稳定细胞转染流程(刘文)
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
细胞转染的详细过程
细胞转染的详细过程1、准备工作如下：1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。
细胞培养在适合的培养基中。
细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。
用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。
2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。
3)细胞在27℃孵育至少一小时。
4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合：用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。
用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。
将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。
5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。
6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。
7)细胞在27℃孵育5小时。
8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。
9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。
2、第一代代病毒的收集与保存1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。
2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。
3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。
稳定转染细胞株（系）详细构建流程
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
如何构建稳定转染的细胞系（株）？
如何构建稳定转染的细胞系（株）？稳定细胞株构建包含哪些关键步骤？A：如下♀一般稳定细胞株的构建包含以下几个部分：表达之类构建细胞转染pool细胞筛选单克隆筛选细胞库建立表达质粒构建A：如下♀将带有内切酶位点的抗体轻重链碱基序列通过聚合酶链反应(PCR) 方法合成，然后与载体连接构建表达质粒，抗体的轻重链可放在不同载体上。
为保证克隆到载体中的靶基因的准确性，在转染宿主细胞前需对表达质粒中的靶基因进行测序。
细胞转染A：如下♀将表达质粒通过四种不同的方法（化学法、物理法、脂质体转染、病毒转染）导入哺乳动物细胞内，最为常用的是电穿孔转染法、脂质体转染法和聚乙烯亚胺介导的转染方法。
转染的成功率取决于细胞的活性、质粒DNA 的纯度、转染试剂及转染方法。
Pool细胞筛选A：如下♀细胞池筛选与评估：转染后的细胞需要在选择性培养基中培养至活率完全恢复，用以产生稳定的细胞池。
选择试剂的使用取决于表达载体携带的选择基因及宿主细胞的类型。
过于CHO K1细胞，通常不含谷氨酰胺的培养基中添加MSX进行筛选；而DG44和DXB11细胞通过不含呈甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶，并对细胞池增加MTX的选择压力来提高抗体表达水平。
在细胞池筛选阶段，需要对细胞池表达抗体的产量和关键质量进行评估，根据评估结果选择3-4个细胞池进行克隆。
单克隆筛选A：如下♀单克隆筛选与评估：传统的单克隆筛选方法多采用有限稀释法，形成率呈泊松分布。
为保证单克隆的单一性，需要一轮以上的克隆筛选，通常低于1个细胞/孔的方法进行铺板，挑选300个克隆经过24孔板、6孔板、T方瓶的摇瓶逐级扩增，最后挑选出10-20个克隆进行摇瓶规模评估，根据细胞生长和产物质量特性，挑选出4-6克隆进一步在反应器中评估，并建立RCB。
