细胞凋亡通路研究工具及全面解决方案

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Caspases 活性检测
基于抑制剂结合法的Caspase活性检测 用标记荧光素的caspase 抑制剂处理细胞 荧光标记的caspase 抑制剂不可逆的与凋亡细胞 中的活化caspase 相结合 方法： 方法：流式细胞仪、 流式细胞仪、荧光计或荧光显微镜 能够方便、 能够方便、灵敏地在活细胞中原位 灵敏地在活细胞中原位（ 原位（in situ）检 测活化的caspase
TRAIL与肿瘤治疗
TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand) 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体
TRAIL受体分为两类： 受体分为两类：一类是死亡受体（ 一类是死亡受体（如DR4和DR5），主要诱导肿瘤细胞或转 ），主要诱导肿瘤细胞或转 化细胞凋亡； 化细胞凋亡； 另一类是“诱骗”受体（ 受体（如DcR1和DcR2），保护正常细胞免遭 ），保护正常细胞免遭TRAIL 诱导凋亡； 诱导凋亡；
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Caspases 的研究与检测——抑制剂
50多种caspases抑制剂
1 根据caspase 根据caspase特定的四肽底物位点设计的 caspase特定的四肽底物位点设计的， 特定的四肽底物位点设计的，是caspase活性中心的抑制剂 caspase活性中心的抑制剂。 活性中心的抑制剂。 2 分为选择性的caspase 分为选择性的caspase 抑制剂和泛caspase 抑制剂和泛caspase 抑制剂。 抑制剂。 3 C末端连接的化学基团决定了 C末端连接的化学基团决定了caspase 末端连接的化学基团决定了caspase抑制剂可逆与否 caspase抑制剂可逆与否。 抑制剂可逆与否。(CHO、 (CHO、FMK、 FMK、CMK) 4 抑制剂的细胞通透性。 抑制剂的细胞通透性。
Bcl-2
Procaspase 8
tBid
dATP
Bid Caspase 8 Procaspase 3
Apaf -1 Procaspase 9 Cytochrome c
dATP
Cellular targets
Caspase 3
Apaf -1 Caspase 9 Apoptosome
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太多
•神经退行性疾病 神经退行性疾病： 神经退行性疾病：阿尔兹海默、 阿尔兹海默、 帕金森氏症、 帕金森氏症、亨廷顿氏症等 •动脉粥样硬化 动脉粥样硬化 •艾滋病 艾滋病
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凋亡与坏死的区别
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Caspases 活性检测
基于底物剪切的Caspase活性检 测试剂盒——免疫捕获法 测定板经caspases抗体包被 特异地捕获样品中 特异地捕获样品中caspases 避免底物被样品中其它酶类切割 荧光或比色检测
Anti-Enzyme
Capture Enzyme
Fluorescence or Color
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Caspases 活性检测
原理： 原理：在Caspase的底物多肽上标记荧光素或发色团 Caspase的底物多肽上标记荧光素或发色团， 的底物多肽上标记荧光素或发色团，当活化的 Caspase剪切标记的底物多肽后 Caspase剪切标记的底物多肽后， 剪切标记的底物多肽后，荧光素（ 荧光素（AFC或 AFC或AMC） AMC）或发色团 (pNA)被释放出来， 被释放出来，引起发光或显色反应， 引起发光或显色反应，其荧光强度或溶液颜 色深浅与caspase 色深浅与caspase活性成正比 caspase活性成正比。 活性成正比。
坏死
凋亡
2.诱导因素 3.生化特点 4.形态变化 5.炎症反应 6.DNA 7.凋亡小体 8.基因调控
强烈刺激， 强烈刺激，随机发生 被动过程， 被动过程，无新蛋白合成， 无新蛋白合成， 不耗能 细胞结构全面溶解、 细胞结构全面溶解、破坏、 破坏、 细胞肿胀 溶酶体破裂， 溶酶体破裂，局部炎症反应 DNA随机降解电泳呈弥散状 无 无
2吨！！！ 16千米！！！ 千米！！！
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凋亡的病理意义
细胞凋亡
太少
•恶性肿瘤 恶性肿瘤： 恶性肿瘤：乳腺癌， 乳腺癌，前列腺癌， 前列腺癌， 白血病 •自身免疫性疾病 自身免疫性疾病： 自身免疫性疾病：系统性红斑狼 疮，风湿性关节炎 •病毒感染 病毒感染 •I I型糖尿病
TNFR超家族： 超家族：
超过20个成员： 个成员：TNFR1, TNFR2, Fas, DR4(TRAIL R1), DR5(TRAIL R2), DcR1(TRAIL R3), DcR2(TRAIL R4), CD40, etc Ⅰ型跨膜蛋白 胞内区“死亡结构域”（Death Domain）
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凋亡的生理意义
1. 确保正常发育、 确保正常发育、生长 蝌蚪 VS 青蛙？ 青蛙？ 鸡爪 VS 鸭蹼？ 鸭蹼？
2. 维持内环境稳定 80岁的老人 80岁的老人： 岁的老人：骨髓多重? 骨髓多重? 小肠多长? 小肠多长? 3. 发挥积极的防御功能 细胞毒性T 细胞毒性T细胞的杀伤作用
——————————————————— Inhibitor • Prof. Signal Transduction
凋亡细胞与正常细胞/坏死细胞
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提 纲
一. 什么是凋亡&凋亡的意义 二. 凋亡的两条主要途径&如何研究凋亡 三. 凋亡作为研究工具&如何检测凋亡
细胞凋亡通路研究工具与全面检测方案
