实验二 细胞器的活体染色

实验二细胞器的活体染色
活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品没有毒害作用或毒害作用较小的一种活体染色方法。

这种方法能够显示活体组织或细胞内的某些结构，但在短时间内不影响细胞的生命活动并且不会对活体细胞或组织造成显著的物理、化学变化以致引起细胞的死亡。

活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。

体内活体染色是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。

体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。

碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。

但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。

一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。

詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。

一、实验目的
(一)掌握细胞器超活染色染料的选择及作用原理。

(二)学习细胞器的超活染色技术；并能对这一技术进行适当的改进和探索。

二、实验原理
线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。

詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色;而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。

中性红是一种弱碱性pH 指示剂，变色范围pH6.4～8.0之间（由红变黄）。

在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，因而对活细胞的液泡系的染色有专一性，细胞核与细胞质则不着色。

三、实验用品
(一)
(二)器材：
显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。

材料：
人口腔上皮细胞，洋葱鳞茎，小麦或黄豆幼根根尖。

(三)
1.试剂：
Ringer溶液：
氯化钠0.85 g (变温动物用0.65 g)
氯化钾0.25 g
氯化钾0.25 g
氯化钙0.03 g
蒸馏水100 mL
注：
Ringer溶液是生理学实验常用的生理盐溶液。

2.1%、中性红溶液：
称取0.5 g中性红溶于50 mL Ringer溶液，稍加热(30~40℃)使之很快溶解，用滤纸过滤，即为1%原液，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。

临用前，取已配制的1%中性红溶液1 mL，加入29 mL Ringer溶液混匀，即为的中性红溶液，装入棕色瓶备用。

3.1%、xx绿B溶液：
称取50 mg詹纳斯绿B溶于5 mL Ringer溶液中，稍加微热(30~40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。

取1%原液l mL加入49 mL Ringer溶液，即成工作液装入瓶中备用。

最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。

四、实验方法
(一)人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察
1.取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴詹纳斯绿B染液。

2.实验者用牙签宽头在自己口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10～15 min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，
3.盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，显微镜下观察。

4.在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察，绘图显示观察结果。

(二)植物根细胞液泡系的超活染色与观察
1.实验前现将黄豆种子在培养皿内发芽，待胚根长到1 cm以上后使用。

2.用刀片切取0.5 cm左右根尖，用刀片纵切根尖，置于载玻片上。

3.加一滴中性红染液，染色3～5 min，吸去染液，加一滴Ringer液，再加上盖玻片。

4.用吸水纸包住载玻片和盖玻片，拇指轻轻压片，使根尖压扁，利于观察。

然后吸去多余的染液，切不可使载玻片和盖玻片相对移动。

5.压好的片子先在低倍镜下寻找根尖细胞，再换到高倍镜下仔细观察，绘图显示液泡在根尖区的分布
(三)植物表皮细胞液泡系的超活染色与观察
1.撕取洋葱鳞茎内表皮或小麦叶片上表皮小块若干，投入的中性红溶液中染色5～10 min，取出1～2片，在pH低于7.0的蒸馏水中稍加冲洗，在
2.
3.
4.
5.载玻片上滴一滴蒸馏水，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观察，描述观察到的染色部位。

将步骤1中的活体染色制片取出几片放入pH略高于7.0的自来水中浸泡10～15 min，再置于载玻片上镜检，描述观察到的染色部位。

为了确证中性红染色部位，可将上述洋葱内表皮染片浸入1 mol/L的硝酸钾溶液中浸泡10 min左右，然后取出观察。

由于硝酸钾能使原生质强烈膨胀，发生“帽状质壁分离”，因而能清楚地区别开无色透明的原生质和染成红色的液泡。

将步骤2中的活体制片放在酒精灯火焰上微微加热，以杀死细胞，再在显微镜下观察，描述染色结果。

请利用实验一中学到的知识，描述一下中性红染色后死活细胞的区别。