntzel H. Yeast Num1p associates with the mother cell cortex during S/G2 phase and affects microtubular functions [J]. J Cell Biol, 1995, 131(4): 1003-1014. [9] Tang X, Punch J J, Lee W L. A CAAX motif can compensate for the PH domain of Num1 for cortical dynein attachment [J]. Cell Cycle, 2009, 8(19): 3182-3190.[10] Tang X, Germain B S, Lee W L. A novel patch assembly domain in Num1 mediates dynein anchoring at the cortex during spindle positioning [J]. J Cell Biol, 2012, 196(6): 743-756.[11] Heil-Chapdelaine R A, Oberle J R, Cooper J A. The cortical protein Num1p is essential for dynein-dependent interactions of microtubules with the cortex [J]. J Cell Biol, 2000, 151(6): 1337-1344.[12] Lackner L L, Ping H, Graef M, et al. 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roche cooktail蛋白酶成分
roche cooktail蛋白酶成分罗氏鸡尾酒（Roche鸡尾酒）是一种用于生物科学研究的常用试剂盒，其中包含多种蛋白酶。
蛋白酶是一类能够加速蛋白质降解的酶类分子，它们具有多种不同的功能和特性。
以下将介绍Roche鸡尾酒中常见的蛋白酶成分。
1.胰蛋白酶（Trypsin）：胰蛋白酶是一种消化酶，由胰腺分泌，用于在消化过程中分解蛋白质。
在Roche鸡尾酒中，胰蛋白酶被用于体外细胞培养中，用于细胞的离析和传代。
它能够通过剪切蛋白质的肽键来降解蛋白质分子。
2.胰蛋白酶抑制剂（Trypsin Inhibitor）：胰蛋白酶抑制剂是一种能够抑制胰蛋白酶活性的分子。
在Roche鸡尾酒中，胰蛋白酶抑制剂被用于停止胰蛋白酶的活性，从而控制蛋白质降解的过程。
3.蛋白激酶抑制剂（Protein Kinase Inhibitors）：蛋白激酶抑制剂是一类能够抑制蛋白激酶活性的分子。
在Roche鸡尾酒中，蛋白激酶抑制剂被用于研究细胞信号传导的过程。
它们能够干扰蛋白激酶的活性，从而影响细胞内信号传递通路。
4.磷酸酶抑制剂（Phosphatase Inhibitors）：磷酸酶是一类能够去磷酸化蛋白质的酶。
在Roche鸡尾酒中，磷酸酶抑制剂用于抑制磷酸酶活性，从而保持蛋白质磷酸化状态。
5.蛋白酶抑制剂混合物（Protease Inhibitor Cocktail）：这是Roche鸡尾酒中的一个重要成分，它由多种蛋白酶抑制剂组成，能够抑制多种蛋白酶的活性。
蛋白酶抑制剂混合物能够保护蛋白质免受蛋白酶降解的影响，从而保持蛋白质的稳定性。
Roche鸡尾酒中的这些蛋白酶成分在生物科学研究中发挥着重要作用。
它们能够帮助研究人员保护蛋白质的完整性，提高实验的可靠性和准确性。
另外，这些蛋白酶成分还能够用于调节细胞内的信号传导过程，从而揭示细胞生物学的各个方面。
需要注意的是，Roche鸡尾酒中的蛋白酶成分不能用于食品加工或药品制造。
它们仅限于科学研究中的使用，需要严格遵守实验室安全操作规程。
染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation)(ChIP)详细实验流程及所需试剂
染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation)（ChIP）1. 细胞交联、裂解准备：42ml 1×PBS(4.2ml 10×PBS+37.8ml water)[预冷]SDS lysis Bufer 放置室温Protease inhibitor cocktailⅡ置室温新鲜配制37%甲醛(1). 向已长满细胞的10cmDish 中（含10ml培养基）加入275ul 37%甲醛，轻轻混匀，室温静置10min(2)．同时，准备2个EP管，每管中吸取1ml预冷的1×PBS，在分别加入5ul protease inhibitor cocktail Ⅱ,放置冰上。
