【CN109609530A】一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用【专利】
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代理人 张勇
(51)Int .Cl . C12N 15/61(2006 .01) C12N 9/90(2006 .01) C12P 19/24(2006 .01) C12P 19/12(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的
应用 ( 57 )摘要
本发明公开了一种海藻糖合成酶及其在海 藻糖生产中的应用，属于酶工程技术领域。本发 明海藻糖合成酶的酶活较高 ，将携带本发明海藻 糖合成酶的 大肠杆菌诱导培养12h ，即可使粗酶 液中海藻糖合成酶的比酶活高达35 .2U/mg，将携 带本发明海藻糖合成酶的谷氨酸棒杆菌诱导培 养12h ，即可使粗酶液中 海藻糖合成酶的比 酶活 高达33 .5U/mg；本发明海藻糖合成酶突变体的比 酶活与海藻糖转化率均较野生型海藻糖合成酶 有了较为明显的提高 ，其中 ，海藻糖合成酶突变 体K246A的比酶活较野生型酶提高了1 .43倍，海 藻糖转化率较野生型酶提高了约15％。
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CN 109609530 A
说 明 书
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一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用
技术领域 [0001] 本发明涉及一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用，属于酶工程技术领 域。
背景技术 [0002] 海藻糖(Trehalose)是一种自然界中广泛存在的二糖，由两个葡萄糖通过α,α-1 , 1-糖苷键连接而成 ，最初被Wiggers从黑麦麦 角菌中分离出来 ，广泛存在于细菌 、真菌 、酵 母、低等蕨类植物、藻类、昆虫以及无脊椎动物中。 [0003] 海藻糖在生物体内除作为结构成分以及提供能量以外，最重要的作用是作为一种 典型的 应激代谢物 ，在干燥、低温 、高渗等许多环境条件下保护生物体细胞内的蛋白 质、脂 类、糖类、核酸等组分不受破坏，进而保护细胞免受伤害，因此，海藻糖已成为疫苗、酶、活体 组织和细胞的生物活性保存的重要保护剂 ；同时 ，海藻糖对酸和热具有高度稳定性 ，可防止 淀粉老化和蛋白 质变性 ，可抑制脂肪酸败 ，具有矫味矫臭功能 ，具有高玻璃化转变温度、低 吸湿性、低甜度，这些特性均使它在食品加工业、医药业、农业、生化制品业和化妆品产业得 到广泛应用，成为上万种产品的添加剂。 [0004] 可以说，海藻糖已成为世界上最重要的低聚糖资源之一。 [0005] 海藻糖有多种生产方法，包括直接提取法、发酵法、基因重组法、化学合成法和酶 转化法。其中 ，酶转化法由 于具有转化率高 、专一性强 、作 用温 和、无污染等优点 ，被认为是 最有发展潜力的工业生产方法。 [0006] 目前，酶转化法使用的酶主要有三种，包括海藻糖磷酸化酶、麦芽寡糖基海藻糖合 成酶以 及海藻糖合成酶。其中 ，海藻糖磷酸化酶需 消耗价格昂贵的高能磷酸化合物UDP-葡 萄糖 和6-磷酸葡萄糖 ，在生产成本上很难有竞争优势 ；麦芽寡糖基海藻糖合成酶 和海藻糖 合成酶可分别以淀粉的水解产物麦芽糊精和者麦芽糖为底物生产海藻糖，具有较强的竞争 优势。 [0007] 然而，使用麦芽寡糖基海藻糖合成酶生产海藻糖最终会积累大量的麦芽三糖等低 聚糖 ，进而对海藻糖纯度造成影响 ；海藻糖合成酶 则由 于酶活 和海藻糖转化率较低难以 进 行大规模工业生产。 [0008] 因此，急需找到酶活和海藻糖转化率高的海藻糖合成酶以解决其难以进行大规模 工业生产的问题。
(10)申请公布号 CN 109609530 A (43)申请公布日 2019.04.12
权利要求书1页 说明书8页 序列表11页
CN 109609530 A
CN 109609530 A
权 利 要 求 书
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1 .一种海藻糖合成酶，其特征在于，编码所述海藻糖合成酶的基因如下： (a)所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No .1所示； (b)与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有海藻糖合成酶活性的蛋白质。 2 .一种海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过将权利要求1所述的海藻 糖合成酶的第246位赖氨酸和/或第165位丙氨酸和/或第178位苯丙氨酸进行突变得到的。 3 .