DNA指纹技术的原理与应用

DNA指纹技术的原理与应用
生物技术1001班，谢晓梅，0306100209
摘要：随着分子生物学和遗传性的迅速发展，遗传多态性的研究已经从形态水平深入到分子水平。

DNA指纹技术是分子生物学中一种新技术，它是从分子水平区别不同种类生物之间以及同种生物之间差异的重要手段，为DNA多态性的研究提供了便利的技术手段，同时在法医学、医学、遗传育种、物种进化等方面得到广泛应用。

本文综述了DNA多态性研究与DNA指纹技术的基本原理、具体分析技术、应用以及前景等。

关键词：DNA多态性；DNA指纹图谱；原理；技术；应用
1.DNA指纹技术的原理
1.1.DNA的多态性
多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或者多种不连续的变异型或基因型或等位基因，也称之为遗传多态性。

每一个个体在遗传上的不同不仅表现在基因产物上，其本质是DNA水平上的差异。

一般是由于DNA分子中不编码蛋白质的区域和没有重要调节功能的区域发生了中立突变，这些突变构成的DNA变异，在群体中如果大于10%，则称为DNA分子水平的遗传多态性，简称DNA多态性。

1.1.1DNA多态性的发现
1980年，Wyman和White在人DNA文库中的随机片段中分
离到一个可揭示DNA多态性的高变重复序列。

随后，1985年，Jeffrey 等用人肌红蛋白基因内含子中33bp的核心序列的高变重复序列片段做探针，获得了好像人的指纹一样具有高度特异的DNA“指纹图”，并首次用于亲子鉴定中，为DNA多态性应用与法医学等领域开辟了新纪元，也促进了DNA多态性的更广泛更深入的研究。

1.1.2 DNA多态性的分类
DNA多态性包括DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性和单核苷酸多态性。

1.1.
2.1DNA片段长度多态性（FLP）
DNA片段长度多态性，即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起限制性内切酶位点的变化，而导致DNA酶切片段长度的变化，又称为限制性片段长度多态性，这是一类比较普遍的多态性。

1.1.
2.2DNA重复序列多态性（RSP）
DNA重复序列的多态性，特别是短串联重复序列，如小卫星DNA和微卫星DNA，主要表现在重复序列拷贝数的变异。

小卫星DNA，又称可变数目的串联重复序列（VNTR），由15-65bp的基本单位串联而成，总长通常不超过20kb，重复次数在人群中是高度变异的，VNTR决定了小卫星DNA长度的多态性。

微卫星DNA，又称简单重复序列（SSR）,其基本序列只有1-8bp，通常只重复10-60次。

1.1.
2.3单核苷酸多态性（SNP）
单核苷酸多态是指由单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子多态性，有时也包括由多个核苷酸插入或缺失造成的点突变，SNPs是人类基因组中最常见、分布最广泛DNA多态性类型，人类基因组中总共有300万个SNP，平均每1000个碱基中就有一个SNP。

SNP是一种双等位基因形式的多态性；而微卫星DNA是多等位基因形式的多态。

DNA芯片技术的建立使人们有可能迅速大量搜寻SNP，而人类基因组中SNP的数量远远多于微卫星多态，相当一部分SNP还直接或间接与个体间的表型差异、人类对疾病的易感性或抵抗力相关，这使人们重新认识到检测SNP更为重要。

1.2.DNA指纹技术
1.2.1 DNA指纹图谱的产生
1980年，Wyman与WhiteL21在人类基因组DNA的研究中发现了一个高度变异位点。

1982年，Bell等发现并证实了高度多态区域串联着重复的短序列单位，重复单位数目的差异导致了这种高度的可变性，称之为小卫星。

1985年，英国莱斯特大学遗传系的Jeffrey 等用人的肌红蛋白基因内含子高变区重复序列的核心作为探针，从人的基因库中筛选出8个小卫星的重组克隆。

尽管这8个小卫星的重复单位的长度(16～64bp)和序列不完全相同，但都含有一段相同的核心序列。

他们用小卫星33．15做探针，与人基因组酶切片段进行Southern杂交，在低严谨条件下杂交产生由10多条带组成的杂
交图谱，不同个体杂交图谱上，产生的带的位置是千差万别的。