(3)．加入1ml 10×Glycine 于每个Dish中，以中和多余的甲醛。
(4)．旋转混匀，室温放置5min(5)．将Dish放置冰上(6)．弃去培养基，尽可能吸尽培养基，不要损伤细胞。
(7)．加10ml预冷的1×PBS洗细胞(8)．弃PBS，再重复洗一遍(9)．加1ml预冷PBS（含有1 ×Protease inhibitor cocktailⅡ）与Dish中（2步准备好）(10)．将细胞刮下来，收集至EP管中。
(11)．700g，4℃，离心2-5min，使细胞沉淀下来。
(12)．在离心过程中，准备lysis buffer(1ml SDS lysis Bufer中加入5ul Protease inhibitor cocktailⅡ)一般1×107 Hele cell, 用1ml SDS lysis Bufer(13)．弃上清（细胞沉淀物可冻存与-80℃）(14)．1ml SDS(含1×Protease inhibitor cocktailⅡ)重悬细胞沉淀物(15)．分装300-400 ul每管（细胞裂解液可在-80℃保存）(16)．超声2. 超声剪切DNA(1)．分装5ul细胞裂解液，用于琼脂糖凝胶电泳（unsheared DNA）(2)．冰上放置细胞裂解液，超声剪切DNA注：（摸条件，超声时要将细胞裂解液放置冰上，超声时产生大量热，会破坏DNA）(3)．离心10000-15000g，4℃，10min，去除不容物(4）．取5ul琼脂糖凝胶电泳（sheared DNA）(5)．将余下上清分装于新的EP管中，每管100ul注：（每100ul中包括1×106 个细胞，可以用作一次免疫沉淀用量）剪切后的染色质可以储存与-80℃2个月久。
不明觉厉！酰基-生物素交换法是个什么鬼？
不明觉厉！酰基-⽣物素交换法是个什么⿁？作者：⽼鹏（转载请注：解螺旋·医⽣科研助⼿）⼤家在读医学研究⽂献时常常会看到⼀种不明觉厉的研究技术，叫“Acyl-biotinyl Exchange”，翻译过来就是“酰基-⽣物素交换法”。
这种⽅法主要⽤于研究蛋⽩质所发⽣的翻译后修饰。
⼤多数蛋⽩分⼦都有多个不同的翻译后修饰机制，⽤以调节蛋⽩功能。
蛋⽩质最常见的翻译后修饰⽅式叫磷酸化，主要发⽣在丝氨酸、苏氨酸等残基位点上，常常通过特异性的抗体进⾏检测。
除了磷酸化之外，蛋⽩质的翻译后修饰的⽅式还有很多，例如糖基化、⼄酰化、甲基化、亚硝基化、⾕胱⽢肽化、棕榈酰化等等。
探索蛋⽩质翻译后修饰的⽣物学意义是是⽣命科学的研究热点之⼀。
对于医学研究⽽⾔，如果你在课题研究过程中发现某种新报道的蛋⽩质翻译后修饰刚好参与调控疾病过程中该蛋⽩的功能变化，那么恭喜你，⼀篇不错的好⽂章已经在不远处招⼿啦。
1酰基-⽣物素交换法是⼀种常见的检测蛋⽩质翻译后修饰的⽅法。
蛋⽩质的半胱氨酸残基上的巯基基团，由于其⾼反应性，很容易发⽣各种氧化还原反应或酰化反应。
酰基-⽣物素交换法的实质是将所要检测的翻译后修饰转化为酰基化的⽣物素基团。
整个交换过程要分三步完成：第⼀步，先封闭可能⼲扰检测的噪⾳，就是其他可被⽣物素酰基化的氨基酸残基基团；第⼆步，通过某种⽅式将所检测的翻译后修饰特异性的转变成可进⾏酰基化反应的状态，如还原态的巯基状态或游离的胺基状态；第三步，将⽣物素通过酰基化反应，结合那些转变⽣成的可发⽣翻译后修饰的氨基酸残基。
这样，原来的蛋⽩质翻译后修饰会交换成酰基化的⽣物素。
再通过可以选择性结合⽣物素的亲和素制备层析柱，就可以富集这些⽣物素化的蛋⽩，再通过抗体⼀⼀检测。
2亚硝基化修饰是⼀种发⽣在半胱氨酸残基巯基上的蛋⽩质翻译后修饰，对很多⼼脑⾎管疾病相关的蛋⽩功能有重要的调节效应。
以亚硝基化为例，可以帮助我们了解如何通过酰基-⽣物素交换法来研究蛋⽩质的翻译后修饰。
第六章 2-DE 蛋白质样品制备、分离与图象分析
Typhoon
Multi-color
fluorescence
Phosphor-imaging Chemiluminescence
（2）2-DE胶图象分析
蛋白质点数统计、蛋白点定位、编号 和相对丰度分析等。
主要图象分析软件有： melanie II & 3, 4 PDQuest 7.0, ImageMaster 2D Elite 3.10 Phoretix 2D.
