扫描电镜细菌制样方法

细菌样品前处理

取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。

（1)收集菌体:①液体培养基中的菌体，可取培养液8000rpm离心3～5min，弃上清,倒入2。5％戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体，可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落（注意不要刮下培养基)。将菌液吸入小离心管，离心后换入新鲜戊二醛固定。

(2）固定，脱水按常规方法。2.5%戊二醛,2～4h→磷酸缓冲液清洗3次→1%锇酸4～6h →缓冲液清洗3次→乙醇梯度脱水，30％,50％,70%,85％，95％各一次,100％乙醇2次,15～20min/次→乙酸异戊酯置换2次,20min/次（注意：每步均需离心,8000rpm，3～5min，弃上清，倒入下一种试剂，滴管来回吸几下,打散菌块）。

（3）临界点干燥：普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条,将长边35mm平均分成3份，对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状.将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。放入临界点干燥器样品室,进行CO2临界点干燥。一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意，需用液态CO2置换2～3次）。

(4）离子溅射金：沿两端书钉剪开滤纸包，将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿，轻摇尽量分散菌体。碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上，另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。离子溅射金后,即可进行扫描电镜观察。

细菌样品特殊制备方法；

1，固体培养基中的菌体

用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌.然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内加入适量1％锇酸，盖上含有样品的瓶盖,熏蒸固定2h以上。然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金,进行扫描电镜观察。

2，液体培养基中的菌体

取一定的培养液，8000rpm离心3~5min,弃上清液，加入2.5％戊二醛固定2h,pH 7。2磷酸盐缓冲液清洗，然后加入蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2min，用滤纸吸去多余溶液。然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁,在棕色瓶内加入适量1%锇酸,盖上含有样品的瓶盖,熏蒸固定2h以上。然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金，进行扫描电镜观察。

0.2M 磷酸缓冲液的配制：

磷酸二氢钠（NaH2PO4。2H2O) 2.94克

磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O） 29克

纯水 500mL

pH调至7。4

2.5%戊二醛固定液的配制：

25％戊二醛10mL

双蒸馏水40mL

0.2mol/L磷酸缓冲液50mL

戊二醛最终浓度2。5％

pH值7。3—7.4