三级细胞库的建立A：如下♀细胞库的建立为满足大规模抗体生产的需要。
根据生物反应器评估结果及细胞株稳定性研究数据，选择生产用工程细胞株及备选细胞株，并建立原始细胞库PCB，然后GMP条件下建立主细胞库和工作细胞库。
构建细胞稳转株
构建细胞稳转株（一）慢病毒包装：1．转染前24小时，将293T细胞以4-5×106接种于10cm的大皿中，加入10ml DMEM 完全培养基，轻轻摇晃，混匀，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
注：细胞转染前密度应达到80%-90%。
3．充分混匀，离心管1，离心管2室温孵育5分钟。
4．将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。
注意加入顺序非常重要。
5．室温孵育转染混合液15分钟6．将步骤1准备的细胞换液（95%DMEM+5%灭活FBS）。
7．将1ml转染混合液逐滴加入换液好的细胞培养皿中，前后晃动培养皿，充分混匀。
8．37℃培养。
4-6小时后，用10ml培养基换液（90%DMEM+5%灭活FBS+5%双抗）。
9．转染48小时收集细胞培养上清。
500g离心10min去除细胞碎片。
该上清可以直接用于慢病毒感染，也可进行病毒滴度测定或病毒浓缩。
如需长时间保存，可-80℃冻存。
注意每次冻融将导致病毒滴度下降2-4倍。
（二）慢病毒感染待测细胞：1.取新包装的或冻存于-80℃冰箱的慢病毒于冰上缓慢解冻。
2.慢病毒与培养基（DMEM+5%灭活FBS+1%双抗）按一定的体积混匀，加转染增强剂polybrene至终浓度为10μg/ml。
3.待转染的细胞吸去原培养液，PBS洗3次。
4.把混合好的慢病毒培养基加到细胞培养瓶中进行感染。
5.将细胞培养瓶放回培养箱中培养过夜，PBS洗3次，更换为完全培养基继续培养。
6.感染72h后，荧光显微镜观察荧光，拍照，分析细胞生长状态。
（三）稳转细胞株筛选：将慢病毒感染成功的细胞继续培养，并在培养基中加入嘌呤霉素进行筛选。
筛选持续一周，在荧光显微镜下观察，至感染效率达到80%嘌呤霉素最佳筛选浓度测定：将对数生长期的细胞消化，均匀铺在24孔板上，5×104/孔。
隔夜将细胞换液，并设置嘌呤霉素梯度：0 ug/ml；0.5 ug/ml；1.0 ug/ml；1.5 ug/ml；2.0 ug/ml；2.5 ug/ml48 h后换正常培养基。
稳定转染步骤
稳定转染细胞株的制备带质粒的大肠杆菌的激活和扩增（1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约2min,待冰完全融解即可使用。
（2）LB培养基的制备按照如下配方配制胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L酵母提取物(Yeast extract) 5g/L氯化钠(NaCl) 10g/L用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为0.1mg/ml)（3）LB固体培养基的制备到200mlLB液体培养基加入3g琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入6-7个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。
（4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到LB固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。
观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到10mlLB液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待LB液体培养基变浑浊后，4℃冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。
质粒的提取准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液（1）取75ml扩增变浑浊的LB液体培养基置于试管中。