随后他们用另外一个小卫星探针33．6进行测试，获得了类似的图谱。

所产生的图谱在不同个体之间均存在明显差异性，与人的指纹相似，表现出高度的个体特异性。

因此称为DNA指纹图谱(DNA fingerprint)，采用的方法称DNA指纹技术(DNA fingerprinting)。

1.2.2 DNA指纹技术的基本原理
DNA指纹是基于生物DNA序列多态性的差异。

（1）不同种生物体含有不同的DNA序列；
（2）同种生物体既有相同的DNA序列，又具有不同的DNA 序列。

由于核苷酸序列是相对稳定的，因而可以利用现代分子生物学技术寻找这些差异，进而达到鉴别生物种类的目的。

基于上述原理，DNA指纹技术应运而生，通过进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示的DNA带型差异在紫外光下成像，从而得到DNA指纹图，通过DNA指纹图的差异达到鉴别的目的。

2.DNA指纹技术较成熟的分析方法
2.1.限制性片段长度多态性分析（RFLP）
RFLP是指用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后，含同源序列的酶切片段在长度上的差异。

限制性内切酶能高度专一地识别和切割DNA分子中特定的位点，如果因碱基的突变、插入或缺失，或染色体机构的变化导
致生物个体或者群体间的酶切位点的消失或新的酶切位点产生，这些都会导致在酶消化后RFLP的产生，将这些片段电泳分离、与标记的探针杂交放射自显影后，便可得到RFLP图谱，从而揭示DNA序列水平上的多态性。

具体流程如下：
因为由限制性内切酶切割特定位点产生的，可靠性较高，但是RFLP技术相对而言操作繁琐费时，其次是具有种属特异性，且只适应单、低拷贝基因，多态信息含量低，在个体识别上有很大的局限性，限制了其实际应用。

2.2.随机扩增多态性分析（RAPD）
以PCR技术为基础，由一系列人工随机合成的寡核苷酸单链（10bp左右）为引物，对基因组DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。

由于整个基因组存在众多反向重复序列，须对每
一随机引物单独进行PCR 。

单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。

引物结合位点DNA 序列的改变以及 两扩增位点之间DNA 碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经凝胶电泳分离后通过EB 染色，便可检测到DNA 片段的多态性。

具体流程如下：
RAPD 具备PCR 效率高、特异性强、样品用量少，检测比较容易以及引物设计随机的优点，但是试验中由于RAPD 随机设计的引物一般较短，对于一些PCR 的因素更为敏感，重复性较差，结果不稳定。

2.3.
扩增片段长度多态性分析 （AFLP ）
AFLP 对基因组酶切片段进行选择性扩增，不同物种的基因组DNA 大小不同，经两种限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性酶切片段。

使用特定的双链接头与酶切DNA 片段连接作为扩增反应的DNA 模板，用特异性设计的含有选择性碱基的
引物对模板DNA进行扩增。

扩增产物经凝胶电泳分离，然后根据图谱检出多态性。

被扩增的DNA限制性酶切片段由两种限制性内切酶产生，一个为酶切位点较少的限制性酶(如EcoR I)，另一个为多酶切位点的限制酶(如Mse I)。

所以，AFLP反应主要扩增由上述两种酶共同酶切的片段。

特异性引物的设计对AFLP成功与否至关重要。

引物由三部分组成：①核心碱基序列，该序列与人工接头互补；②限制性内切酶识别序列；③引物3’端的选择碱基。

AFLP兼具了RAPD和RFLP的优点，具有较高的稳定性，用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点，因此可以通过少量效率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组的AFLP图谱。

但是，AFLP对基因组纯度和反应条件要求较高，当基因组的不完全消化会影响到实验结果，此外其分析试剂盒价格昂贵，引物的同位素标记又涉及到放射性安全问题。

2.4.微卫星（SSR）
微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，一般以1-6bp为核心序列头尾相连排列而成，在基因组中，每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。

研究发现每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，在物种间具有较高的同源性，据此可设计引物进行PCR扩增，所得带有放射性标记的扩增片段，以获得SSR指纹图谱。

