RuBisCo
§4补充2-光呼吸
§４补充2-光呼吸§４补充2-光呼吸基本知识概念：植物细胞在光照和高O2低CO2情况下发生的吸收O2和释放CO2的过程。
产生的原因：Rubisco是一种兼性酶，其催化方向取决于CO2和O2的分压。
当CO2分压高而O2分压低时,RuBP（C5）与CO2经此酶催化生成2分子的PGA(C3)，进行光合作用；反之,则RuBP 与O2在此酶催化下生成1分子PGA和1分子磷酸乙醇酸(C2化合物),后者在磷酸乙醇酸酯酶的作用下变成乙醇酸，是光呼吸的底物，进入C2途径。
光呼吸与光合作用是密切联系的。
光呼吸在叶绿体与过氧化体中吸收氧气，在线粒体中放出CO2。
光呼吸是一个氧化过程，被氧化的底物是乙醇酸。
场所：叶绿体、细胞质基质、线粒体意义：1、消耗掉光反应产生的过多的H]和ATP，防止强光对细胞结构的破坏。
2、光呼吸产生的CO2可以作为暗反应阶段的原料光呼吸与细胞呼吸（暗呼吸）的区别于联系联系：都是消耗O2产生CO2的过程区别条件：光呼吸需要光，与光合作用同时进行；细胞呼吸有光无光都可进行能量：光呼吸消耗能量；细胞呼吸释放能量场所：光呼吸在叶绿体、细胞质基质和线粒体；细胞呼吸在细胞质基质和线粒体巩固练习1、光呼吸是进行光合作用的细胞在光照和O2/CO2值异常时发生的一种生理过程（如下图所示），该过程是细胞在Rubisco酶的催化下，消耗O2，生成CO2，借助叶绿体、线粒体等多种细胞器共同完成的消耗能量的反应。
虽然光呼吸大约抵消了30%的光合作用储备能量，但其对细胞有着很重要的保护作用。
（1）据图可知，光呼吸与光合作用都利用了______________为原料，但光合作用在______阶段实现了该物质的再生，而光呼吸最终将该物质彻底氧化分解并产生______。
（2）Rubisco酶的存在场所为__________，这种酶既能催化物质“C-C-C-C-C”和O2反应，也能催化物质“C-C-C-C-C”和CO2反应，其两面性与酶的_______（特性）相矛盾，推测O2/CO2值______（高、低）时，有利于光呼吸而不利于光合作用。
rubp羧化酶活性测定方法
RuBP羧化酶是一种双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故齐全名为RuBP羧化酶/加氧酶（RuBP carboxylase/oxygenase,简称Rubisco）。
Rubisco 普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富，占叶可溶性蛋白质的50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白质。
在叶绿素间质中浓度可达300mg/ml。
同时，Rubisco 也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。
通过本实验进一步掌握光合作用中的关键酶Rubisco的性质，用分光光度法测定Rubisco的羧化活性。
【实验原理】Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下：RuBP+CO2+H2O----2PGA3-PGA+ATP------1,3-二磷酸甘油酸+ADP1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+ -------3-磷酸甘油醛+NAD+通过上述偶联反应，可讲3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。
【实验材料】植物叶片【仪器设备及用品】紫外分光光度计，冷冻离心机，匀浆器或研钵，移液管等【试剂药品】1.RuBPCase提取介质：40mmol/L(PH7.6)Tris-HCl缓冲液，内含10mmol/LMgCl2、0.25mmol/LEDTA和5.0mmol/L谷胱甘肽。
2.反应介质：0.1mmol/LTris-HCl缓冲液（PH7.8），内含12mmol/LMgCl2和0.4mmol/LEDTA.3.50mmol/LATP溶液4.50mmol/L磷酸肌酸（Cr~P）溶液5.0.2mmol/LNaHCO3溶液6．160U/L磷酸肌酸激酶溶液7．25mmol/LRuBP溶液8．160U/L3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液9．160U/L3-磷酸甘油酸激酶溶液10. 5mmol/LNADH溶液附注：U/L表示每升酶制剂含有多少酶活力单位。
Rubisco活化酶与植物抗逆性
Rubisco活化酶与植物抗逆性蒋德安，王盾，杨万军，金松恒，何漪，冯旭萍(浙江大学生命科学学院杭州余杭塘路388号 310058)高光强、干旱和高温胁迫是限制植物生长，降低光合速率的主要逆境因子。
Rubisco 活化酶(RCA)最先作为体内催化Rubisco活化而得名。
然而，人们在逆境条件下发现RCA可能参与一些植物的抗逆性。
本研究以反义RCA水稻为材料，研究了光强、干旱和高温胁迫对植物光合作用的影响。
结果表明：(1)当RCA含量降低到正常的1/3时，反义rca水稻的线性电子流(ETR)和最大光合电子传递速率(J max)大大低于野生型水稻，其ETR的光饱和点也大大低于野生型，PSII反应中心激发能捕获效率(F v′/F m′)和光化学猝灭(qP)明显下降。
在ETR达到光饱和后，反义rca水稻的非光化学猝灭(NPQ)和高能态猝灭(qE)都还在随光强持续上升。
在饱和光强下，反义rca水稻的NPQ 和qE与野生型水稻相差不大，但在中等光强下，NPQ和qE则大大高于野生型。
反义rca水稻的作用光关闭后荧光瞬时上升的幅度显著地提高，而且P700+在暗中还原速率也明显快于野生型水稻，这些都表明RCA含量减少促进了PSI的环式电子流，和类囊体腔的酸化和能量的耗散，以缓解碳同化下降导致激发能过剩。
(2)当RCA含量恢复到正常的2/3时，水分充足条件下，光合作用各参数恢复到正常水平，但反义rca水稻对干旱胁迫的反应比野生型敏感，主要表现为叶片易卷曲，光合迅速下降。
当土壤含水量降到田间最大持水量的60%时，野生型的光合下降了11%，而反义水稻下降了40%。
野生型的气孔导度降低了30%，而反义水稻下降了60%。
此外，反义rca水稻的蒸腾速率，内部CO2浓度和Rubisco初始活力的降低也比野生型明显，但Rubisco大小亚基的含量变化很少。
RCA含量表现出干旱上调趋势，尤其是RCAI(大亚基)含量。
在上述条件下，干旱除降低PSII 的线性电子流外，对其他叶绿素荧光参数，叶片叶绿素含量和含水量均无显著影响。
藻类固定co2的机制
藻类固定co2的机制藻类的二氧化碳固定机制藻类是一种光合生物群，它们利用光能将无机碳(如二氧化碳)转化为有机化合物。
二氧化碳固定是藻类代谢的关键步骤，它不仅为自身的生长提供碳源，也是地球碳循环的重要组成部分。
碳酸酐酶催化的二氧化碳水合大多数藻类利用碳酸酐酶(CA)催化的方式来固定二氧化碳。
CA 是一种金属酶，可将二氧化碳水合为碳酸(H₂CO₃)。
碳酸是一种不稳定的化合物，可以迅速分解为氢离子(H⁺)和碳酸氢根离子(HCO₃⁻)。
鲁比斯科催化的卡尔文循环碳酸氢根离子(HCO₃⁻)随后被核糖二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)固定。
Rubisco是一种关键的酶，它催化二氧化碳与核糖二磷酸(RuBP)之间的反应，形成两个分子3-磷酸甘油酸(3-PGA)。
3-PGA是卡尔文循环中的第一个稳定中间产物。
卡尔文循环卡尔文循环是一个循环反应系列，将3-PGA还原为甘油醛-3-磷酸(G3P)，即一种基本的糖类。
该循环包括一系列酶促反应，利用光合作用产生的能量(ATP)和电子传递体(NADPH)将二氧化碳还原。
G3P的利用G3P可被用来合成多种生物分子，包括葡萄糖、淀粉、脂肪和蛋白质。
葡萄糖是藻类的主要能量来源，而淀粉则是储存的碳源。
脂肪是重要的能量储备，蛋白质对于细胞结构和功能至关重要。
其他二氧化碳固定机制除了碳酸酐酶和Rubisco之外，一些藻类还进化出了其他二氧化碳固定机制。
例如，某些蓝藻和红藻使用丙酮酸羧化酶(PEP羧化酶)途径，将二氧化碳固定为丙酮酸。
生理和环境因素对二氧化碳固定的影响藻类的二氧化碳固定受到多种生理和环境因素的影响。
例如，光照强度、温度、营养状况和pH值的变化都会影响酶的活性，从而影响二氧化碳固定的速率。
全球碳循环中的作用藻类二氧化碳固定是全球碳循环的重要组成部分。
通过固定大气中的二氧化碳，藻类有助于调节地球的碳平衡。
它们吸收的碳被转化为有机物质，最终被储存为沉积物或通过食物链传递。
