免疫学实验

实验四免疫学实验

一、机体体液免疫功能测定

（一）凝集反应

【目的】

了解玻片凝集试验、试管凝集试验及胶乳间接凝集抑制试验的操作过程、结果分析和实际应用。

【原理】

颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应抗体在一定电解质存在的条件下发生特异性结合并出现肉眼可见的凝集块的现象称为凝集反应。凝集反应既可用已知抗体检查和鉴定未知的抗原(如鉴定细菌)，也可用已知抗原检查血清中相应的抗体；既可用作定性检测，又可用于定量检测。

凝集反应分两种。一种是颗粒性抗原与抗体直接结合出现的凝集现象，称为直接凝集反应；另一种是将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的载休颗粒表面，再与相应的抗体结合而出现的凝集反应，称为间接凝集反应。如将抗体吸附于载体颗粒表面，再与相应的抗原结合而出现的凝集反应则称为反向间接凝集反应。

1、玻片凝集反应

【材料】

伤寒诊断血清、伤寒沙门菌及大肠埃希菌培养物、载玻片、生理盐水等。

【方法】

①取载玻片1张，左侧加生理盐水1滴，中间及右侧各加伤寒诊断血清1滴；

②用接种环取伤寒沙门菌培养物少许，分别与盐水及中间的伤寒诊断血清混匀。同法取大肠埃希菌培养物与右侧伤寒诊断血清混匀；

③轻轻摇动玻片1～2min后，观察结果；

④观察后，将玻片直接投入消毒缸，不要冲洗，以防污染。

【结果】

出现凝集物者为阳性反应，均匀混浊无凝集物者为阴性反应。

【注意事项】

玻片凝集反应

①用接种环取一种试剂前后均需进行烧灼，不可有杂菌污染以及前一试剂残留。

②用接种环取细菌时应先烧灼灭菌，待冷却后方可挑取细菌。

③用接种环加细菌于血清中后，应先烧灼接种环，再取细菌加入另一血清中。

【结果分析】

左：

中：

右：

应用：

2、试管凝集反应

试管凝集反应为半定量试验，常用已知抗原检测患者血清中相应抗体的效价。

【材料】

伤寒诊断血清(抗体)、伤寒菌液(抗原)、生理盐水(NS)、刻度吸管、试管等。

【方法及结果】见表

试管凝集反应的方法

试管 1 2 3 4 5 6

7

生理盐水(ml) 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 弃去0.5

0.5

伤寒诊断血清(ml) 0.1 0.5 0.5 0.5 0.50.5 ＋

NS 0.5

血清稀释倍数1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320

对照

菌液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

0.5

血清最终稀释倍数1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640

对照

56℃ 4小时,4℃冰箱过夜,次日观察结果

结果

效价

【结果判断】见表

手持试管，对光观察管内液体混浊度及管底沉淀物之性状。

试管凝集反应结果的判读

记录符号上层液体管底凝集物

++++ 完全澄清凝块多而明显，全部沉于管底

+++ 微混浊凝块显著，大部分沉于管底

++ 稍混浊凝块较明显，中等沉于管底

+ 混浊凝块不太明显，少许沉于管底

- 混浊细菌均沉积于管底，呈小园点状，不见凝块

凝集效价的判定：呈“++”阳性反应的最高稀释倍数为该血清的效价(也称滴

度)。对照管(第7管)应为阴性。

【注意事项】

观察结果时，先看生理盐水对照管，可见管底有圆点状细菌沉积，边缘整齐，轻摇则分散为混浊的菌液，似烟雾状。

【思考题】

试管凝集反应的临床应用：

（二）沉淀反应

可溶性抗原(如血清、细菌浸出液、毒素等)和相应抗体结合，在适量电解质存在的条件下，经一定时间，二者在比例适当时形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。参与反应的抗原称为沉淀原，而相应的抗体称为沉淀素。由于沉淀反应的抗原多系胶体溶液，沉淀物主要是由抗体蛋白所组成，为获得抗原与抗体的适宜比例，操作中通常稀释抗原而不稀释抗体，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。

本实验介绍琼脂扩散试验和对流免疫电泳。

【目的】

了解单扩、双扩及对流免疫电流的原理、操作步骤及临床应用。

1、单向琼脂扩散试验：

【原理】

琼脂属于大分子多糖，100℃时熔化，低于45℃时凝固而形成网状结构，并能允许抗原抗体的在其中自由扩散。琼脂扩散试验是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂内扩散，若二者对应且比例合适，则出现白色沉淀物。

单向琼脂扩散试验系定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。试验中将定量的抗体混合于琼脂内倾注于玻片上制成琼脂板，凝固后打孔。再将待检抗原加入孔中，因抗体与琼脂混合凝固后，不会再扩散，只有孔中抗原向四周扩散，抗原、抗体在比例适合处可形成白色沉淀环。由于只有抗原扩散故称之为单向扩散。沉淀环的直径大小与抗原浓度成正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环的直径作纵座标，以抗原浓度为横座标，绘制标准曲线。测量待检抗原的沉淀环直径，从标准曲线中求得其含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白或血清补体含量。目前也常采用血清全自动分析仪检测各种免疫球蛋白或血清补体含量。

【材料】

①人免疫球蛋白IgG的诊断血清(冻干羊抗人IgG即抗体)。

②人免疫球蛋白标准血清（抗原），待检人血清（抗原）。

③打孔器、加样器、37℃恒温箱、1.8％琼脂玻片等。

【方法】

①制板：按抗血清效价的一半，用56℃预热的生理盐水稀释抗血清，再加入等量的冷却至56℃的琼脂轻轻混匀，灌板(3ml/板)。

②打孔：以打孔器打孔，孔径3mm，孔距1cm，每板2排，每排5个孔，用针头把孔内琼脂块挑出。

③按说明书要求稀释标准血清与待检血清。待检血清1：50稀释，标准血清