血吸虫试剂盒主要原材料研究资料

1．血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）（试剂盒检测点原料）

（1）制备方法：

取人工感染1500条日本血吸虫尾蚴45d的家兔肝脏，用生理盐水洗净后经高速捣碎机

捣碎，分样筛分离除去肝脏组织，沉淀离心，收集分离虫卵，依次经200目和300 目尼龙

绢过滤，收集滤渣，即为较纯净的血吸虫虫卵。然后加入10倍量的生理盐水，置玻璃匀浆

器内制成匀浆，用超声粉碎机超声处理（1min×10次），液氮冻融3次，最后以10 000 r/ min

离心30 min ，上清液即为血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA），经0.22um超滤膜过滤除菌后分装，―20℃冻存备用。

（2）抗原性测定

a．测定方法

1)取抗原200 µl加入比色杯内，用分光光度计测定A280和A260OD值；

2)将抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液作1:4、1:8、1:16、1:32、1:64稀释,分别包被于酶标板内

(100ul/孔),37℃3小时；然后倾去抗原液,用洗涤液洗涤3次,每次5分钟；BSA（0.5mg/ml)为对照，同法操作；

3)加样：分别加已作1:100稀释的血吸虫抗体检测质控品、阳性和阴性对照血清各100

µl，空白孔仅加100 µl稀释液。置于湿盒内，37 ℃培育30 分钟；

4)洗板：取出酶标板，甩去孔内液体，每孔注满洗涤液洗涤5 次，每次均需停留30秒后

再甩净拍干；

5)加酶标结合物：除空白对照孔外，每孔加入酶标结合物2 滴，37℃培育30分钟；

6)洗板：同3；

7)显色：每孔加底物和显色剂各1滴，混匀，37℃避光反应10分钟，加终止液1 滴，混

匀，判断结果。

b．判断依据：

1)根据公式计算：样品浓度（mg/ml）=（1.45×A280-0.74×A260 ）×稀释倍数；

2)肉眼观察：不加终止液观察，基本无色或微蓝色为阴性，呈明显蓝色为阳性；

3)仪器判断：酶标仪上450nm读取OD值，待检样本孔的OD值大于阴性对照2.1倍者为

阳性。

c．结果

抗原OD值A280nm 2.1510

抗原OD值A260nm 2.5121

计算公式抗原浓度（mg/ml）=（1.45×A280-0.74×A260 ）×稀释倍数；抗原浓度 1.26mg/ml

比值SEA 阴参阳参血吸虫抗体检测质控品阳参血吸虫抗体检测质控品1:4 0.05 0.45 0.15 9.03 3.08

1:8 0.04 0.51 0.17 10.26 3.48

1:16 0.05 0.52 0.19 10.31 3.78

1:32 0.05 0.49 0.18 9.41 3.52

1:64 0.06 0.61 0.24 10.92 4.35

BSA 0.01 0.04 0.01 0.82 0.11

结论：浓度为1.26mg/ml，经倍比稀释，用于ELISA检测血吸虫抗体阳性临界血清，

1:64(0.02mg/ml)仍呈阳性结果，具有高度的免疫原性,可用于血吸虫抗体检测

（3）工作浓度：

SEA 的作用是作为检测点，包被于硝酸纤维素膜上，用于检测人血清中特异性抗血吸虫抗体。因此，其工作浓度的选择对于检测效果的评价是试剂盒研制的关键技术。如果浓度过高，阳性反应色度过强，易产生假阳性结果；反之，浓度过低，则不易辨别，影响检测的灵敏度。所以，研究目的是选择能较清晰产生反应色度的最低抗原浓度。

方法：

a. SEA抗原原液浓度测定：以紫外分光光度法测定SEA抗原原液A280和A260OD值，根据公式计算浓度（mg/ml）=1.45×A280-0.74×A260 ；

b. SEA稀释：以0.02 mol/L pH8.0 PBS将SEA从1:2至1:10 稀释成9个稀释度，与原液一起分成10个浓度组。

c. 包被：将上述10个浓度的SEA分别点膜，在每块空白反应板中的硝酸纤维素膜（德国Schleicher & Schuell Bioscience，孔径0.45um）上点滴1ul，每个浓度组包被3块，室温干燥2小时后加入2滴封闭液（主要成分为牛血清白蛋白），待干。

d. 效果测试：分别在上述10个浓度组的金标反应板中央小孔内滴加2滴洗涤液，渗入后于反应板中央加25 µl 血吸虫抗体检测质控品（参照血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品低感染度血清(P13)制备，方法见附页），待液体充分吸入，加2滴洗涤液，渗入后分别加3种浓度的显色液（即金标二抗，浓度依据A520OD值确定，制备方法见后），每块反应板加1种浓度的显色液，每种显色液均加4滴，最后加2滴洗涤液，渗入后根据检测点颜色深浅判断效果。

结果：

a. SEA抗原原液OD值：A280为2.1510，A260为2.5121 ，根据公式（mg/ml）=1.45×A280-0.74×A260计算，浓度为1.26 mg/ml。

注：色度判断：++深，+易见，±浅，-无

c. 最适工作浓度选择：金标二抗浓度在1.2 （A520值）时所有金标反应板的背景较深，且制备成本高；0.8时，检测效果较差；1.0时的检测效果最好，在抗原稀释度1:8（0.157mg/ml）仍可清晰显示检测点。因此，抗原最适工作浓度为1:5~1:8范围内（约0.2±0.05mg/ml），而金标二抗的最适工作浓度为1.0（A520值）。

进一步验证试验：

以0.2mg/ml工作浓度的SEA抗原为检测点，1.0（A520值）金标二抗为显色液研制的血吸虫抗体快速检测试剂盒（斑点免疫金渗滤法），采用中国药品生物制品检定所提供的“血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品”（批号：20041108）作为测定血清。其中阴性参考品由15份正常人血清组成，血吸虫病抗体均为阴性，用于测定试剂盒的特异性。阳性参考品由15份强、中、弱阳性血清组成，用于测定试剂盒对血吸虫病抗体阳性血清的检出能力。最低阳性检出参考品为1份血吸虫病抗体阳性样品，从1:2~1:16作倍比稀释，用于测定试剂盒的最低检出量（灵敏度）。诊断试剂的精密性测定由1份中等阳性血清组成，重复检测10次，用于测定试剂盒的精密性（操作方法同1 (3) d ）。

血清份数阴性(数) 阳性(数) 符合率（%）

阴性参考品

15 15 0 100

阳性参考品

15 0 15 100

精密度参考品

10 0 10 100

灵敏度参考品

1:2++(1份) 1:4+(1份) 1:8±(1份) 1:16-(1份)

2．金标二抗（试剂盒显色液原料）

（1）制备方法：

a. 胶体金制备

采用鞣酸-柠檬酸钠还原法，胶体金颗粒直径为20 nm。具体方法为：取1%氯金酸5ml 溶于395 ml dH2O，加热至60 ℃，快速加入鞣酸-柠檬酸钠溶液100 ml（1%柠檬酸三钠20 ml，