潜在的应用藻类的二氧化碳固定能力引起了研究人员和产业的极大兴趣。
研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性
研 究 生: 陈 相 辉 导 师: 王忠教授 专 业: 植 物 学
一、研究目的和意义
Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶， ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase ） 是光合碳代谢中的关键酶，处于光合碳还原和光合碳氧化 这两个方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着
光合作用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对光合速率起
着决定性作用。本课题拟以小麦为实验材料，采用 ELISA 测试技术，研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性，这些结 果将有助于进一步阐明 Rubisco 及Rubisco 活化酶的作用 机制，为最终提高作物的光合产量提供理论依据。
二、选题依据
Rubisco活化酶的SDS-PAGE图谱
A为Rubisco活化酶;B为标准蛋白
六、研究计划
1、Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备
2、Rubisco和Rubisco活化酶ELISA标准曲线的制定
3、C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比较及其 与光合作用的关系
4、光暗处理对小麦光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶
的影响 5、不同施氮水平对小麦光合速率和Rubisco、Rubisco活 化酶的影响 6、 Rubisco和Rubisco活化酶单克隆抗体制备初探
谢谢！
55 000
14 800
Rubisco的电泳图谱
A为Rubisco的ND-PAGE图谱 源自为Rubisco的SDS-PAGE图谱
2、 小麦Rubisco活化酶的的提纯和纯度鉴定
2.5 2
核酮糖1,5-二磷酸羧化酶检测试剂盒(RuBP比色法)
核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)检测试剂盒(RuBP比色法)简介：植物光合作用的中，C3途径是所有植物共有的光合碳同化途径，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，Rubisco或RuBPCo或RuBPCase)是一种酶(EC 4.1.1.39)，又称1,5-二磷酸核酮糖羧化酶，分子量约为53kD，由8个大亚基和8个小亚基组成，是光合作用中决定碳同化速率的关键酶，该酶活力的大小反应了植物光合能力的强弱，RUBP羧化酶是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量占叶绿体可溶蛋白50-60%。
在植物叶片发育过程中，此酶活性呈规律性的变化。
Leagene核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)检测试剂盒(RuBP比色法)检测原理是在Rubisco催化核酮糖1,5-二磷酸(RuBP)，1分子后者与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA)，后者通过3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-1,3-二磷酸，并使NADH氧化。
因此1分子CO2被固定，伴随2分子NADH氧化，由NADH氧化的量就可计算Rubisco的活性，通过分光光度比色法(分光光度计)测定340处吸光度的变化，计算出NADH的消耗速率进一步推算出核酮糖1,5-二磷酸羧化酶活性水平。
该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中核酮糖1,5-二磷酸羧化酶活性，25T规格的试剂盒可检测23-24个样本。
组成：编号名称TE044925TStorage试剂(A): Rubisco Lysis buffer 250ml 4℃试剂(B): Rubisco Assay buffer15ml 4℃试剂(C): ATP Solution 3ml -20℃试剂(D): CP Solution 1.5ml -20℃试剂(E): CPK Solution 1ml -20℃试剂(F): PGK Solution 1ml -20℃试剂(G): GAPD Solution 1ml -20℃试剂(H): NADH 1支-20℃试剂(I): 碱性基液3ml RT 使用说明书1份自备材料：1、研钵或匀浆器2、离心管3、低温离心机4、恒温箱或水浴锅5、比色杯6、分光光度计操作步骤(仅供参考)：1、准备样品：①植物样品：取植物组织清洗干净，切碎，按植物组织：Rubisco Lysis buffer按一定比例，加入预冷的Rubisco Lysis buffer，冰浴情况下充分匀浆或研磨。
rubp羧化酶活性测定方法
RuBP羧化酶是一种双功能酶，即可催化RuBP的羧化反应，又可催化加氧反应，故齐全名为RuBP羧化酶/加氧酶（RuBP c arboxy l ase/oxy genas e,简称Rubisco）。
Rubisco 普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富，占叶可溶性蛋白质的50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白质。
在叶绿素间质中浓度可达300mg/ml。
同时，Rubisco 也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。
通过本实验进一步掌握光合作用中的关键酶Rubisco的性质，用分光光度法测定Rubisco的羧化活性。
【实验原理】Rubisco催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下：RuBP+CO2+H2O----2PGA3-PGA+ATP------1,3-二磷酸甘油酸+ADP1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+ -------3-磷酸甘油醛+NAD+通过上述偶联反应，可讲3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。
【实验材料】植物叶片【仪器设备及用品】紫外分光光度计，冷冻离心机，匀浆器或研钵，移液管等【试剂药品】1.RuBPCase提取介质：40mmol/L(PH7.6)Tris-HCl缓冲液，内含10mmol/LMgCl2、0.25mmol/LEDTA和5.0mmol/L谷胱甘肽。
2.反应介质：0.1mmol/LTris-HCl缓冲液（PH7.8），内含12mmol/LMgCl2和0.4mmol/LEDTA.3.50mmol/LATP溶液4.50mmol/L磷酸肌酸（Cr~P）溶液5.0.2mmol/LNaHCO3溶液6．160U/L磷酸肌酸激酶溶液7．25mmol/LRuBP溶液8．160U/L3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液9．160U/L3-磷酸甘油酸激酶溶液10. 5mmol/LNADH溶液附注：U/L表示每升酶制剂含有多少酶活力单位。
C_3和C_4植物叶细胞中Rubisco和RCA的免疫金标记定位
C 3和C 4植物叶细胞中Rubisco 和RCA的免疫金标记定位洪 健,何黎平,王卫兵,胡东维(浙江大学分析测试中心,浙江杭州310029) 基金项目:国家自然科学基金资助项目(N o.39970067). Rubisco (1,52二磷酸核酮糖羧化酶Π加氧酶)是植物进行光合碳同化的关键酶,它参与了光合作用碳固定和光呼吸碳氧化过程,调节两者之间的相对比例,其含量和活性与光合速率密切相关。
RC A(Rubisco 活化酶)是近年发现的一种可以调节Rubisco 活性的酶,能使Rubisco 在植株体内条件下达到最大活化程度。
有关这两个酶的性质、结构及生理功能已有不少研究,但细胞学定位的报道十分有限,尤其是RC A 的细胞定位无论是在低等植物还是高等植物中都很少见。