（2）5,000×g离心10分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。
（3）取出质粒提取盒，用3ml细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。
（4）加入3ml细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育3分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入5ml中和液混匀（5）将Clearing Column(兰色)放入一新的50ml离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育2分钟，1500×g离心5分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。
（6）将Binding Column(白色)放入一新的50ml离心管，取上述离心液倒入白管，1500×g离心3分钟，弃去离心液。
细胞DNA转染实验步骤（entranster）
细胞DNA转染实验步骤（entranster）
下面以Entranster-H4000，DNA转染试剂为例，简要说明DNA 细胞转染实验步骤
1.提前一天细胞铺板
提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞密度在60％左右为宜。
2.转染过程
⑴将0.8μg的DNA用25μl无血清稀释液稀释，充分混匀，制成DNA稀释液。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
⑵将2μl的EntransterTM-H4000用25μl无血清稀释液体稀释，充分混匀，制成EntransterTM-H4000稀释液。
室温静置5分钟。
⑶将EntransterTM-H4000稀释液分别加入到DNA稀释液中，充分混匀（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上），室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
⑷将转染复合物加入到含细胞和完全培养基的培养容器上，轻柔混匀。
注意：①对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
②完全培养基可加抗生素。
⑸培养4-6小时后更换培养基，继续培养24-48小时。
注意：①如细胞没有毒性等不良情况，转染后4-6小时可不必更换培养基。
重要提示
1.本品在转染过程中可以添加抗生素，抗生素的添加与否不影响转染效率和毒性。
2.如转染后需要用Trizol提取RNA，建议转染后6小时换液。
干细胞稳定转染的步骤
干细胞稳定转染的步骤1.选择合适的载体：选择适合干细胞转染的载体，常用的有携带选择标记基因的质粒载体或病毒载体，可以根据实验需要选择不同的载体。
2.DNA的准备工作：将所需的外源基因片段克隆到载体中，并根据需要设计适当的启动子和终止子。
确保DNA质粒提取纯度高，并使用合适的工具加以验证。
3. 细胞准备：选择合适的干细胞，常用的有胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)、诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)等。
干细胞需要在培养基中进行适当的扩增和传代。
4.干细胞培养：将干细胞在无细胞培养基中培养，以保持其干性。
培养基中添加相应的生长因子和细胞因子来促进细胞生长和增殖。
5.转染干细胞：将准备好的质粒载体与干细胞一起转染进入干细胞中，常用的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒介导转染法。
根据研究需要选择合适的转染方法。
6.选择转染细胞：转染后，使用选择性抗生素或选择性标记物来选择转染成功的细胞，例如使用抗生素筛选，只有带有外源基因的干细胞才能在含有抗性抗生素的培养基中存活。
7.干细胞稳定化：将选中的转染细胞继续在无细胞培养基中培养，并经历几个传代。