如权利要求2所述的海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过将权利要 求1所述的海藻糖合成酶的第246位赖氨酸突变为丙氨酸得到的 ，此突变体命名为K246A ； 或所述突变体是通过将权利要求1所述的海藻糖合成酶的第165位丙氨酸突变为苏氨 酸得到的 ，此突变体命名为A165T ； 或所述突变体是通过将权利要求1所述的海藻糖合成酶的第178位苯丙氨酸突变为酪 氨酸得到的 ，此突变体命名为F178Y。 4 .编码权利要求1所述海藻糖合成酶或权利要求2或3所述海藻糖合成酶突变体的基 因。 5 .携带权利要求4所述基因的重组质粒。 6 .携带权利要求4所述基因或权利要求5所述重组质粒的宿主细胞。 7 .权利要求1所述海藻糖合成酶的制备方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求6 所述的宿主细胞，先将权利要求6所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，然后将发 酵液进行离心收集菌体，最后将菌体进行破碎获得海藻糖合成酶。 8 .权利要求2或3所述海藻糖合成酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法为使用 权 利要求6所述的 宿主细胞 ，先将权 利要求6所述的 宿主细胞接 种至发酵培养基中 进行发 酵，然后将发酵液进行离心收集菌体，最后将菌体进行破碎获得海藻糖合成酶突变体。 9 .一种生产海藻糖的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1所述海藻糖合成酶 或权利要求2或3所述海藻糖合成酶突变体或权利要求6所述宿主细胞，将权利要求1所述海 藻糖合成酶或权利要求2或3所述海藻糖合成酶突变体或权利要求6所述宿主细胞添加入含 有麦芽糖的反应体系中进行反应。 10 .一种可用于生产海藻糖的制剂，其特征在于，所述制剂的成分包含权利要求1所述 海藻糖合成酶或权利要求2或3所述海藻糖合成酶突变体或权利要求6所述宿主细胞。
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
Βιβλιοθήκη Baidu
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910078599 .3
(22)申请日 2019 .01 .28
(71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号
(72)发明人 饶志明 吴傲 张显 徐美娟 杨套伟 邵明龙
(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211
(51)Int .Cl . C12N 15/61(2006 .01) C12N 9/90(2006 .01) C12P 19/24(2006 .01) C12P 19/12(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的
应用 ( 57 )摘要
本发明公开了一种海藻糖合成酶及其在海 藻糖生产中的应用，属于酶工程技术领域。本发 明海藻糖合成酶的酶活较高 ，将携带本发明海藻 糖合成酶的 大肠杆菌诱导培养12h ，即可使粗酶 液中海藻糖合成酶的比酶活高达35 .2U/mg，将携 带本发明海藻糖合成酶的谷氨酸棒杆菌诱导培 养12h ，即可使粗酶液中 海藻糖合成酶的比 酶活 高达33 .5U/mg；本发明海藻糖合成酶突变体的比 酶活与海藻糖转化率均较野生型海藻糖合成酶 有了较为明显的提高 ，其中 ，海藻糖合成酶突变 体K246A的比酶活较野生型酶提高了1 .43倍，海 藻糖转化率较野生型酶提高了约15％。
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CN 109609530 A
说 明 书
1/8 页
一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用
技术领域 [0001] 本发明涉及一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用，属于酶工程技术领 域。