A.蛋白质点检测
对每一个象素点构建一个算子operator.
根据光密度检测出完整蛋白质点。 手动执行:spot detection wizard 自动执行:initialise
B.背景消减 C.归一化处理 相对定量，便于不同胶的比较。 D.蛋白质点匹配 E.结果输出
IPG 3-10L
SDS-PAGE PLA-801-D、C株细胞蛋白通过在pH3-10L宽pH范围内进行二维电 泳所得的凝胶图谱。在pH3-10L和Mr14，000-97，400Da范围内利 用PDQUEST软件分析图象。（A）选取的是PLA-801-C株蛋白的扫 描图，（B）为经图象加工、背景消除的图象。PLA-801-D的图象 数据此处未示。
ImageMaster Version 3.0
Background removal using different methods.
ImageMaster Version 3.0
Getting Spot volume is as easy as clicking on a spot, the corresponding row is highlighted in the table. Clicking on a row, highlights and centers the spot in the image window. Histograms are available for each spot.
WB实验技术手册
1、根据检测蛋白的位置选择合适的裂解 buffer：
蛋白位置
推荐 buffer
全细胞
NP-40 或 RIPA
胞浆（可溶性蛋白）
Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白）
Tris-Triton
膜蛋白
NP-40 or RIPA
核蛋白
RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPA or 线粒体分离试剂盒
线粒体/细胞浆蛋白分离试剂：该试剂盒提供独特的试剂可从多种哺乳 动物细胞（包括凋亡和非凋亡细胞）中分离出线粒体部分和胞浆部分，得 到的蛋白保持了原有的生物学活性，可直接用于分析线粒体组份在胞浆和 线粒体中分布的变化，如：WB，ELISA 等。操作过程简单、方便，不使用 有毒的物质，无需超速离心。该试剂盒也可用于分离完整的线粒体架构。
积。分装然后保存在-20°C
注意：在煮沸过程中液体体积避免变化太大，可加瓶盖以免溶液过渡蒸发。需
在通风橱中操作。溶液变黄后即丢弃。
相关产品信息
目录号
产品描述
ab65621
Protease Inhibitor Cocktail (Aprotinin,Leupeptin,Pepstatin A,PMSF)
电泳时间： 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或 者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当 分离后即可停止电泳。
二、转膜
杂交膜是 WB 进行的介质，选择合适的、高质量的杂交膜对整个 WB 的实验是非常重要和关键的。可以根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，
选择合适的膜类型。
021-61130227/8/9
６
我要抗体 51AB
51AB 无忧抗体
Halt Protease Inhibitor Cocktail说明书
INSTRUCTIONSPierce Biotechnology PO Box 117(815) 968-0747 /pierce3747 N. Meridian RoadRockford, lL 61105 USA(815) 968-7316 faxNumberDescription87786 Halt Protease Inhibitor Cocktail, contains sufficient reagents to treat 100mL of sample Protease Inhibitor Cocktail (100X), 1mL EDTA Solution, 0.5M (100X), 1mL78429 Halt Protease Inhibitor Cocktail, contains sufficient reagents to treat 500mL of sample Protease Inhibitor Cocktail (100X), 5mL EDTA Solution, 0.5M (100X), 5mL78438 Halt Protease Inhibitor Cocktail, contains sufficient reagents to treat 1L of sample Protease Inhibitor Cocktail (100X), 10mLEDTA Solution, 0.5M (100X), 10mLStorage: Upon receipt store at 4°C. Product shipped on ice pack.IntroductionThe Thermo Scientific™ Halt™ Protease Inhibitor Cocktail protects proteins from degradation by endogenous proteases released during protein extraction and purification. The ready-to-use cocktail contains several potent inhibitors (Table 1) in DMSO against the major classes of protease including aspartic acid, cysteine and serine proteases and, when EDTA is included, metalloproteases.Table 1. Protease inhibitors included in the cocktail.Inhibitor 1X ConcentrationAEBSF 1mM Aprotinin 800nM Bestatin 50µM E64 15µM Leupeptin 20µM Pepstatin A 10µM EDTA*5mM*EDTA is provided in a separate vial.Important Product Information• Halt Protease Inhibitor Cocktail is a broad-spectrum protease inhibitor and does not contain phosphatase inhibitors. The protease inhibitors used in the formulation at their 1X working concentrations are listed in Table 1.