我们运用免疫金标记电镜技术,对几种C 3和C 4植物进行了Rubisco 和RC A 细胞学定位研究,明确了C 3和C 4植物中两种酶在叶绿体内的分布。
1 材料与方法实验植物叶片切成1mm ×3mm 小片,3%多聚甲醛21%戊二醛4℃下固定2h ,在-20℃冰箱中乙醇梯度脱水至100%,用Lowicryl K 4M 低温包埋剂在-20℃下逐级渗透、包埋,在-20℃冰箱中用长波长紫外线照射72h ,再室温照射24h ,使样品完全聚合,超薄切片捞在镍网上。
免疫金标记时先用ddH 2O 湿润切片5min ,然后在BL 液上封闭处理30min ;分别用水稻Rubisco 和RC A 多抗血清适当稀释后孵育60min ,再次漂洗和封闭后用15nm 胶体金A 蛋白探针标记60min ,经漂洗后用醋酸铀和柠檬酸铅各染色15min ,在日本J E O L 的J E M 21200EX 透射电镜下观察。
对照样品在标记时省却一抗孵育步骤。
2 结果与讨论经免疫金标记的切片在透射电镜下观察,属于C 3植物的水稻、大麦、青菜、蚕豆等Rubisco 金标记颗粒密集地分布在叶肉细胞的叶绿体基质区域,在基粒片层和基质片层上很少,在表皮气孔的保卫细胞、韧皮部细胞叶绿体中也有分布。
1,5-二磷酸羧化酶／加氧酶（Rubisco）
1,5-二磷酸羧化酶／加氧酶（Rubisco）植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月363核酮糖.1,5.二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)梅杨,李海蓝,谢晋,罗红艺华中师范大学生命科学学院,武汉430079Ribulose-I,5-bisphosphateCarboxylase/oxygenase(Rubisco)MEIY ang,LIHai—Lan,XIEJin,LUOHong—YiCollegeofLifeSciences,CentralChinaNormaliVPl魄Wuhan430079,China提要:文章就核酮糖一1,5.二磷酸羧化酶,加氧酶(Rubisco)的分布,结构,性质,分类与功能的研究进展作了介绍.关键词:核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco);Rubisco类似蛋白(RLP);羧化/氧化值;热稳定性;分类核酮糖一1,5一二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose一1,5一bisphosphatecarboxylase/oxygenase,Rubisco)是植物光合作用过程中固定CO,的关键酶,同时也参与植物的光呼吸代谢途径,消耗植物光合作用合成的有机物,由此造成的净光合效率损失高达50%(Lundqvist和Schneider1991;熊晓然等2003;Ashida等2005).因此,研究Rubisco对提高植物的光合作用效率有重要意义.自从1953年Calvin等在研究光合碳循环过程中证实其存在至今,有关Rubisco的一系列问题不断得到阐明,人们对其性质,结构,类型和功能等诸多方面有了更深入的了解,这方面的研究己取得了较大进展,本文就此作介绍.1Rubisco的分布与定位Rubisco广泛分布于具光合功能的细胞器中.它是一个含量很丰富的酶,据估计全世界Rubisco 的量约有4×10吨.Rubisco在C植物中主要定位于叶肉细胞叶绿体问质中,在基粒片层上也有少量分布;在C植物中则定位于维管束鞘细胞中的叶绿体问质内.低等藻类的Rubisco主要定位在淀粉核上.许多化能自养细菌和蓝藻中存在多角形细胞内含物,其中含有大量的羧化酶,称之为羧基化小体.羧基化小体最初是从氧化硫细菌中分离出来的,并且含有大量的Rubisco.有研究表明,羧基化小体是原核生物体内储存Rubisco的重要场所,能够协助Rubisco在低浓度的CO,条件下完成羧化.那不勒斯硫杆菌(Thi0baci,,U neapolitanus)的Rubisco缺陷菌株无羧基化小体的形成,且必须在高浓度的CO,下才能生长(Baker等1998).海洋氢弧菌(Hydrogenovibriomarinus)MH一110在CO,浓度低于0.15%时就会形成羧基化小体(Y oshizawa等2004).2Rubisco的结构采用x射线晶体衍射技术,人们解析了不同来源的Rubisco的晶体结构,包括烟草(Nicotiana tabacum),菠菜(Spinaciaoleracea),深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum),莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii),蓝藻聚球藻(y,zcDcDcc"PCC 6301),喜温红藻(Galdieriapartite),绿色硫细菌(chlorobiumtepidum),超耐热原始菌(菌, ThermococcuskodakaraensisKOD1)等(Kitano等2001;Parry等2003;Li等2005).Rubisco一般由多个大亚基(LSU)和小亚基(ssu)组成,其中大亚基的分子量为50～55kDa,小亚基为1218kDa(Ashida等2005).大亚基具有催化功能,小亚基仅具有调节作用.迄今的研究认为,Rubisco的大亚基由N,C两个结构域组成.N结构域从N末端开始,包括137个氨基酸,其中含有5股D折叠.C结构域中含有丰富的0c螺旋,其中以0c/D桶状结构域(al Dbarreldomain)最引人注目.它包括8个0c螺旋和8个D折叠,彼此连接成8个环.一个大亚基收稿2006.11—20修定2007—03一l2资助华中师范大学精品课程建设项目.通讯作者(E—mail:******************.ca:Tel:************).364植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月的羧基末端为另一个大亚基氨基末端部分覆盖,形成漏滴状的活性中心,Mg参与其中.Mg与亚基中的3个氨基酸残基所含有的氧原子发生作用,它们分别是氨甲酰化的Lys,侧链Asp3和Glulq4(Lundqvist和Schneider1991).C端结构域同时含有一个特征性的突环(Lo0p6).Loop6影响酶与气体分子(包括CO和O)的亲和性,一系列发生在环内的突变均能影响酶的羧化/氧化值(Q 值);在形成烯醇化中间产物的过程中,Loop6也起关键性的作用(Parry等2003).Loop6同时还影响酶活性状态的形成与维持.活性中心的模拟分析表明,Rubisco是否处于活性状态与活性中心(Lysl75,Lys201)和Loop6(Lys334)的3个Lys残基密切相关(熊晓然等2003).小亚基远离活性中心,其含有4个反向平行的p折叠和2个0c螺旋,p折叠和0c螺旋的核心含有疏水的氨基酸残基及与大小亚基相互作用有关的保守氨基酸残基.小亚基能促进CO,与Mg对酶的活化,维持和稳定酶的活化构象.Spreitzer (2003)认为,小亚基可能在进化过程中扮演聚集大亚基活性位点的角色,小亚基可能有更多特异性功能.3Rubisco的类型根据Rubisco大亚基氨基酸序列同源性及空间结构的相似性,可以将其分为4类,即I,II,III,IV型(表1).I型主宴存在于能够进行光合作用的有机体内,如高等植物,真核藻类,蓝藻,光能及化能自养细菌及其它一些原核生物,它由8个大亚基和8个小亚基组成,呈LS的结构.Tabita(1995)分析不同的I型Rubisco结构后,又将其分为"Green—like"和"Red—like"2类,并进一步将其划分为A,B,C及D4个亚类.II型Rubisco由2罐个大亚基组成,呈L的结构,其分子量为110-450kDa,主要存在于一些光能及化能合成细菌,海产甲藻如共生甲藻(SymbiodiniumSpp.),膝钩藻(Gonyaulaxpolyedra)等中(Rowan等1996;Nassoury等2001).尽管I型与II型Rubisco在活性位点上的氨基酸残基高度保守,但II型与I型的大亚基的同源性仍很低,仅为28%(Kitano等2001;Liao等2004).III型也仅由大亚基组成,呈L结构,存在于某些嗜热古生菌如菌,詹氏甲烷球菌等中(Klenk等1997;Watson和Tabita1999;Kitano等2001).有人研究Tk-Rubisco的结果表明,它是由大亚基组表1不同来源的Rubisco及其羧化/氧化值,结构和功能代表植物;一表示暂无相关数据.