在这个过程中，通过监测外源基因的表达情况来确定是否稳定表达。
8. 验证外源基因的稳定表达：使用适当的表达分析方法（如PCR、Western blot和荧光显微镜等），检测外源基因的稳定表达情况。
确保外源基因能够在转染的干细胞中稳定地表达。
9.功能验证：在转染干细胞中验证外源基因的功能。
根据实验需要，可以通过细胞增殖实验、细胞分化实验等来验证外源基因的功能。
10.数据分析和报告编写：整理和分析实验结果，并按照科学报告的形式撰写报告，描述实验过程和结果，包括外源基因的稳定表达情况和功能验证结果。
以上是干细胞稳定转染的一般步骤。
需要根据实际情况和实验要求调整和优化步骤，确保转染成功率和所需的目标基因的稳定表达。
细胞稳转细胞系构建
细胞稳转细胞系构建1. 引言细胞系是指从原始组织中获得的、可以无限增殖并保持某种特定功能的细胞群体。
细胞系的构建对于生物医学研究、药物开发等领域具有重要意义。
然而，由于细胞的特性和环境的变化，细胞系的构建并不容易稳定和持久。
本文将介绍一种细胞稳转细胞系构建的方法，旨在提供一种可靠的方法来构建稳定的细胞系。
2. 细胞稳转细胞系构建的原理细胞稳转细胞系构建的原理是通过引入稳定的转染系统，将目标基因稳定地表达在细胞中。
这样一来，细胞系就能够维持目标基因的表达，从而实现稳定的细胞系构建。
具体而言，细胞稳转细胞系构建的步骤如下：2.1 选择合适的转染系统选择合适的转染系统是细胞稳转细胞系构建的第一步。
常用的转染系统包括病毒载体、质粒转染和基因编辑技术等。
根据不同的实验需求和细胞类型，选择适合的转染系统。
2.2 构建稳定的转染载体构建稳定的转染载体是细胞稳转细胞系构建的关键步骤之一。
转染载体应包含目标基因的全长序列，并且能够在细胞中稳定表达。
同时，转染载体还应包含选择性标记基因，以便筛选出稳定转染的细胞。
2.3 转染细胞将构建好的转染载体导入目标细胞中，使其发生转染。
转染可以通过多种方法实现，如化学转染、电穿孔法和病毒介导转染等。
选择合适的转染方法，确保转染效率和细胞存活率。
2.4 筛选稳定转染细胞在转染后，使用选择性培养基或药物筛选出稳定转染的细胞。
选择性培养基或药物应选择适合目标基因的表达和细胞存活的浓度。
筛选出的稳定转染细胞即为构建的细胞系。
3. 实验步骤为了更好地理解细胞稳转细胞系构建的方法，以下是一种常用的实验步骤：3.1 选择合适的转染系统根据实验需求和细胞类型，选择合适的转染系统。
例如，如果需要稳定表达目标基因的细胞系，可以选择质粒转染系统。
3.2 构建稳定的转染载体根据目标基因的全长序列，设计合适的转染载体。
转染载体应包含目标基因的启动子、终止子和选择性标记基因等。
使用分子生物学技术构建稳定的转染载体。
稳定转染步骤范文
稳定转染步骤范文稳定转染是指将外源基因或RNA通过载体引入目标细胞，并使其在细胞中稳定存在和表达。
稳定转染在生物医学研究和基因治疗等领域扮演着重要的角色，因为它可以使目标细胞长期稳定地表达外源基因，以实现相关研究或治疗的目的。
下面是稳定转染的一般步骤：1.选择适当的载体：选择合适的载体是稳定转染的第一步。
常用的载体包括质粒、病毒和质体等。
质粒是最常用的载体之一，它具有较大的载体容量，便于实验操作，且没有传染性。
病毒能够高效转染目标细胞，但需要确保安全性，避免病毒复制和毒性对细胞的影响。
质体是构建稳定转染细胞株的另一种选择，其使用较为复杂，但稳定性较好。
2.插入目标基因：将目标基因插入到选定的载体中。
基因的插入可以通过限制性内切酶切割和连接等方法实现。
确保插入的基因与载体配对后形成完整的DNA分子。
3.构建稳定转染细胞株：将含有插入目标基因的载体转染入目标细胞中。
转染方法包括化学法、电穿孔法、微粒轰击法和病毒感染法等。
其中，化学法最为常用，其通过化学品改变细胞膜的通透性来促进外源基因的转染。
4.选择处理：添加适当的选择抗生素或标记物来选择转染成功的细胞。
常用的选择剂包括抗生素G418和新霉素等。
由于稳定转染的成功率较低，这一步骤的目的是选择和培养含有插入基因的稳定转染细胞克隆。
5.扩增和筛选稳定转染细胞：将转染成功的细胞株进行扩增培养，并通过PCR、荧光显微镜观察和免疫标记等方法筛选出稳定转染的细胞株。
6. 确认并分析稳定转染细胞株：鉴定细胞株中目标基因的表达情况。