SSR具有多态性检出率高、信息含量大、共显性标记、实验操作简单、结果稳定可靠等优点，还可以避免把来自不同位点但大小相同的等位基因混淆的缺点。

但是，要获得微卫星标记必须建立、筛选基因组含有重复序列的克隆、测序，实验工作量比较大、费时。

3.DNA指纹技术的应用
3.1. 法医学鉴定
3.1.1 犯罪证据
现今世界各国的许多犯罪案件用常规的办案方法是很难破案的。

DNA指纹技术的应用，这一难题便迎刃而解了。

自从英国的Jeffrey教授1985年发现并建立DNA指纹图谱的检验方法以来，很多疑案难案纷纷告破,特别是对强奸和暴力犯罪特别有效。

3.1.2 遗骸识别
在战争、空难、地震、火灾等灾难中遇难失踪人员的遗骸，可以通过DNA指纹图谱技术进行识别，最终确认其身份。

如美国在寻找二战和越南战争中失踪人员的遗骸都是通过DNA指纹图谱技术找到的。

此外在惩治犯罪方面，美国总统奥巴马在全国电视演讲时宣布基地组织领导人本拉登被击毙，此消息真实性备受世人关注，在美国中情局的面部识别系统已经确认死者是本拉登本人后，又称经DNA检测显示有99.9%的确定性证实确实本拉登。

3.1.3 亲子鉴定
DNA指纹技术与传统亲子鉴定方法相比，有以下区别:
（1）亲子鉴定的传统方法是通过血型及生化多态性来实现的，此法快速而有效，但存在某些技术限制，比如需要大量新
鲜血样和专门的实验室，需要许多独立的标记。

然而，DNA
指纹可以同时检测好些高度多态性位点，却只需要少量血
样(不一定新鲜)，并对其它任何组织，如被毛、皮屑等也
同样有效。

（2）DNA指纹的另一特征是不需要专门的实验室，程序相对简
单。

若用非放射性标记的DNA探针则使用一般商业性试剂
即可进行DNA指纹鉴定。

因此，在亲子鉴定上，DNA指纹将
可能有效取代血液多态性。

（3）随着探针和酶的增多，DNA指纹的分辨能力将会增强，足以处理父母未知个体的亲子鉴定问题。

这是经典的血液和
生化多态性方法无能为力的。

（4）DNA指纹的实验室费用相对较低。

3.2. 遗传育种
DNA指纹技术可以进行亲子鉴定、物种定性分类、判断种间亲缘关系、预测杂种优势，筛选出优势品种等。

对动物进行亲子鉴定，尤其是在稀有物种中如大熊猫，可以解决大熊猫人工饲养繁殖中亲子鉴定和避免近亲繁殖的难题，对大熊猫异地保护和拯救大熊猫物种有着深远的影响。

在菌类分类筛选中，DNA指纹技术功不可没。

因细菌、真菌等数目庞大，分布广泛，形态复杂，有的具有多形性，特别是有些种类的有性型和无性型分开存在，形态差异也很大，传统的形态学特征难以区分，所以借助DNA指纹技术，分类鉴定显得快捷很多。

如周洪波等人在中度嗜热混合菌浸出黄铜矿研究的实验中，利用PCR-RFLP技术，鉴定细菌种类，寻找目的菌群。

3.3 疾病诊断及癌症研究
遗传性疾病的基因诊断：通过分析与某些遗传性疾病基因位点旁侧的DNA多态性片段相关的位点，即可作出产前基因诊断。

目前，应用这种方法可诊断的遗传性疾病有：冠心病、血友病、镰刀形细胞性贫血等。

癌症的基因诊断：DNA指纹图谱可较全面地反映DNA的变异，有利于揭示肿瘤细胞基因突变的情况，如胃癌、乳腺癌细胞中的DNA多态性图谱与正常细胞的就有明显区别，这为进一步研究肿瘤的发病机理提供了一种新的方法。

4.应用前景
DNA指纹技术在法医学、遗传学、医学、农牧业、工业生产中都得到了大量的应用；在今后的发展中，随着DNA指纹技术的不断发展和完善，必将大大推动在这些领域的进程与发展。

参考文献：
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