•EDTA inhibits metalloproteases by chelating the divalent cations necessary for their activity. By this same mechanism, the activities of other proteins might be affected by EDTA; therefore, empirically determine if EDTA is beneficial in particular experiments.• EDTA interferes with immobilized metal-chelate affinity chromatography (IMAC) and 2-D gel electrophoresis. If needed, remove EDTA by extensive dialysis or desalting before performing such procedures.•This protease inhibitor cocktail is supplied at a 100X concentration in DMSO and is generally effective when used at a 1X final concentration; however, if a sample contains particularly high levels of proteases, the effective cocktail concentration might require optimization.•The cocktail might freeze during storage, which does not affect its function or performance. If frozen, equilibrate the bottle to room temperature until the cocktail becomes a liquid.Halt Protease Inhibitor CocktailProcedureNote: Wear proper personal protective equipment when working with this DMSO-containing protease inhibitor cocktail.1.Equilibrate the bottle to room temperature.2.Vortex the bottle before use to ensure a homogeneous suspension.3.Immediately before use, add 10µL of Halt Protease Inhibitor Cocktail per milliliter of sample directly to the cell lysisbuffer or extract to produce a 1X final concentration.4.Optional: For inhibition of metalloproteases, add 10µL of EDTA per milliliter of sample directly to the lysis buffer orextract to produce a 1X (5mM) final working concentration.TroubleshootingRelated Thermo Scientific Products78430 Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100X), 100µL × 24 microtubes78440 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X), 1mL78444 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X), 5 × 1mL78446 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X), 10mL78428 Halt Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail (100X), 100µL × 24 microtubes88660 Pierce™ Protease Inhibitor Tablets, 30 tablets78420 Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X), 1mL88662 Pierce Phosphatase Inhibitor Tablets, 20 tablets78248 B-PER™ Bacterial Protein Extraction Reagent, 500mL78990 Y-PER™ Yeast Protein Extraction Reagent, 500mL78833 NE-PER™ Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit78501 M-PER™ Mammalian Protein Extraction Reagent, 250mLProducts are warranted to operate or perform substantially in conformance with published Product specifications in effect at the time of sale, as set forth in the Product documentation, specifications and/or accompanying package inserts (“Documentation”). No claim of suitability for use in applications regulated by FDA is made. The warranty provided herein is valid only when used by properly trained individuals. Unless otherwise stated in the Documentation, this warranty is limited to one year from date of shipment when the Product is subjected to normal, proper and intended usage. This warranty does not extend to anyone other than Buyer. Any model or sample furnished to Buyer is merely illustrative of the general type and quality of goods and does not represent that any Product will conform to such model or sample.NO OTHER WARRANTIES, EXPRESS OR IMPLIED, ARE GRANTED, INCLUDING WITHOUT LIMITATION, IMPLIED WARRANTIES OF MERCHANTABILITY, FITNESS FOR ANY PARTICULAR PURPOSE, OR NON INFRINGEMENT. BUYER’S EXCLUSIVE REMEDY FOR NON-CONFORMING PRODUCTS DURING THE WARRANTY PERIOD IS LIMITED TO REPAIR, REPLACEMENT OF OR REFUND FOR THE NON-CONFORMING PRODUCT(S) AT SELLER’S SOLE OPTION. 