背景技术 [0002] 海藻糖(Trehalose)是一种自然界中广泛存在的二糖，由两个葡萄糖通过α,α-1 , 1-糖苷键连接而成 ，最初被Wiggers从黑麦麦 角菌中分离出来 ，广泛存在于细菌 、真菌 、酵 母、低等蕨类植物、藻类、昆虫以及无脊椎动物中。 [0003] 海藻糖在生物体内除作为结构成分以及提供能量以外，最重要的作用是作为一种 典型的 应激代谢物 ，在干燥、低温 、高渗等许多环境条件下保护生物体细胞内的蛋白 质、脂 类、糖类、核酸等组分不受破坏，进而保护细胞免受伤害，因此，海藻糖已成为疫苗、酶、活体 组织和细胞的生物活性保存的重要保护剂 ；同时 ，海藻糖对酸和热具有高度稳定性 ，可防止 淀粉老化和蛋白 质变性 ，可抑制脂肪酸败 ，具有矫味矫臭功能 ，具有高玻璃化转变温度、低 吸湿性、低甜度，这些特性均使它在食品加工业、医药业、农业、生化制品业和化妆品产业得 到广泛应用，成为上万种产品的添加剂。 [0004] 可以说，海藻糖已成为世界上最重要的低聚糖资源之一。 [0005] 海藻糖有多种生产方法，包括直接提取法、发酵法、基因重组法、化学合成法和酶 转化法。其中 ，酶转化法由 于具有转化率高 、专一性强 、作 用温 和、无污染等优点 ，被认为是 最有发展潜力的工业生产方法。 [0006] 目前，酶转化法使用的酶主要有三种，包括海藻糖磷酸化酶、麦芽寡糖基海藻糖合 成酶以 及海藻糖合成酶。其中 ，海藻糖磷酸化酶需 消耗价格昂贵的高能磷酸化合物UDP-葡 萄糖 和6-磷酸葡萄糖 ，在生产成本上很难有竞争优势 ；麦芽寡糖基海藻糖合成酶 和海藻糖 合成酶可分别以淀粉的水解产物麦芽糊精和者麦芽糖为底物生产海藻糖，具有较强的竞争 优势。 [0007] 然而，使用麦芽寡糖基海藻糖合成酶生产海藻糖最终会积累大量的麦芽三糖等低 聚糖 ，进而对海藻糖纯度造成影响 ；海藻糖合成酶 则由 于酶活 和海藻糖转化率较低难以 进 行大规模工业生产。 [0008] 因此，急需找到酶活和海藻糖转化率高的海藻糖合成酶以解决其难以进行大规模 工业生产的问题。
(10)申请公布号 CN 109609530 A (43)申请公布日 2019.04.12
权利要求书1页 说明书8页 序列表11页
CN 109609530 A
CN 109609530 A
权 利 要 求 书
1/1 页
1 .一种海藻糖合成酶，其特征在于，编码所述海藻糖合成酶的基因如下： (a)所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No .1所示； (b)与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有海藻糖合成酶活性的蛋白质。 2 .一种海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过将权利要求1所述的海藻 糖合成酶的第246位赖氨酸和/或第165位丙氨酸和/或第178位苯丙氨酸进行突变得到的。 3 .如权利要求2所述的海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过将权利要 求1所述的海藻糖合成酶的第246位赖氨酸突变为丙氨酸得到的 ，此突变体命名为K246A ； 或所述突变体是通过将权利要求1所述的海藻糖合成酶的第165位丙氨酸突变为苏氨 酸得到的 ，此突变体命名为A165T ； 或所述突变体是通过将权利要求1所述的海藻糖合成酶的第178位苯丙氨酸突变为酪 氨酸得到的 ，此突变体命名为F178Y。 4 .编码权利要求1所述海藻糖合成酶或权利要求2或3所述海藻糖合成酶突变体的基 因。 5 .携带权利要求4所述基因的重组质粒。 6 .携带权利要求4所述基因或权利要求5所述重组质粒的宿主细胞。 7 .权利要求1所述海藻糖合成酶的制备方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求6 所述的宿主细胞，先将权利要求6所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，然后将发 酵液进行离心收集菌体，最后将菌体进行破碎获得海藻糖合成酶。 8 .权利要求2或3所述海藻糖合成酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法为使用 权 利要求6所述的 宿主细胞 ，先将权 利要求6所述的 宿主细胞接 种至发酵培养基中 进行发 酵，然后将发酵液进行离心收集菌体，最后将菌体进行破碎获得海藻糖合成酶突变体。 9 .一种生产海藻糖的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1所述海藻糖合成酶 或权利要求2或3所述海藻糖合成酶突变体或权利要求6所述宿主细胞，将权利要求1所述海 藻糖合成酶或权利要求2或3所述海藻糖合成酶突变体或权利要求6所述宿主细胞添加入含 有麦芽糖的反应体系中进行反应。 10 .一种可用于生产海藻糖的制剂，其特征在于，所述制剂的成分包含权利要求1所述 海藻糖合成酶或权利要求2或3所述海藻糖合成酶突变体或权利要求6所述宿主细胞。
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
Βιβλιοθήκη Baidu
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910078599 .3
(22)申请日 2019 .01 .28
(71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号
(72)发明人 饶志明 吴傲 张显 徐美娟 杨套伟 邵明龙
(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211