好热性硫磺细菌含有2类Rubisco:rbcL—l和rbcL.2(Karlin和Mrazek2000):超耐热原始菌先前报道称为PyrococcuskodakaraensisKODI(Kitano等2001).植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月365成的(L)的十聚体,与菠菜中的I型Rubisco有36%的同源性,与深红红螺菌中的Ⅱ型Rubisco有30%的同源性(Kitano等2001);分析詹氏甲烷球菌Rubisco的序列表明,它与蓝藻中的聚球藻I型Rubisco有41%的同源性,与深红红螺菌中的II型Rubisco有33%的同源性(Watson和Tabita1999).尽管以上三类Rubisco相互之间的同源性较低,但已知的Rubisco参与羧化或氧化核酮糖一1,5一二磷酸(ribulose一1,5一bisphosphate,RuBP)过程的所有保守氨基酸残基在I,II和III型中都存在,除了Ⅲ型中Phe.∞被其它氨基酸所取代(Ashida等2005).IV型又称为Rubisco类似蛋白(rubisco—like—protein,RLP),存在于非光合细菌,部分不依赖卡尔文循环的光合细菌和古生菌如绿色硫细菌,好热性硫磺细菌rbcL.,泥生绿菌,枯草芽孢杆菌等中(Klenk等1997;Watson和Tabita1999;Hanson和Tabita2001,2003Ashida等2003).它与I,II,III相比,许多活性位点保守氨基酸残基缺失,同源性甚低.如泥生绿菌,好热性硫磺细菌cL.,枯草芽孢杆菌中分别有11,5,9个活性位点的保守氨基酸残基被其它氨基酸所取代;枯草芽孢杆菌RLP与I,II,III型仅有23%,23%,30%的序列同源性(Ashida等2005).实际上,在许多细菌中同时存在编码I型和Ⅱ型Rubisco的结构基因,但在正常情况下两者并不同时表达(English等1992;Karlin和Mrazek 2000).那不勒斯硫杆菌在rbcL,突变的情况下, rbcL,,可表达生成II型Rubisco,但菌体必须在高浓度的CO,下才能生长良好(Baker等1998).海洋氢弧菌MH一110含有3个拷贝的Rubisco基因(CbbLS—和CbbLS-2属于I型,CbbM属于II型).Y oshizawa等(2004)研究证实海洋氢弧菌MH一110在不同浓度的CO,条件下,三者以不同的组合形式进行表达.脱氮硫杆菌在厌氧条件下以硝酸盐作为电子受体能同时表达生成I,II2种类型Rubisco.最近,Carr~一Mlouka等(2006)报道,在世界范围内广泛引起水华的铜绿微囊藻PCC7806 (MicrocystisaeruginosaPCC7806)细胞内同时存在I,IV型Rubisco.沼泽红假单胞菌(Rhodopseudo. monaspalustris)除了含有I,II型Rubisco,还同时存在2类不同的RLP(Larimer等2004).这些发现导致不同类型Rubisco的共存问题变得更加复杂,这对研究Rubisco的进化可能有意义.4Rubisco的性质与一般的酶相比,Rubisco具有2个显着的特征.一是非专一性,即Rubisco既能催化羧化反应,也能催化加氧反应,具有双功能性;二是低效性,即Rubisco的催化效率较一般酶低,是由于Rubisco酶转换数低(真核生物的Rubiscok约为3~5S～,来源于不同生长温度的植物Rubiscok略有不同),催化效率有限(Watson和Tabita1999;Sage2002~Ashida等2005).4.1热稳定性Rubisco有一定的热稳定性,但不同来源的Rubisco的热稳定性存在较大差异.水稻Rubisco在50℃保温7min达到最大活力,随后迅速下降,30min后酶活性下降至40%;烟草Rubisco在50℃保温20min达最大活力,30min后活力还维持在98%左右;菠菜Rubisco氨甲酰化后经60℃的10mmo1.LDTr处理1h活力还维持50%(陈为钧等1999).在嗜热古生菌如菌中,Rubisco的热稳定性极高.Tk.Rubisco在30—110℃范围内均能有效完成十聚体结构的组装(Maeda等2002);在40～100℃范围内能够保持有效的羧化酶活性,且活性随温度(40-90℃)的升高而上升;在80℃保温15h活力仍维持50%(Ezaki等1999).Maeda等(2002)采用定点突变(E63S,R66S,D69S)的方法,进一步研究证实Tk—RubiSCO耐热性依赖于特殊的五角形晶体结构(pentagonalstructure),此种结构的特点是二聚体相互接触紧密,接触面上的氨基酸残基之间存在离子间的相互作用,并形成8对离子键.同时,低聚状态对耐热性的维持也有影响.Tk.Rubisco的十聚体结构提高了蛋白质的变性温度,从而进一步提高了Tk菌适应高温的能力.4.2酶促反应动力学参数一般而言,C植物及景天科酸代谢植物Rubisco的Kin(CO)在12～26 ~tmol?L～,C4植物Rubisco的Kin(CO2)为28～63 ∞1.L-(Chen等2002).但不同类型植物Rubisco Kin(CO2)仍存在差异,如水稻RubiscoKin(CO2)一般为12lxmo1.L～,而喜温红藻(Galdieriapartita)的K(co2)仅为6.6~tmol?L一,这种喜温红藻366植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月RubiscoK~(CO)值在当时被认为是所有Rubisco中最小的(Uemura等1997).Ezaki等(1999)研究菌的结果表明,Tk—RubiSCO具有更强的羧化能力,在CO,饱和,90℃高温条件下,Tk.Rubisco同化CO,的速率可达19.8x10.nmo1.mg(酶蛋白)? min～.Rubisco羧化与氧化反应的活力比按/V o=()/(V oKc)([CO:】/【O2】)计算.其中,,分别表示羧化和氧化反应的最大反应速率;&,K. 分别代表羧化和氧化反应的米氏常数;【CO】和【O】为气体浓度;(c.)/(.c)称特性因子(specificityfactor),即羧化/氧化值(Q值)(Uemura等1997;Parry等2003).一定种类Rubisco的Q值为一常数,但不同来源的RubiscoQ值有较大差异(表1).绿色高等植物Rubisco的Q值一般在90～95之间;蓝藻的Q值也有35～40;细菌的Q值一般在9～45之间.从喜温红藻中发现的I型RubiscoQ值高达238(25℃),是高等植物Q值的2.5倍,说明其具有极强的固定CO:的能力(Uemura等1997).更为重要的是喜温红藻本身就属于植物,这对从亚基水平上改变Rubisco动力学性质及Q值,提高植物光合效率有重大意义. Tk—Rubisco存在更高的Q值且随温度的升高而上升,在50℃时为70,70℃时上升至250,90℃时则达到最大值310(Ezaki等1999).与此相反,喜温红藻的RubiscoQ值随着温度的升高反而降低(Uemura等1997).Watson和Tabita(1999)测定詹氏甲烷球菌Q值的结果表明,其羧化能力极差,Q值只有0.5,是所有Rubisco中Q值最低的.5Rubisco的功能已经证实,O是羧化酶反应的竞争性抑制剂;同样CO是加氧酶反应的竞争性抑制剂.因此,Rubisco处于光合碳还原(光合作用)和光合碳氧化(光呼吸)2个方向相反但又相互连锁的循环反应的交叉点上.当co#o:的浓度比值较高时,促进Rubisco催化的羧化反应.羧化反应一般分为烯醇化,羧化,水合,C—C键断裂,质子化5个阶段(Lundqvist和Schneider1991;Li等2005). Rubisco催化游离的CO,共价结合到底物RuBP上,进而生成两分子的3一磷酸甘油酸(3一phosphoglyc—ericacid,PGA),推动C3-PCR循环.当CO2/O2的浓度比值较低时,促进Rubisco催化的加氧反应,RuBP即裂解产生一分子的磷酸乙醇酸和一分子的PGA,前者进一步分解成乙醇酸和磷酸,参与绿色植物的光呼吸循环.研究初期,人们认为Rubisco的功能主要集中在光合碳同化及光呼吸过程中.然而随着各种不同类型RubiSCO的陆续发现和研究的深入, Rubisco的功能呈现出多样化(表1).詹氏甲烷球菌及其它产甲烷古生菌中的III型RubiSCO参与PRPP—RuBP—PGA途径(Ashida等称之为RuPP通路) (Finn和Tabita2004;Ashida等2005).在这一途径中RuBP的合成前体是1一焦磷酸.5一磷酸.