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Printed in the USA.Pierce Biotechnology PO Box 117 (815) 968-0747 /pierce3747 N. Meridian Road Rockford, lL 61105 USA (815) 968-7316 fax2。
蛋白酶抑制剂技术原理和选择指南
蛋白酶抑制剂技术原理和选择指南当细胞破碎的时候，蛋白水解酶就会被释放出来或被激活，使电泳结果复杂化，影响最终结果分析。
为了避免这些情况的出现，建议在样品制备时尽可能在低温下进行。
此外，许多蛋白酶在PH9以上就失活了，因此Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。
但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性，此时应当使用蛋白酶抑制剂。
因此对于我们想要研究的蛋白来说，选择性和有效的抑制这些蛋白酶对于蛋白纯化路线设计来说显得尤为重要。
蛋白酶抑制剂与蛋白酶一样，都是纷繁复杂的，通常使用许多化学物质作为蛋白酶抑制剂，如PMSF 和leupeptin。
而且由于一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此通常建议复合使用蛋白酶抑制剂，如广谱蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”，见下表（来自《蛋白质电泳实验技术》）。
蛋白酶抑制剂有效抑制的酶PMSF(Pheylmethylsulfonylfluoride)是很常见的抑制剂，使用浓度为1mmol/L不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。
AEBSF 丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低EDTA，EGTA，使用浓度为1mmol/L 通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。
多肽蛋白酶抑制剂，使用浓度为2-20ug/ml 亮肽素（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；抑肽素（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑肽酶（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶TLCk，TPCK，使用浓度为0.1-0.5mmol/L不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶苄脒（Benzamidine）使用浓度为1-3mmol/L抑制丝氨酸蛋白酶但是这样配置溶液进行处理，有时也是颇为麻烦，而且效果可能并不好，目前有一些厂家试剂在简便操作，和抑制效果方面有不俗的表现，可以考虑在实验中选用，节约时间和便于结果分析。
omega elution buffer成分
omega elution buffer成分
摘要：
1.介绍Omega Elution Buffer
2.Omega Elution Buffer的成分
3.各成分的作用
4.Omega Elution Buffer的应用领域
正文：
Omega Elution Buffer是一种在生物化学实验中常用的试剂，主要用于蛋白质的洗脱和纯化。
作为一种缓冲液，Omega Elution Buffer能够稳定pH 值，确保实验过程的顺利进行。
Omega Elution Buffer的主要成分包括以下几种：
1.Tris-HCl：作为缓冲体系的主要成分，Tris-HCl能够稳定pH值，为实验提供一个恒定的环境。
2.Sodium Chloride：氯化钠有助于维持缓冲液的离子强度，提高缓冲液的稳定性。
3.Sodium Fluoride：氟化钠能够抑制微生物的生长，保证试剂的纯净度。
4.Tween 20：作为表面活性剂，Tween 20有助于提高Omega Elution Buffer的洗涤效果，去除残留的蛋白质和脂质。
5.Glycerol：甘油可以增加缓冲液的粘度，降低蛋白质的沉淀速度，提高蛋白质的溶解度。
6.Protease Inhibitor Cocktail：蛋白酶抑制剂混合物，防止实验过程中蛋白质被降解。
Omega Elution Buffer广泛应用于蛋白质分离纯化、质谱分析、酶联免疫吸附试验(ELISA)等领域。
IP实验原理
IP实验原理免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
IP实验步骤基本实验步骤(1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min，12,000g 离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl proteinA/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
快速蛋白酶抑制剂ProteaseArrestTM
快速蛋白酶抑制剂（Protease-Arrest TM）G-BioSciences提供一种从动物细胞，组织，植物，酵母或细菌提取时完全抑制蛋白酶活性的抑制剂. 彻底保护了分离蛋白被蛋白酶消化。
Protease-Arrest TM含有抑制丝氨酸，半胱氨酸，金属蛋白酶和钙激活蛋白酶。
本蛋白酶抑制剂含有不可逆和可逆两种抑制剂，并可选择应用EDTA 溶液用于抑制金属蛋白酶。
由于各种抑制剂的最佳浓度，Protease-Arrest TM显示了非常良好的抑制蛋白酶活性，因此在样本制备和蛋白提取时理想地保护了来自动物组织，植物，酵母和细菌的蛋白。
因为有些蛋白需要二价阳离子，像Ca2+, Mg2+, or Mn2+, 用于他们的生物活性，存在的EDTA 可以有害于蛋白的活性。
因此，如果提纯有些蛋白应用金属螯合的亲和沉析柱，EDTA 必须在沉析柱前被去除。
但有时应用时又需要加入EDTA 。
提供浓度为100 x 溶液,简单地加入10-20μl Protease-Arrest TM/ml置于蛋白提取缓冲液以抑制蛋白酶活性。
