汇总胶体金生产工艺配方原则.ppt
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Made by：QS HLJ
蛋白邦定作用力
▪ 电荷作用力（静电作用 力）
胶体金的生产
❖胶体金的形成是还原HAuCl4.
❖HAuCL4 + e-
Au0
❖还原剂越强，得到的金颗粒越小
❖生产 40nm诊断用金颗粒一般用柠檬酸三钠
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胶体金颗粒的形成
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胶体金的生产
❖2种重要步骤
▪ 直接形成 ▪ 分步形成
❖大多数人用分步形成
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蛋白结合到固相材料上
❖ 蛋白结合到固相材料上是一个多步骤过程 ❖ 取决于
▪ 蛋白溶液扩散到固相表面 ▪ 蛋白从溶液中分离出来 ▪ 蛋白吸附到固相上 ▪ 蛋白重排到最低能态
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吸附过程
溶液中的蛋白
吸附
蛋白转移到表面区域 蛋白在表面重排
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为负电荷分布。
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高质量结合物
❖单个分散的颗粒 ❖圆形颗粒 ❖很少聚集 这样得到的胶体稳定性 和重复性好
Cluster free, high quality gold reagent
Clustered, poor quality gold reagent Made by：QS HLJ
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“潜水艇” 效应
❖表面活性剂处理过的膜在使用时的常见问 题
❖因为使用的表面活性剂是水溶性的 ❖喷膜时这些表面活性剂被“冲走”了
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反应动力学
❖流速增加,反应速率减低 ❖流速增加,检测时间缩短 ❖流速增加,灵敏度降低 ❖流速增加,试剂用量增加 ❖流速增加,背景降低 ❖距离增加,流速降低 ❖孔径增加,蛋白结合量减少
孔径对侧向层析速度的影响
标称孔径 (m)
3 5 8 12
层析 4.5 cm 的时间 (sec)
245 185 140 100
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不同种类膜的 IgG结合能力
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不同种类膜的 BSA结合能力
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为什么蛋白会结合到膜上?
结合力是什么?
多位点结合
只有1个位点的结合是可逆的
多位点结合使得蛋白稳定在固相表面， 即使其中的每个单位点都是可逆的
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影响蛋白结合的因素
▪ 蛋白缓冲液 ▪ 使用的膜 ▪ 蛋白自身 ▪ 应用体系
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蛋白缓冲液
❖没有通用的缓冲液，不同的系统必须分别 优化。
❖作用：提供适合的PH, 改善亲水性, 增溶性, 提高稳定性
❖盐
▪ 通常不会影响 ▪ 对某些蛋白，两性离子的盐类有助于蛋白结合 ▪ 减少信号强度，消假阳
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❖糖：对包被蛋白的稳定性有重要作用，减 缓老化速度，也可以增加亲水力。
❖惰性蛋白：对消除假阳有重要作用 ❖表面活性剂：增加亲水力，也可增色。
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缓冲液的基本成分
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二、和金子垫相关的配方和原理
❖和金子垫相关的工艺和配方有： 1）标记工艺； 2）金标稀释液 3）金垫处理液
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标记工艺
❖胶体金：一般指金的水溶液，又称金溶胶。 ---金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶
胶。 其中分散的金颗粒直径一般在1~100nm之间，
▪ 比较容易控制颗粒大小，CV也比较小 ▪ 能够生产出大颗粒胶体金
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颗粒大Байду номын сангаас对胶体的影响
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蛋白标记原理
❖蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，依 靠静电引力或疏水力或共价键，被牢固 地吸附于胶体金颗粒表。由于蛋白质分 子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个 蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互 接触，使该胶联溶液较为稳定。
各种缓冲系: Tris-HCl, PB, CB等 盐类：NaCl 糖：蔗糖，海藻糖等 表面活性剂：Tween20，Triton x-100等 惰性蛋白：Casein等 防腐剂 ：叠氮钠，卡松等
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推荐的起始缓冲液
❖10mM Phosphate pH 7.0 3% Ethanol
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要点
❖蛋白的预处理
❖使用低浓度和正确的pH值，确保最小的聚 集
❖合适的蛋白量（可通过盐滴定进行评价）
❖搅拌速度、容器的洁净程度、离心的速 度
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盐滴定
❖盐滴定不能衡量蛋白单层的形成 ❖盐滴定只能代表盐溶液中多少量的蛋白可
以使胶体金稳定 ❖pH和时间都会有影响
❖定律: “蛋白在缓冲液中越不稳定，蛋白结合力越
强”
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缓冲液的优化
❖ 离子强度
▪ 对于蛋白从溶液中脱离出来很重要，少量的离子强度， 蛋白难以从溶液中脱离沉淀出来，过量的的离子强度， 溶液配制中就已会出现沉淀。
❖ pH
▪ 蛋白在等电点最不稳定
❖ 沉淀剂
▪ 通常用醇降低蛋白的稳定性，也可润湿膜，减少膜带 有的静电，利于结合包被。
▪ 静电 ▪ 疏水力
这两种结合力的效应是什么?