核糖(5一phospho—D—ribose一1一pyrophosphate,PRPP),脱磷酸后经NAD氧化生成RuBP,接着在Rubisco的催化下与CO,结合生成PGA.RLP一般无羧化酶活性,但它能催化2,3一二酮基一5一甲硫戊基.1一磷酸(2,3一diketo一5一methythio—pentyl一1一phosphate,DK—MTP.1一P)的烯醇化反应,与硫代谢密切相关(Ashida等2003;Li等2005;Carr6一Mlouka等2006).枯草芽孢杆菌RLP在腺苷蛋氨酸补救合成途径中作为DK—MTP一1一P烯醇化酶发挥作用(Ashida等2003,2005).在其r/p突变株中导入深红红螺菌的II型Rubisco后,该菌株竟然可恢复生长,说明光合类型的Rubisco可能仍然保持着作为一腺苷蛋氨酸补救合成途径中DK—MTP.1一P烯醇化酶的功能.也有人认为是由于RubiSCO对底物存在一定范围的适应(Li等2005).绿色硫细菌RLP与硫代谢和氧化应激(oxidativestress)有关(Hanson和Tabita2001).铜绿微囊藻PCC7806RLP在硫代谢过程中也起一定作用.半定量RT—PCR的结果显示,在硫缺乏的情况下,吐Ⅳ的转录是正常状况(硫充足)下的22倍(Carte—Mlouka等2006).Rubisco作为植物叶中的主要含氮有机物之一,必然与植物对氮的吸收,利用及循环有关.研究不同种类C植物氮利用的情况表明,较高的Rubisco,是NADP苹果酸酶类型比NAD苹果酸酶类型具有更高的氮利用率的主要原因(Ghannoum等2005).Rubisco与植物雄性不育也有一定的联系.刘祚昌等(1983)研究玉米,高粱,水稻,小植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月367 麦和烟草等作物的细胞质雄性不育系Rubisco的结果表明,其活性均高于相应的保持系.水稻光周期敏感核不育农垦58S经长光照及红光间断暗周期处理表现为雄性不育,其Rubisco的活性明显低于可育状态(夏凯等1989).Schwender等(2004)最新发现甘蓝型油菜(Brassicanapus)中Rubisco参与植物中碳转化为油的代谢通道,此通道可导致碳作为油贮存的效率达到最大.6结语有人曾将红藻中高效率Rubisco酶的小亚基基因转入植物叶绿体中并得到表达,但表达出的小亚基却不能与植物本身的大亚基组装成全酶(Whitney和Andrews2001).这可能是由于小亚基存在特异性的修饰,或者协助组装的分子伴侣无法识别异源亚基.要解决上述问题尚待深入研究Rubisco的组装机制.众多的研究表明,低等藻类和古生菌体内存在不同类型Rubisco.Lonsdale等(1983)从玉米(Zeamays)线粒体中分离到一个与Rubisco大亚基同源的基因,此基因在大肠杆菌中表达合成的分子量为2lkDa的蛋白能与小麦的Rubisco抗体反应.如何科学地解释Rubisco的共存现象,共存现象与Rubisco的分子进化是否存在某种内在联系,植物体内是否也存在多拷贝的Rubisco基因,均待进一步研究.微生物Rubisco的研究大大扩展了人们对Rubisco类型及功能的认识.序列同源性比较分析的结果显示,III型和Ⅳ型Rubisco比I型及II型更原始;枯草芽孢杆菌及铜绿微囊藻PCC7806RLP功能及突变株的研究结果表明,m型与Ⅳ型Rubisco中可能存在Rubisco的原始形式,或者说它们与Rubisco的原始形式在结构及功能上有更多的相似性.根据研究枯草芽孢杆菌RLP的结果,Ashida等(2003,2005)提出一条Rubisco可能的进化路线,认为光合类型Rubisco正是由枯草芽孢杆菌RLP演变而来的.以上研究和发现并未完全解决Rubisco的分子进化问题,但却为人们指明了方向,即通过研究和分析微生物Rubisco的结构和功能有可能部分或完全揭示Rubisco的分子进化历程.参考文献陈为钧,赵贵文,顾月华(1999).RubisCO的研究进展.生物化学与生物物理进展,26(5):433-.-436刘祚昌,李继耕,罗会馨,陈福太(1983).二磷酸核酮糖羧化酶与细胞质雄性不育性的研究.遗传,10(1):362吕红,周集体,王竞,安利佳(2003).原核生物Rubisco的研究进展.微生物学通报,30(2):82—85夏凯,肖翊华,刘文芳(1989).湖北光敏感核不育水稻光敏感期叶片中ATP含量与RuBPcase活力的分析.杂交水稻,(4): 412.30熊晓然,陈蔚梅,冯胜彦,郭明雄,艾建宇,吴斌(2003).植物Rubisco 活性中心的模拟分析.中国生物化学与分子生物,19(4):493--498AshidaH,DanchinA,Y okotaA(2005).Wasphotosynthetic RuBisCOrecruitedbyacquisitiveevolutionfromRuBisCO—likeproteinsinvolvedinsulfurmetabolism?ResMicrobiol,l56:6lll8AshidaH,SaitoY,KojimaC,KobayashiK,OgasawaraN,Y okotaA(2003).AfunctionallinkbetweenRuBisCO—likeproton ofBacillusandphot0syntheticRuBisCo.Science,302:286~290BakerSH,JinS,AldrichHC,HowardGT,ShivelyJM(1998). 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Presenceofastructurallynoveltyperibulose—bisphosphate carboxylase,0xygenaseinthehyperthermophilicarchaeon, Pyrococcus七Dd口七口r口P,lfK0D1.JBiolChem.274: 5078~5082FinnMW,TabitaFR(2004).ModifiedpathwaytOsynthesize ribulosel,5-bisphosphateinmethanogenicarchaea.J Bacteriol,186"6360,45366Ghannoum0,EvansJR,ChowWS,AndrewsTJ,ConroyJP.yon CaemmererS(2005).FasterRubiscoisthekeytosuperior nitrogen?-useefficiencyinNADP?-malicenzymerelativetO NAD—malicenzymeC4grasses.PlantPhysiol,l37:638,650 HansonTE,TabitaFR(2001).Adbulose—l,5-bisphosphatecar—368植物生理学通讯第43卷第2期,2007年4月boxylase,oxygenase(RubisCO)-likeproteinfromchlorobium tepidumthatisinvolvedwithsulfurmetabolismandthe responsetooxidativestress.ProcNatlAcadSciUSA,98:4397-4402HansonTE,TabitaFR(2003).Insightsintothestressresponseand sulfurmetabolismrevealedbyproteomeanalysisofa chlorobiumtepidummutantlackingtheRubisco-likeprotein. 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rubisco大小亚基表达量
rubisco大小亚基表达量
植物中的rubisco是一种由大亚基（大约55 kDa）和小亚基
（大约15 kDa）组成的复合物。
大亚基负责催化光合作用中
二氧化碳的固定，而小亚基则起调控和稳定复合物的作用。
rubisco的大小亚基在植物中的表达量可以受到多种因素的影响，包括植物的生长状态、环境因素（如光照、温度、二氧化碳浓度等）以及营养状况等。
一般来说，rubisco的表达量与植物对光合作用的需求有关。
在光合作用强烈进行时，rubisco的表达量通常会增加，以满
足植物对二氧化碳固定的需求。
然而，在光合作用受到限制的条件下，如光照不足或二氧化碳浓度低等情况下，rubisco的
表达量可能会减少。
此外，植物对不同环境因素的适应能力也会影响rubisco的表
达量。
例如，在高温环境下，一些植物可能会调节rubisco表
达量以减轻热伤害，并提高对高温的耐受性。
总的来说，rubisco大小亚基的表达量是一个复杂的调控过程，受到多种因素的影响。
研究表明，对rubisco的调控和优化在