可以通过Western blot、RT-qPCR等方法来检测外源基因的表达水平，并通过细胞功能实验来研究基因在细胞中的功能。
7.建立稳定转染细胞株库：将稳定转染的细胞株进行存储和保存，以备将来使用。
总结：稳定转染是通过引入外源基因或RNA，使其在目标细胞中长期稳定地表达。
稳定转染的步骤包括选择适当的载体、插入目标基因、转染目标细胞、选择处理、扩增和筛选稳定转染细胞、确认并分析稳定转染细胞株以及建立稳定转染细胞株库等。
实验室祖传的转染攻略请收好
实验室祖传的转染攻略请收好不论是刚进实验室的新人，还是熟门熟路的老鸟，相信只要做过转染，或多或少都遇到过一些糟心事儿，要么细胞不生长，要么压根儿没转入。
那些次次转染都成功的，怕不是天选之子，就是幸运星本尊。
当然，大部分人靠运气吃饭是会饿死的，只有提高实验水平才是真· 出路。
下面我们就来详细的了解一下转染，以及它「毁」人不倦的那些坑。
什么是转染？转染是指将外源 DNA 或 RNA 片段导入到真核细胞而获得新的遗传标志的过程。
一般转染技术包括两大类：瞬时转染和稳定转染。
就瞬时转染而言，转染的DNA/RNA 没有整合到宿主基因组中，所以外源DNA/RNA 将会在后续的细胞有丝分裂过程中丢失。
外源基因的表达是短暂的，通常只持续几天，但表达效率高，导入的高拷贝DNA/RNA 会产生高水平的蛋白表达。
对于稳定转染，通常我们又称为永久转染，外源 DNA 能整合到宿主基因组，因此转染的宿主细胞及其子代细胞的基因组中会同时保留外源 DNA 片段。
外源基因整合到染色体中的概率很小，单拷贝或低拷贝稳定整合的 DNA 会导致低水平的蛋白表达。
稳定转染的转染效率只有瞬时转染的 1~10％，且适用于使用带有诱导型启动子的载体研究。
常见的转染方法常见的转染手段有物理方法、化学试剂和生物介导三大类。
如电转染、显微注射、磷酸钙共沉淀、病毒转染等。
不同的转染方法各有千秋（见表1），使用哪种方法需要综合考虑很多因素，如细胞类型（原代细胞 / 细胞系），细胞来源（体内 / 体外 / 离体），外源基因负载量，转染效率，安全性，成本，时间等。
表 1. 常用转染方法及其特点概述（部分）转染的影响因素转染过程中许多因素会影响转染效率：如细胞种类、细胞密度；质粒大小、质粒纯度；血清；抗生素；转染试剂等。
转染实验中，以下几个因素需多加注意。
1. 转染前的细胞状态和密度转染时细胞密度以70~90%（贴壁细胞）或2×106~4×106细胞/ mL（悬浮细胞）为宜，细胞密度过高会严重影响细胞状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）。
转染步骤及经验
转染步骤及经验
1.根据要进行体细胞转染的实验的特殊要求，选择适当的载体质粒，以及目标细胞。
2.制备转染的DNA样本：根据质粒的大小和实验的要求，严格控制样本的DNA浓度，并确保其质量良好，无杂质；
3.准备转染液：将转染的DNA样本和必要的添加剂放入适量的
PBS/DMEM中混合，形成转染液；
4.细胞放入转染液中：把细胞放入适量转染液中，使细胞与转染液充分混合；
5.细胞转染：细胞转染的方法有优化的转染技术（如脉冲转染）和非优化转染技术（如胞浆转染），根据实验对转染效果的要求，选择合适的转染技术；
6.细胞休眠：细胞休眠后，为后续实验提供了理想的条件，简化接下来的操作。
7.细胞筛选：有些载体质粒将特定的标记物（如GFP）植入细胞内，接着，使用不同颜色的染料或者发光技术，筛选出转染后的细胞，这将有助于后续的实验。
8.检测转染效率：使用细胞膜染色，PCR，蛋白表达分析来检测转染效率，以证实转染是否成功。
9.细胞接种：转染细胞分离后，接种到HMVEC或其他细胞上，以复制体系，以便进一步的研究。
细胞转染是一个复杂的过程，需要仔细地操作。
细胞转染操作步骤
RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
细胞稳定转染方法
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
转染步骤及经验
转染步骤及经验转染是在生物实验中将外源基因导入到细胞中的常用操作步骤之一。
本文将介绍转染的步骤及经验，并提供一些实用的技巧，旨在帮助读者顺利完成转染实验。
一、实验准备在进行转染实验前，必须做好充分的实验准备工作。