▪ 使蛋白从溶液中分离出来 ▪ 长久结合作用
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❖静电作用力 静电作用力是正负电荷相互吸引产生的作用
力 ❖疏水作用力 疏水作用力又称为疏水键。它是由侧链的疏
水基团相互接近. 而形成的一种作用力。对 维持分子的三、四级结构起着重要的作用。 每一个蛋白质都具有疏水基团和亲水基团。
胶体金诊断试剂工艺 配方原则
内容
一、和膜相关的配方和原理 二、和金子垫相关的配方和原理 三、和样品垫相关的配方和原理 四、相关问题
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一、和膜相关的配方和原理
电镜下的NC膜
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硝酸纤维膜生产工艺图
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孔径定义的问题
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❖蛋白质疏水性状和亲水性状 当蛋白质溶解在溶剂中时，蛋白质处于非常
稳定的状态，此时蛋白质的亲水基团展开 在外，疏水基团收缩在内，亲水基团和水 分子接触，保证了溶解性的状态；当蛋白 质沉淀出来时，疏水基团展开，亲水基团 收缩，此时为疏水状态，也呈现不稳定的 固体状态，疏水基团和其他固体物的疏水 基团通过疏水作用力结合，达到固定的目 的。
蛋白邦定作用力
▪ 电荷作用力（静电作用 力）
胶体金的生产
❖胶体金的形成是还原HAuCl4.
❖HAuCL4 + e-
Au0
❖还原剂越强，得到的金颗粒越小
❖生产 40nm诊断用金颗粒一般用柠檬酸三钠
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胶体金颗粒的形成
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胶体金的生产
❖2种重要步骤
▪ 直接形成 ▪ 分步形成
❖大多数人用分步形成
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蛋白结合到固相材料上
❖ 蛋白结合到固相材料上是一个多步骤过程 ❖ 取决于
▪ 蛋白溶液扩散到固相表面 ▪ 蛋白从溶液中分离出来 ▪ 蛋白吸附到固相上 ▪ 蛋白重排到最低能态
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吸附过程
溶液中的蛋白
吸附
蛋白转移到表面区域 蛋白在表面重排
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为负电荷分布。
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高质量结合物
❖单个分散的颗粒 ❖圆形颗粒 ❖很少聚集 这样得到的胶体稳定性 和重复性好
Cluster free, high quality gold reagent
Clustered, poor quality gold reagent Made by：QS HLJ
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“潜水艇” 效应
❖表面活性剂处理过的膜在使用时的常见问 题
❖因为使用的表面活性剂是水溶性的 ❖喷膜时这些表面活性剂被“冲走”了
Made by：QS HLJ
反应动力学
❖流速增加,反应速率减低 ❖流速增加,检测时间缩短 ❖流速增加,灵敏度降低 ❖流速增加,试剂用量增加 ❖流速增加,背景降低 ❖距离增加,流速降低 ❖孔径增加,蛋白结合量减少
孔径对侧向层析速度的影响
标称孔径 (m)
3 5 8 12
层析 4.5 cm 的时间 (sec)
245 185 140 100
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不同种类膜的 IgG结合能力
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不同种类膜的 BSA结合能力
Made by：QS HLJ
为什么蛋白会结合到膜上?
结合力是什么?