提高植物光合作用效率和抗逆能力方面具有重要意义。
2024届高中生物二轮复习讲义 第一篇 主题一 专题(四) 命题点2 CO2固定方式的比较及光呼吸
命题点2CO2固定方式的比较及光呼吸1．C3植物、C4植物和CAM植物固定CO2的方式比较(1)比较C4植物、CAM植物固定CO2的方式相同点：都对CO2进行了两次固定。
不同点：C4植物两次固定CO2是空间上错开；CAM植物两次固定CO2是时间上错开。
(2)比较C3、C4、CAM途径C3途径是碳同化的基本途径，C4途径和CAM途径都只起固定CO2的作用，最终还是通过C3途径合成有机物。
2．光呼吸(1)发生原因：Rubisco是一种双功能酶，当CO2/O2的值高时，可催化C5固定CO2合成有机物；当CO2/O2的值低时，可催化C5结合O2发生氧化分解，消耗有机物，此过程称为光呼吸。
(2)一定条件下光呼吸使光合效率下降25%～30%，抑制光呼吸的措施：适当降低环境中O2浓度或提高CO2浓度。
(3)光呼吸对植物有重要的正面意义，在干旱天气和过强光照下，因为温度很高，蒸腾作用很强，气孔大量关闭，CO2供应减少。
其生理作用体现在：①光呼吸是高耗能反应，可以消耗光反应阶段生成的多余的NADPH和ATP。
②光呼吸的产物有CO2，可以弥补CO2不足，维系暗反应，暗反应也可以消耗掉NADPH和ATP。
③正常光照下体内产生乙醇酸是不可避免的，乙醇酸对细胞有毒害作用，而光呼吸可以消耗乙醇酸。
(4)光呼吸与细胞呼吸的比较项目光呼吸细胞呼吸(有氧呼吸)底物C2化合物糖类等有机物发生部位过氧化物酶体、线粒体、叶绿体细胞质基质、线粒体反应条件光照光或暗都可以能量消耗能量产生能量共同点消耗O2、释放CO21．(2021·全国乙，29)生活在干旱地区的一些植物(如植物甲)具有特殊的CO2固定方式。
这类植物晚上气孔打开吸收CO2，吸收的CO2通过生成苹果酸储存在液泡中；白天气孔关闭，液泡中储存的苹果酸脱羧释放的CO2可用于光合作用。
回答下列问题：(1)白天叶肉细胞产生ATP的场所有__________________________，光合作用所需的CO2来源于苹果酸脱羧和____________释放的CO2。
Rubisco的层析分离和电泳离心
一、实验目的：了解凝胶过滤层析法和SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。
学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
二、实验原理：凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
也叫做分子排阻层析。
一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。
1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。
2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： 1gMr =K―bmR 式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。
在条件一定时，b 和K均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
三、实验步骤：总体流程：小麦幼苗叶片PBS提取离心粗酶液35%-55%（NH4）2SO4PBS溶解1ml (NH4)2SO4样品（每组1个）Sephadex G-25 脱盐脱盐样品 SDS-PAGE染色脱色计算Rubisco的大亚基、小亚基分子量详细流程：1）平衡：20ml: 10*洗脱液. 清洗胶柱。
Rubisco初始和总活性测定参方法
Rubisco初始和总活性测定参方法.取处理第5天的番茄叶片0.3g加入3 mL预冷的50 mmol·L-1 Tris-HCl( pH=7.5，含1 mmol·L-1 EDTA、1 mmol·L-1 MgCl2、12.5% V/V 甘油和10% 可溶性PVP-40）提取液（使用前加10 mmol·L-1 β-巯基乙醇）.初始活力的测定：反应体系含Hepes 50 mmol·L-1 （PH=8.0）、EDTA 1 mmol·L-1 、MgCl2 20 mmol·L-1 、DTT 2.5 mmol·L-1 、NaHCO3 10 mmol·L-1 、A TP 5 mmol·L-1 、磷酸肌醇5 mmol·L-1 、NADH2 0.15 mmol·L-1 、另备3-PGA激酶、肌醇激酶各10U•mL-1、RUBP 0.6 mmol·L-1 ，待温度达到测定温度时迅速加入酶液100μL•mL-1，每隔15～20s记录340nm OD值至1min 为止.总活力的测定：总活力测定须先进行酶的活化.具体方法是：取酶粗提液100μL•mL-1置于活化反应液的比色杯中[最终浓度中各成分的含量为：Tris-HCl 33 mmol·L-1 (PH=7.5)、EDTA 0.67 mmol·L-1 、MgCl2 20 mmol·L-1 、NaHCO3 10 mmol·L-1 ]10min，温度为30℃。
加入反应液使其最终浓度各成分含量为Hepes 50 mmol·L-1 （PH=8.0）、EDTA 1 mmol·L-1 、MgCl2 20 mmol·L-1 、DTT 2.5 mmol·L-1 、NaHCO3 10 mmol·L-1 、ATP 5 mmol·L-1 、磷酸肌醇5 mmol·L-1 、NADH2 0.15 mmol·L-1 、3-PGA激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、肌醇激酶各10U•mL-1、RUBP 0.6 mmol·L-1 .按初始活力测定方法记录OD值.。
RuBP羧化酶活性测定
RuBP 羧化活性一、实验目的RuBP 羧化酶是一种双功能酶，即可催化RuBP 的羧化反应，又可催化加氧反应，故齐全名为RuBP 羧化酶/加氧酶(RuBP carboxylase/oxygenase,简称Rubisco ）。
Rubisco 普遍存在于自养生物中，在C3植物中含量较为丰富，占叶可溶性蛋白质的50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白质。
在叶绿素间质中浓度300mg/ml 。
同时，Rubisco 也是高等植物中有机氮的重要贮藏形式。
通过本实验进一步掌握光合作用中的关键酶Rubisco 的性质，用分光光度法测定Rubisco 的羧化活性。
二、实验原理Rubisco 催化RuBP 与一份子CO2结合，产生两分子PGA ，PGA 在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I （NADH ）氧化，反应如下：RuBP+CO 2+H 2O 2(3-PGA)3-PGA+ATP 1,3-二磷酸甘油酸+ADP 1,3-二磷酸甘油酸+NADH 3-磷酸甘油醛+NAD ++PO 4－3通过上述偶联反应，可讲3-PGA 的变化转变为NADP 的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm 处测定NADP 的减少量来计算酶活力。
三、实验材料、试剂及仪器实验材料：新鲜的小麦叶片、新鲜的玉米叶片实验仪器：匀浆器、研钵，移液管、研钵、冷冻离心机(eppendorf Centrifuge 5417R)、分光光度计(SHIMADZU UVmini-1240)、秒表、石英、微量比色杯等。
反应介质：1. RuBP 羧化酶提取液2. 反应液3. 磷酸肌酸激酶溶液4. 磷酸肌酸溶液5. 3-磷酸甘油酸激酶溶液6. 3-磷酸甘油醛脱氢酶溶液7. NADH 溶液−−−−→−+2Mg RuBPC ，−−−−−→−－磷酸甘油激酶3−−−−−−→−－磷酸脱氢酶甘油醛－38.RuBP溶液9.ATP溶液四、实验步骤1.酶粗提液制备。
RubisCO的分子生物学研究
不同植物的大、小亚基组成全酶来提高羧化活性和
降低加氧活性。现已将菠菜 RubiSCO 大亚基基因与
董晓丽等：RubisCO 的分子生物学研究
番茄小亚基转运肽基因拼接，嵌合基因已整合到烟 草中，转基因的烟草能正常生长。Furbank［19 ］利用 转基因技术培育出降低 RubisCO 蛋白 量 的 烟 草 和 C4 植物黄花菊。最近发现，一种红藻中的 RubisCO 的活性比一般植物的 RubisCO 的活性高 3 倍，科学 家正利用叶绿体转化技术将该基因导入植物［2O］，使
董晓丽等：RubiSCO 的分子生物学研究
RubiSCO 的分子生物学研究!