齐 婧 （Vicky Qi） March, 2011
提 纲
一. 什么是凋亡&凋亡的意义 二. 凋亡的两条主要途径&如何研究凋亡 三. 凋亡作为研究工具&如何检测凋亡
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什么是细胞凋亡？ 什么是细胞凋亡？
D D D
Mitochondrial Pathway (Intrinsic Pathway) oxidants ceramide others DNA damage
D D
D D
FADD
Bcl-2
Procaspase 8
tBid
dATP
Bid Caspase 8 Procaspase 3
Apaf -1 Procaspase 9 Cytochrome c
Caspases 活性检测
基于底物剪切的Caspase活性检测试 剂盒——直接法 荧光或比色检测 样品： 样品：细胞裂解物或纯化、 细胞裂解物或纯化、半纯化caspaseSample (Enzyme) 适用于96孔板检测
Add Substrate
Fluorescence or Color
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dATP
Cellular targets
Caspase 3
Apaf -1 Caspase 9 Apoptosome
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凋亡外源途径——TNF/TNFR家族
TNF超家族： 超家族：
超过16个成员： 个成员：TNFα,TNFβ, FasL, TRAIL, NGF, CD27L, CD40L, etc II 型跨膜蛋白 C末端的胞外区能形成可溶性的三聚体 具有膜结合型和可溶型两种形式
1.性质
病理性， 病理性，非特异性 生理性或病理性， 生理性或病理性，特异性 较弱刺激， 较弱刺激，非随机发生 主动过程， 主动过程，有新蛋白合成， 有新蛋白合成， 耗能 胞膜及细胞器相对完整 细胞皱缩， 细胞皱缩，核固缩 溶酶体相对完整， 溶酶体相对完整，无局部炎症反应 DNA片段化（ 片段化（180-200bp）降解 电泳呈“梯”状条带 有 有
应用： 应用：检测凋亡细胞的caspases 检测凋亡细胞的caspases活性及筛选 caspases活性及筛选caspases 活性及筛选caspases的激活剂或 caspases的激活剂或 抑制剂。 抑制剂。
方法： 方法：直接法、 直接法、免疫捕获法、 免疫捕获法、抑制剂结合法
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FITC-VAD-FMK
+ FITC-VAD-FMK
FITC-VAD-FMK
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Caspases切割底物的检测
PARP：Poly-ADP(ribose) Polymerase
TNF/TNFR家族的检测
Fas Ligand ELISA Kit
1. 96孔板夹心ELISA法，提供FasL标准品 2. 灵敏度0.02ng/mL 3. 膜结合FasL (mFasL) 4. 组织培养上清中的可溶性FasL (sFasL) 5. 人血清中的可溶性FasL (sFasL)
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TRAIL选择性杀伤肿瘤细胞的机制: TRAIL可诱导多种转化细胞和肿瘤细胞发生凋亡 ，但对大多数正常组织却没有毒性。 但对大多数正常组织却没有毒性。这种特性使TRAIL成为肿瘤治疗中一种很有前 途的药物。 途的药物。
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Caspases家族
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二. 凋亡作为研究对象
Inhibitor • Prof. Signal Transduction
凋亡的两条途径
Death Receptor Pathway (Extrinsic Pathway)
FasL Fas/Apo1 /CD95
Baidu Nhomakorabea细胞死亡
细胞坏死
凋亡
细胞程序性坏死
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凋亡是种自然现象
生如夏花之绚烂
死如秋叶之静美
凋亡的专业定义
细胞凋亡（ 细胞凋亡（Apoptosis）： 细胞在一定的生理及病理条件下， 细胞在一定的生理及病理条件下， 遵循自身的程序， 遵循自身的程序，自己结束其生命 的过程， 的过程，最后细胞裂解为若干凋亡 小体， 小体，被其他细胞吞噬。 被其他细胞吞噬。现在很多 情况下， 情况下，亦称为程序性细胞死亡 (Programmed Cell Death, PCD） • 自然性 • 有序性 • 有充分时间发生
Death Receptor Pathway (Extrinsic Pathway)
FasL Fas/Apo1 /CD95
D D D
Mitochondrial Pathway (Intrinsic Pathway) oxidants ceramide others DNA damage
D D
D D
FADD
Caspases结构与分类
Inhibitor • Prof. Signal Transduction
Caspases 底物序列
Caspase-1 Caspase-2 Caspase-3 Caspase-4 Caspase-5 Caspase-6 Caspase-7 Caspase-8 Caspase-9 Caspase-13 Tyr-Val-Ala-Asp Val-Asp-Val-Ala-Asp Asp-Glu-His-Asp Leu-Glu-Val-Asp Trp-Glu-His-Asp Val-Glu- Ile -Asp Val-Asp-Gln-Val-Asp Ile-Glu-Thr-Asp Leu-Glu-His-Asp Leu-Glu-Glu-Asp YVAD VDVAD DEVD LEVD WEHD VEID VDQVD LETD LEHD LEED