以下是一些关键准备步骤：1.1 细胞培养与处理- 培养适量的目标细胞，并确保其良好的生长状态。
- 处理细胞，使其处于适宜转染的状态。
例如，对于贴壁细胞，可以使用酶消化将细胞分散为单个细胞。
1.2 载体准备- 准备带有目标基因的载体。
这可以是质粒、病毒等。
- 使用合适的方法制备高质量的载体DNA或RNA。
1.3 转染试剂- 准备合适的转染试剂，如转染剂、离子可溶液等。
不同类型的细胞需要使用不同的试剂。
二、转染步骤转染步骤的具体操作根据不同的实验目的和细胞类型可能会有所不同。
以下是一般的转染步骤：2.1 细胞处理- 将要转染的细胞洗涤并收集到离心管中。
- 注意不要创建过高的转染细胞密度，以免影响转染效率。
2.2 与载体混合- 将载体与转染试剂混合，形成载体-试剂复合物。
根据实验需要可做不同浓度的复合物。
- 注意操作过程中避免产生气泡，以防止对细胞的损伤。
2.3 加入转染复合物- 缓慢地将转染复合物滴加到细胞中，确保复合物均匀分布在细胞表面。
- 转染时间和温度应根据细胞类型和所用试剂进行优化。
2.4 培养细胞- 按照细胞所需的培养条件将细胞孵育在恰当的培养基中。
- 在培养期间，根据实验设计进行后续处理，如观察表型、提取蛋白等。
三、经验分享3.1 优化试剂浓度- 不同的细胞系对试剂的敏感度不同，需要根据实验经验进行优化。
试验应根据需要尝试不同浓度的试剂。
3.2 选择合适的转染方法- 根据研究目的和所用试剂的特性，选择合适的转染方法。
常见的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒载体法等。
3.3 控制转染时间和温度- 不同细胞对转染复合物的吸收速度有差异，应该根据细胞类型和试剂特性确定合适的转染时间和温度。
稳转细胞系
稳转细胞系介绍稳转细胞系（stable cell line）是在细胞培养中建立的细胞系，经过基因转染或突变处理后表达特定蛋白或具有特定功能。
稳转细胞系的建立对于研究细胞功能和相关疾病的分子机制非常重要，因为稳定表达的细胞系相比于野生型细胞具有更高的表达水平和稳定的遗传特性。
构建稳转细胞系的方法转染转染是构建稳转细胞系的常用方法之一，主要通过将外源基因导入目标细胞中，使其表达目标蛋白。
常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒转染法。
•化学法：通过使用化学物质（如聚乙烯醇）或离子性脂质体来改变细胞膜的通透性，使外源基因进入细胞内。
•电穿孔法：利用高电压脉冲作用于细胞，破坏细胞膜的完整性，从而实现外源基因的导入。
•病毒转染法：利用复制缺陷病毒载体，将外源基因嵌入病毒基因组中，并通过感染细胞来实现基因传递。
选择性筛选转染后，为了得到稳转细胞系，需要进行选择性筛选。
常用的筛选方法包括对细胞进行抗生素或毒素的暴露。
•抗生素选择：将外源基因与抗生素抗性基因相连，转染到细胞中后，只有表达该外源基因的细胞才能存活下来。
•毒素选择：通过将外源基因与毒素敏感基因相连，转染到细胞中后，只有表达该外源基因的细胞能够抵抗毒素的作用。
单细胞分离和扩增经过选择性筛选后，得到稳转细胞系的一个重要步骤是进行单细胞分离和扩增。
这可以通过限稀稀释或使用流式细胞术等方法来实现。
通过单细胞分离，确保每个细胞都是来自同一个克隆细胞，并且能够扩增细胞数量以建立稳定的细胞系。
验证稳定性和功能建立稳转细胞系后，需要对其进行稳定性和功能的验证。
稳定性验证通常通过长期培养和细胞传代来观察外源基因的稳定表达水平；功能验证则通过相关实验和技术手段来验证细胞系是否成功表达目标蛋白或具备特定功能。
应用领域稳转细胞系广泛应用于多个研究领域，尤其是以下几个方面：蛋白表达和纯化稳转细胞系可用于大规模产生和纯化外源蛋白。
通过构建表达外源蛋白的稳转细胞系，可以实现大量高质量的蛋白产生，为蛋白质研究和生物药物生产提供方便。
稳定转染方法
稳定转染方法
1. 嘿，你知道稳定转染方法的脂质体转染吗？就像给细胞送一份特别的礼物！比如说，你要把一个特定的基因送给细胞，脂质体就像个小包裹，把基因好好地包起来送进去，这多神奇呀！它可是很常用的哦。
2. 还有病毒载体转染呢，这就像是派了个小特工进去细胞。
比如想用它把一个重要信息传递给细胞，病毒载体就能精准地进入并完成任务，是不是超厉害！
3. 电穿孔转染知道不？哎呀呀，这简直就是给细胞来一次小小的电击“刺激”！就像一道闪电，把基因瞬间带入细胞，很震撼吧！