董晓丽"!!! 周集体 杜翠红! 严 滨!
（!大连理工大学环境工程学院环境基因工程实验室 大连 116012） （!!大连轻工业学院化工系 大连 116034）
摘 要 RubiSCO 是卡尔文循环的关键酶，它既参与光合作用又参与光呼吸作用，调节两 者之间的关系，是所有光合生物进行光合碳同化的关键性酶。光合生物每年约固定 5 X 1014kg CO2，成功固定二氧化碳既可降低温室效应，又可充分利用碳资源。同时，RubiSCO 酶活性的高低直接影响植物的净光合产量。RubiSCO 本身是植物可溶性蛋白中含量最高 的蛋白，是植物体内重要的储藏蛋白。本文对 RubiSCO 的分子生物学研究进展进行了综 述。
不同来源的 RubiSCO 大亚基是很保守的，氨基 酸序列的同源性一般大于 80% ，而小亚基的序列变 化较大。RubiSCO 的活性中心位于大亚基上，而不 在小亚基上。这一点从由单一大亚基组成的多聚体
（如 L2、L4、L6、L8）仍具有催化 RUBP 的羧化和加氧活 性可以得到证实。尽管有时不同来源的 RubiSCO 的 同源性较低，但是位于大亚基活性中心附近的氨基
研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性
光合作用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对光合速率起
着决定性作用。本课题拟以小麦为实验材料，采用 ELISA 测试技术，研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性，这些结 果将有助于进一步阐明 Rubisco 及Rubisco 活化酶的作用 机制，为最终提高作物的光合产量提供理论依据。
二、选题依据
Rubisco和Rubisco活化酶的提取和纯化 Rubisco和Rubisco活化酶抗体的制备 Rubisco和Rubisco活化酶ELISA标准曲线的制定
C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比较及其
与光合作用的关系 光暗处理对小麦光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶
四、 材料、仪器和方法
1、材料与仪器
1.1 材料
植物材料 扬麦5号
动物材料 新西兰大白兔
1.2 试剂与仪器
高速冷冻离心机 液相层析收集系统 垂直板电泳系统 Beckman LS-9800液体闪烁仪 酶联免疫测定仪……
2、酶的提取和纯化
3、 Rubisco及Rubisco活化酶抗体的制备
3.1 免疫过程:
的影响
施氮处理对小麦光合速率和Rubisco、Rubisco活化酶 的影响 Rubisco和Rubisco活化酶单克隆抗体制备初探
试验设计流程
Rubisco和 Rubisco活化酶 的分离提纯 Rubisco和Rubisco 活化酶抗体的制备
抗体的分离与纯化
利用抗体定量测定不同处理下 Rubisco 及Rubisco活化酶的含量
Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直 是光合作用研究的热点问题，如何提高作 物中这两种酶的含量和活性也一直是个悬 而未解决的难题。目前，国内外多以烟草、 菠菜作为研究Rubisco和Rubisco活化酶的 材料，涉及小麦和水稻等作物方面的内容 较少，尤其有关小麦Rubisco活化酶的研 究仍然是国内外研究中的空白。
rubisco化学式
rubisco化学式
核酮糖二磷酸加氧酶（ribulose-diphosphateoxygenase）为催化核酮糖二磷酸被分子氧氧化而产生甘油酸-3-磷酸和乙醇酸磷酸的酶。
简介
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase，通常简写为RuBisCO）是一种酶(EC4.1.1.39)，它在光合作用中卡尔文循环里催化第一个主要的碳固定反应，将大气中游离的二氧化碳转化为生物体内储能分子，比如蔗糖分子，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶可以催化
1,5-二磷酸核酮糖与二氧化碳的羧化反应或与氧气的氧化反应。
同时RuBisCO也能使RuBP进入光呼吸途径。
详细信息
为催化核酮糖二磷酸被分子氧氧化而产生甘油酸-3-磷酸和乙醇酸磷酸的酶，实际就是核酮糖二磷酸羧化酶（EC4．1．1．39）此酶除具羧化酶活性之外在有氧时也具有加氧酶的活性，是构成光呼吸或氧对光合作用抑制（瓦布格效应）的原因。
碳酸氢钠溶液在光合作用中的作用
碳酸氢钠溶液在光合作用中的作用
碳酸氢钠，又称汞气，属于植物信号分子，是由二氧化碳和水经过光能酶体（Rubisco）催化形成的气体产物，在光合作用中起着至关重要的作用。
碳酸氢钠是植物在光合作用中，全球地球气体组成中最重要的组成材料之一：
植物（种植物，海洋植物）不断从大气的二氧化碳中摄取并将其转化为碳水化合物，同时生成碳酸氢钠。
碳酸氢钠，作为光合作用中一个重要的中间体，可以将在生物体内产生的有机物质（酮酸及葡萄糖）进行转化。
在这一过程中，碳酸氢钠溶液可以促进交换反应，起着转换作用。
研究发现，碳酸氢钠能够与糖及酮酸发生双向交叉作用，即可以结合乙酰腺苷促进其合成，也能结合乙酰腺苷促进其分解，从而达到调节作用。
此外，碳酸氢钠溶液的应用还涉及到土壤碳循环的行为。
碳酸氢钠被科学家们
称为“植物胁迫生物响应分子”，它可以协助植物适应枯竭的低碳环境，有助于提高植物的耐荒性。
碳酸氢钠还能通过影响土壤环境中的细菌数量和营养比例，促进土壤碳循环，有助于维持土壤中碳水化合物的可持续性。
综上所述，碳酸氢钠在光合作用中具有重要意义，它不仅可以促进有机物质转换，而且可以调节植物环境条件下的营养通路；且有助于维持土壤中碳水化合物的可持续性，并且能与乙酰腺苷发生双向交叉作用。
是植物生长发育的重要物质，对于植物的正常维持、长期繁殖，成为至关重要的资源。
Rubisco活化酶的分子生物学
１，５－二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶 （ｒｉｂｕｌｏｓｅ－ １，５－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ， Ｒｕｂｉｓｃｏ） 是所有光合生物进行光合碳同化的关键酶，它催 化 Ｒ ｕ Ｂ Ｐ 的羧化和加氧反应，并调节二者之间的 关系，这两个反应的比值决定了植物的碳同化效 率。已有研究表明，虽然 Ｒｕｂｉｓｃｏ 含量约占叶片 可溶性蛋白的一半［ １ ］ ，但它的催化效率却很低。 近年来的研究证明，钝化态 Ｒｕｂｉｓｃｏ 必须经过另 一种酶的活化才能表现出其羧化／加氧活性，这种 酶就是Ｒｕｂｉｓｃｏ活化酶（Ｒｕｂｉｓｃｏ ａｃｔｉｖａｓｅ，ＲＣＡ）。 Ｒｕｂｉｓｃｏ 的活化是决定叶片碳同化效率的关键因 子，因此 Ｒ Ｃ Ａ 的生理、生化和分子生物学的研 究也成为近年来光合作用研究的重要领域之一。