多位点结合
只有1个位点的结合是可逆的
多位点结合使得蛋白稳定在固相表面， 即使其中的每个单位点都是可逆的
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影响蛋白结合的因素
▪ 蛋白缓冲液 ▪ 使用的膜 ▪ 蛋白自身 ▪ 应用体系
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蛋白缓冲液
❖没有通用的缓冲液，不同的系统必须分别 优化。
❖作用：提供适合的PH, 改善亲水性, 增溶性, 提高稳定性
❖盐
▪ 通常不会影响 ▪ 对某些蛋白，两性离子的盐类有助于蛋白结合 ▪ 减少信号强度，消假阳
Made by：QS HLJ
❖糖：对包被蛋白的稳定性有重要作用，减 缓老化速度，也可以增加亲水力。
❖惰性蛋白：对消除假阳有重要作用 ❖表面活性剂：增加亲水力，也可增色。
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缓冲液的基本成分
Made by：QS HLJ
二、和金子垫相关的配方和原理
❖和金子垫相关的工艺和配方有： 1）标记工艺； 2）金标稀释液 3）金垫处理液
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标记工艺
❖胶体金：一般指金的水溶液，又称金溶胶。 ---金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶
胶。 其中分散的金颗粒直径一般在1~100nm之间，
▪ 比较容易控制颗粒大小，CV也比较小 ▪ 能够生产出大颗粒胶体金
Made by：QS HLJ
颗粒大Байду номын сангаас对胶体的影响
Made by：QS HLJ
蛋白标记原理
❖蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，依 靠静电引力或疏水力或共价键，被牢固 地吸附于胶体金颗粒表。由于蛋白质分 子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个 蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互 接触，使该胶联溶液较为稳定。
各种缓冲系: Tris-HCl, PB, CB等 盐类：NaCl 糖：蔗糖，海藻糖等 表面活性剂：Tween20，Triton x-100等 惰性蛋白：Casein等 防腐剂 ：叠氮钠，卡松等
Made by：QS HLJ
推荐的起始缓冲液
❖10mM Phosphate pH 7.0 3% Ethanol
Made by：QS HLJ
要点
❖蛋白的预处理
❖使用低浓度和正确的pH值，确保最小的聚 集
❖合适的蛋白量（可通过盐滴定进行评价）
❖搅拌速度、容器的洁净程度、离心的速 度
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盐滴定
❖盐滴定不能衡量蛋白单层的形成 ❖盐滴定只能代表盐溶液中多少量的蛋白可
以使胶体金稳定 ❖pH和时间都会有影响
❖定律: “蛋白在缓冲液中越不稳定，蛋白结合力越
强”
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缓冲液的优化
❖ 离子强度
▪ 对于蛋白从溶液中脱离出来很重要，少量的离子强度， 蛋白难以从溶液中脱离沉淀出来，过量的的离子强度， 溶液配制中就已会出现沉淀。
❖ pH
▪ 蛋白在等电点最不稳定
❖ 沉淀剂
▪ 通常用醇降低蛋白的稳定性，也可润湿膜，减少膜带 有的静电，利于结合包被。
▪ 静电 ▪ 疏水力
这两种结合力的效应是什么?
▪ 使蛋白从溶液中分离出来 ▪ 长久结合作用
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❖静电作用力 静电作用力是正负电荷相互吸引产生的作用
力 ❖疏水作用力 疏水作用力又称为疏水键。它是由侧链的疏
水基团相互接近. 而形成的一种作用力。对 维持分子的三、四级结构起着重要的作用。 每一个蛋白质都具有疏水基团和亲水基团。
胶体金诊断试剂工艺 配方原则
内容
一、和膜相关的配方和原理 二、和金子垫相关的配方和原理 三、和样品垫相关的配方和原理 四、相关问题
Made by：QS HLJ
一、和膜相关的配方和原理
电镜下的NC膜
Made by：QS HLJ
硝酸纤维膜生产工艺图
Made by：QS HLJ
孔径定义的问题
Made by：QS HLJ
Made by：QS HLJ
❖蛋白质疏水性状和亲水性状 当蛋白质溶解在溶剂中时，蛋白质处于非常
稳定的状态，此时蛋白质的亲水基团展开 在外，疏水基团收缩在内，亲水基团和水 分子接触，保证了溶解性的状态；当蛋白 质沉淀出来时，疏水基团展开，亲水基团 收缩，此时为疏水状态，也呈现不稳定的 固体状态，疏水基团和其他固体物的疏水 基团通过疏水作用力结合，达到固定的目 的。