特点 :∙广谱的蛋白酶抑制剂鸡尾酒A broad spectrum protease inhibitorcocktail.∙Protease-Arrest TM 1X 浓度在提取缓冲液pH 7-8 抑制了约 95%蛋白酶活性 (即. 小鼠胰腺提取, 0.5 mg /ml 蛋白).∙提供溶液位 100X 浓缩液.∙在蛋白制备抑制了蛋白酶活性应用 :∙保护蛋白避免蛋白在应用时被溶解，如 : 电泳，提纯，贮存，测定和其他应用等∙在蛋白制备抑制了蛋白酶活性产品规格及订购信息 :厂商 : G-BioSciences货号产品名称规格运输条件786-108 Protease-Arrest™[100X], with EDTA, 2ml2ml 室温。
M5 Bacterial Protein Extraction Kit 使用说明书
101422-186M5Bacterial Protein Extraction Kit 使用说明书产品名称单位货号M5Bacterial Protein Extraction Kit 100T MF185-04【STORAGE 】Lysozyme 、DNase I 、Protease Inhibitor Cocktail ：-20℃，其它组分：室温【产品简介】细菌蛋白抽提试剂使用温和的非离子型去污剂，适用于大肠杆菌及昆虫细胞表达的重组蛋白提取。
提取过程中不需进行超声破碎，有效避免了外源蛋白的污染。
本产品可应用于从细菌裂解液中提取可溶性蛋白。
细菌蛋白抽提试剂盒在抽提试剂的基础上添加了溶菌酶、DNase I 和蛋白酶抑制剂混合物，可提高蛋白提取效率并减轻因DNA 引起的粘稠现象，有效避免蛋白降解。
所提取的蛋白保持了生物学活性，可进行IP 、Westernblot 、蛋白纯化等下游操作。
【产品组份】100T Bacterial Protein Extraction Reagent 100ml Protease Inhibitor Cocktail 1ml Lysozyme (50mg/ml)200μl DNase I (1,000U/ml)100μl 【注意事项】1．本产品适用于从新鲜或冻存细菌和昆虫细胞中提取蛋白。
2．本品采用Tris 缓冲系统，蛋白提取后的纯化操作，请使用相同的缓冲系统。
3．使用本产品获得的蛋白裂解液，可用BCA 或Bradford 法进行蛋白定量。
4．对于特殊的菌株，如果抽提效果不理想，可在抽提蛋白前冰冻样品。
5．根据具体情况，可在本产品中加入蛋白酶抑制剂、盐、螯合剂、还原剂等。
【操作步骤】（一）、昆虫细胞蛋白提取1．低速离心收集细胞。
每1ml Bacterial Protein Extraction Reagent 中加入10μl Protease Inhibitor Cocktail 即为1×工作液。
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Product Information
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO)
I. Kit Contents:
Components Information
1,10-Phenanthroline Metalloprotease inhibitor
AEBSF Serine protease inhibitor
E-64 Cysteine protease inhibitor, irreversible
Pepstatin A Aspartic proteinases inhibitor
II. Introduction:
Endogenous proteins are produced and degraded in a balanced state, so their cellular levels are stable under stable environmental conditions. Crude cell extracts contain a number of endogenous enzymes, such as phosphatases and proteases, which are capable of degrading proteins in the extracts. Protein production is greatly halted and degradation is increased when proteins are extracted from cells and tissues in vitro. The best way to increase the yield of intact proteins is to add inhibitors of those enzymes known to be present.
Protease inhibitor cocktail is used with fungal and yeast extracts to increase protein stability. The cocktail functions to inhibit proteases that would degrade either non-phosphorylated or phosphorylated protein substrates.
This protease inhibitor cocktail contains individual components, including AEBSF, 1,10-Phenanthroline, E-64 and Pepstatin A with a broad specificity for cysteine, serine, aspartic, and metalloproteases. This cocktail has been optimized and tested for fungal and yeast cell use. This protease inhibitor cocktail is supplied as a ready-to-use solution in DMSO.
III. Protocol:
Thaw at room temperature; add at 1:100 (v/v) dilution to solution samples (such as yeast extracts) before assaying.
Applications: WB, Co-IP, pull-down, IF, IHC, kinase assay and etc.
IV. Storage:
Stored at -20°C, and stable for at least 12 months.
For research use only! Not to be used in humans.
Our promise
If the product does not perform as described on this datasheet, we will offer a refund or replacement. For more details, please visit / or contact our technical team.。