4. 磷酸钙转染也不错呀，就像是在细胞外面搭建一座小桥，让基因能顺利过去，这种方式是不是很有意思呢？
5. 显微注射转染呢，这可是非常精细的活儿哟，好像是拿着一个超级小的注射器，小心翼翼地把基因注射到细胞里，需要很高的技巧呢！你能想象那个画面吗？
6. 基因枪转染呀，就如同发射子弹一样把基因“射”进细胞，很酷对吧！这种独特的方式总能引起人的好奇心呢！
7. 阳离子聚合物转染也值得一提呀，就好像给基因穿上了一件特殊的外衣，帮助它更好地进入细胞，真的很妙啊！
8. 磁珠转染呢，是不是感觉很新奇？就像是用有魔力的磁珠把基因吸附过去，然后带进细胞，太有意思啦！
我觉得这些稳定转染方法都各有特点和神奇之处，能帮助我们更好地实现基因的导入和研究呀！。
细胞转染的步骤
6)吸去培养板中的培养基，用 PBS 或者无血清培养基清洗一次。 7）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 8）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养 24－48 小 时。 第二次细胞传代 1） 在转染后 24 小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2） 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度 0.8X105 个细胞/35mm 培养皿将细胞重 新粉入培养皿中。 3） 在正常条件下培养 24 小时后按照染色要求条件固定。
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂比例，细 胞数量，培养及检测时间等。
相பைடு நூலகம்分类
化学转染法
包括：1.DEAE-葡聚糖法，2.磷酸钙法，3.人工脂质体法。DEAE-葡聚糖是最早应用哺乳动 物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞
相关实验
实验目的
学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一
般性方法，观 色准备实验材料。
实验原理
测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击 法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体 物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了 外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控
基本信息
•
中文名称 •
转染 • •
外文名称 •
• • 过程 •
•
transfection 真核细胞由于外源 DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程。
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H
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DMEM配制：
NaHCO3 3.7g
HEPES 4.766g
DMEM粉1包
水1000 ml
用HEPES调整PH值到7.3，加入双抗（青霉素，链霉素，每L培养液各10万单位），无菌过滤，4度保存。
0.25%胰酶的配制：
1、称胰酶粉末0.25 g , 加100 µl高压灭菌的1×PBS 。
2、使用小过滤器无菌过滤灭菌，4度保存。
0.02% EDTA的配制：
1、称EDTA粉末0.02 g , 加100 µl高压灭菌的1×PBS 。
2、使用小过滤器无菌过滤灭菌，4度保存。
复苏细胞
1、准备好操纵台，吸管，5 ml玻璃离心管，40度干净温水，（用烧杯装干净蒸馏水于水中温热）。
2、于液氮冻存罐中取出细胞，立即置于温水中，并不停地摇动，让其速融。
3、5 ml玻璃离心管中加入4ml的完全培养液，再加入溶解的细胞液。
4、1000rpm，5min 。
弃上清，加入2 ml培养液，吹散细胞。