图 １ 活化酶催化钝化态Ｒｕｂｉｓｃｏ转化成活化态Ｒｕｂｉｓｃｏ［２６］
然而，问题在于非活化态的 Ｒ ｕ ｂ ｉ ｓ ｃ ｏ 还能够与 Ｒ ｕ Ｂ Ｐ 结合，改变其构象，形成钝化态的终端复 合物（步骤 ３），这种复合物即不能再被 ＣＯ２ 和 Ｍｇ２＋ 所活化。ＲＣＡ 的作用在于与这种钝化的终端复合 体结合（步骤 ５） ，改变其构象，使 Ｒｕｂｉｓｃｏ 与ＲｕＢＰ 的结合变松弛（步骤 ６），并将 ＲｕＢＰ 从 Ｒｕｂｉｓｃｏ 活 化区域解离下来（步骤 ７），空出 Ｒｕｂｉｓｃｏ 中的 ＣＯ２ 和 Ｍｇ２＋ 结合位点，Ｒ Ｃ Ａ 则转变为非活化状态（ 步 骤 ８）。这样，Ｒｕｂｉｓｃｏ 便可以重新被 ＣＯ２ 和 Ｍｇ２＋ 激活，催化 ＲｕＢＰ 的羧化／加氧反应（步骤 １）。至 于 Ｒ Ｃ Ａ 本身的活化，则需要与 Ａ Ｔ Ｐ 的水解相偶 联，以提供变构所需的能量（步骤 ４），这就是 ＲＣＡ 自身具有 Ａ Ｔ Ｐ ａ ｓ ｅ 活性的原因。也正因为如此， ＲＣＡ 的活性与叶绿体的能荷有密切关系，当叶片 从黑暗中转移到光照下以后，随着光合磷酸化的 进行和 ＡＴＰ 的增加，ＲＣＡ 和 Ｒｕｂｉｓｃｏ 活性有一个 逐渐诱导提高的过程。
碳同化关键酶
碳同化关键酶全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：碳同化关键酶是指在生物体内控制碳同化过程中至关重要的一类酶。
碳同化是生物体内能量转化的重要过程，通过这一过程生物体可以将二氧化碳和水转化为有机物质，同时释放出能量。
在这个复杂而重要的过程中，各种酶扮演着不可或缺的角色，其中碳同化关键酶更是至关重要。
碳同化关键酶主要包括RuBisCO酶、PEPC酶、PPDK酶等。
其中最为重要的酶是RuBisCO酶，即磷酸二酮羧化酶/氧化酶复合物。
它是在光合作用中负责将二氧化碳固定成为有机物质的关键酶。
RuBisCO 酶可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种，Ⅰ型是在植物、藻类和某些细菌中存在，而Ⅱ型则主要存在于颗粒硫细菌中。
该酶的功能是将二氧化碳与五碳糖磷酸核糖联合成为稳定的六碳中间体，然后通过多种反应将这个中间体转化为糖类。
除了RuBisCO酶，PEPC酶也是碳同化中不可或缺的关键酶。
PEPC酶是磷酸化苹果酸羧化酶，它在C4植物中的光合作用中扮演着重要的角色。
在C4植物中，PEPC酶将甲酸脱羧酶产生的三碳酸磷酸化为四碳酸，从而能够更有效地将二氧化碳转化为有机物质。
这种C4途径的碳同化方式可以提高植物对气候变化的适应能力，使其更有效地利用光合作用产生的能量。
另外一个重要的碳同化关键酶是PPDK酶，即磷酸戊糖二酮酸激酶。
PPDK酶在某些植物和一些细菌中起着非常重要的作用。
它能够在缺氧条件下有效地利用能量，并且通过磷酸化戊糖二酮酸来启动异源呼吸途径，使植物可以更有效地进行碳同化。
PPDK酶还参与到其他一些代谢途径中，对植物的生长发育也有一定的影响。
碳同化关键酶在生物体内的重要性不言而喻。
它们通过一系列复杂的反应，将二氧化碳固定成为有机物质，为生物体的能量供给和物质代谢提供了重要的支持。
研究这些酶的功能和调控机制，不仅可以深化我们对生物体代谢过程的理解，还可以为农业生产和环境保护提供重要的借鉴。
相信随着科学研究的不断深入，碳同化关键酶的研究将会取得更加丰硕的成果，为人类社会的可持续发展做出更大的贡献。
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Rubisco
Rubisco,即核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose
bisphosphate carboxylase oxygenase).
是光合作用C3碳反应中重要的羧化酶,也是光呼吸中不可缺少的加氧酶.
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose-1,5-bisphosphate
carboxylase/oxygenase ，通常简写为RuBisCO ）是一种酶(EC 4.1.1.39)，分子量约为550kD ，由8个大亚基和8个小亚基组成，是光合作用中决定碳同化速率的关键酶。
它在光合作用中卡尔文循环里催化第一个主要的碳固定反应，将大气中游离的二氧化碳转化为生物体内储能分子，比如蔗糖分子。
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶可以催化1,5-二磷酸核酮糖与二氧化碳的羧化反应或与氧气的氧化反应。
同时RuBisCO 也能使RuBP 进入光呼吸途径。
同时，它的活性也由光照影响，在暗处，rubisco 的活性受到抑制，这也是为什么在黑暗时，碳反应难以进行的原因。
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶在生物学上有重要的意义，因为它所催化的反应是无机态的碳进入生物圈的主要途径。
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶是植物叶片中含量最丰富的蛋白质，也可能是地球上含量最多的蛋白质。
鉴于它对生物圈的重要性，人们正在努力改进自然界中的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的功能。
Rubinsco 是植物C3途径中的关键酶，同时也是植物光呼吸的关键酶。
Rubinsco 叶绿体基质中催化CO2与Rubp 即1,5-二磷酸核酮糖结合生成2分子3-磷酸甘油酸，进而发生一系列反应，将ATP 中的化学能转化到葡萄糖中。
核酮糖二磷酸缩化酶在植物机体代谢过程中居于中心地位，但它却是效率奇低的操作员。
让我们作一个显而易见的比较：典型的酶分子1秒钟可催化1000个底物分子，但Rubisco 每秒钟仅固定3分子CO2。
植物细胞为弥补低效的缺陷而产生大量的Rubisco 。
此酶约占总叶绿蛋白的50%。
已知生物圈里植物占优势，因此Rubisco 是世界上最丰富的酶。
不仅如此，Rubisco 也奇缺专一性。
在肌红蛋白等氧结合蛋白中，CO2由于体积稍大而易被排除。
与氧结合蛋白的高度专一性恰恰相反，在Rubisco 中，由于O2和CO2分子在形式和化学特性上的相似性，O2分子能顺利结合到CO2结合位点上。
此时，缩化酶就会把O2分子连到糖链上，形成错误的氧化产物。
因此，为纠正Rubisco 非专一性引起的错误反应，植物细胞必须采取一系列高代价的补救措施，这就间接影响了Rubisco 的催化效率。