5、分装于两瓶中，然后每瓶补充培养液至5 ml。
培养箱中培养；每日观察细胞生长情况。
传代（附壁细胞）
1、超净台消毒，试管消毒，注意切忌污染。
2、胎牛血清（FBS），培养液（DMEM：对附壁细胞）胎牛血清10 ml加入DMEM/1640（1：10）。
3、消化：
A、细胞培养瓶加入0.02% EDTA 约1 ml，可以轻轻晃动让EDTA没过所有的细胞，作用20S后吸出。
B、加入0.25%胰酶约1 ml，轻轻晃动让胰酶没过所有的细胞。
作用约3 min（时间的长短依情况而定，使细胞变成单个即可）。
C、吸去胰酶，加入4ml完全培养液，吹打细胞培养瓶壁，让细胞脱落，并吹打成单个细胞悬液。
4、分成两瓶，每瓶补充培养液至5 ml。
5、CO2孵箱，37度培养。
细胞冻存：
1、把细胞消化成细胞悬液，计数，离心（5 ml玻璃离心管），1000rpm，5min 。
2、配好冻存液。
3、冻存液成份（每1 ml）：
DMSO（二甲亚枫）100 µl
培养液600 µl
血清（FBS）300 µl
4、弃上清，依细胞数加入冻存液（冻存液细胞浓度要达到2~4×106/ml个），一般每个冻存管1~1.5ml。
5、吹散，分装到预冷的冻存管中。
6、细胞冻存管上标上名称，日期。
置于冻存盒内，-80度过夜，转存于液氮保存。
传代至一定数目且生长旺盛的细胞即可分到6孔板进行稳定转染（稳定转染）。
1、消化（此时用的培养液成分为：DMEM + FBS ）
2、计数
3、把细胞分到6孔板中，每孔细胞数要达到至少3×105，并补充培养液至2 ml/孔。
37度，CO2孵箱，培养。
24 h内做转染。
转染（稳定转染）
1、转染液成分配制（每孔）：
Opti—MEM 100 µl
Fugene 5 µl
质粒1.1 1 µg
Psv2-neo质粒0.07 µg
配好后轻轻混匀（Psv2-neo质粒是用于共转染的，有G418抗性），Fugene的体积量与质
粒的微克数有一定的比例。
2、直接把配好的转染液加入培养板，加的时候应该一滴滴加入，并均匀加到各各位置，空白对照空什么都不加，无需换培养液；
3、培养到第三天培养液换成成分为：DMEM + FBS + 双抗+G418 的培养液。
4、G418 使用浓度（终浓度）为：600 µg/ml 。
维持
1、以后每隔三天换一次液，换新培养液时先用PBS洗一次细胞。
小心污染。
2、一般24天后有细胞群落出现（hepG2 ）。
3、当细胞克隆群落长好以后（细胞有重叠）就可以对其进行分离。
克隆群落分离：
1、在显微镜下找出要分离的克隆群落，用标记笔在板下画个圈做标记。
2、吸去培养液，用小枪（20µl）吸10 µl 胰酶滴加到做好标记的克隆群落上，作用5 秒钟。
3、用小枪（20µl）吸10 µl 培养液在克隆群落上面轻轻吹出再吸上来，但不要全部吹出完10 µl ，重复4~5次轻轻吹出吸上即可把克隆群落吸上来。
分离的过程要快，否则其他克隆群落会因为干燥而死亡。
使用胰酶和培养液可以分500µl 到EP管中，这样可以预防污染，方便使用省时。
4、把吸到的克隆群落加到预先加有200 µl培养液的48 孔板上吹散培养，此时培养液G418浓度为400µg/ml ，有利于细胞的生长。
（我的长出的克隆很多，所以每种克隆分离了12个克隆群落。
）
5、当48 孔板长满长密后，再传到24孔板，此时培养液G418浓度改为600µg/ml 。
6、24孔板长满长密后，取培养上清做ELISA 。
7、取ELISA结果好的（值较高的）孔传到6孔板（不传到12空板，12空板空间太小，很快就长满，传到6孔板比较合适），一般取一半孔数。
8、当6孔板长满长密后，再传培养瓶。
9、在培养瓶里传代培养，到达一定的量后就可以冻存细胞，预防不利情况发生时使用。
10、每次冻存细胞后留下少量进行培养。
11、在液氮罐里冻存细胞一定要做好哪个号放在哪个位置，便于寻找。
鉴定：
ELISA
荧光PCR
HBsAg和HBeAg的检测
采用ELISA方法检测HBsAg和HBeAg的表达。
荧光定量PCR检测HBV DNA
用蛋白酶K法提取病毒核酸。
反应体系：
水10µl
Mix 12.5µl
引物1 0.5µl
引物2 0.5µl
Taq 0.5µl
模板1µl
25µl
反应程序：
94 3 min
94 15 S
60 15 S 30 循环
72 15 S
每个循环采集荧光。