第四章-外植体的选择、消毒和接种
植物组织培养技术第四章：植物离体培养体系2
修剪外植体
接种
盖好瓶塞
外植体的灭菌处理
• 外植体灭菌流程 • 常用灭菌剂 • 灭菌关键性问题
– 适当的搭配 – 适当的浓度 – 适当的时间
外植体灭菌流程
材料的预处理 (剪切、清洗)
75%酒精 (20 s)
0.1%升汞 (15 min)
无菌水冲洗 （6次）
沥干
接种
外植体的预处理
对外植体进行修整,去掉不要的部分,在 流水下冲洗干净.
化的方法与技能。
一、外植体的种类与选择
1、外植体的种类
– 外植体是指植物离体培养中的各种接种材料。 包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质 体等。因此，可以作为培养对象的所有植物器 官、组织、细胞、原生质体等均是可选择的对 象。
常见外植体类型
• 茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高， 不易发生遗传变异，但取材有限）
消毒注意事项
1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒 剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。
2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以 除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。
3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其 切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质 的吸收。
第二节： 无菌外植体的选择与处理
本节主要内容
• 外植体的种类与选择 • 外植体的消毒 • 外植体的接种 • 外植体的初代培养与观察
–培养条件 –外植体的污染及其防治 –外植体的褐化及其防治 • 外植体的继代培养 –培养物的分化诱导培养：愈伤组织的诱导与分化；不
定芽的诱导与分化。 – 试管苗的增殖与生根诱导培养 – 试管苗的玻璃化与防治
4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或 先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组 织培养。
植物细胞培养技术一般流程
植物细胞培养技术一般流程植物细胞培养技术可有意思啦，就像养小宠物一样，不过咱养的是植物细胞。
这植物细胞培养呢，有一套自己的流程。
一、外植体的选择。
咱得先找个合适的外植体。
啥是外植体呢？就是从植物体上取下来用于培养的那部分，就像从树上摘个小树枝或者从花上揪个小花瓣啥的。
这外植体的选择可讲究了呢。
要挑那些健康的、生命力强的部分。
比如说吧，如果是培养苹果的细胞，那可能就选个苹果树上长得壮实的小嫩芽。
而且不同的植物细胞培养目的，外植体也不一样哦。
要是想让细胞分化出根来，可能就选靠近根部的组织；要是想让它长出叶子，那可能就选茎尖附近的组织啦。
这就跟咱们做菜选食材一样，得选对了才能做出好菜呢。
二、外植体的消毒。
选好外植体之后，可不能就直接往培养皿里放呀，得消毒呢。
这就好比咱们从外面带回来的小宠物，得先给它洗个澡，消消毒，不然有病菌就不好了。
消毒的时候得小心，不能把外植体给弄死了。
一般会用一些温和的消毒剂，像酒精啊，再加上一些其他的消毒剂配合着用。
消毒的时间也得把握好，时间短了，消毒不彻底，病菌还在；时间长了，外植体可能就被毒死了。
这就像给小宠物洗澡，洗太久了可能小宠物就着凉生病啦。
三、接种。
消毒完了就到接种这一步啦。
这就像是把小宠物放进它的小窝一样。
把外植体放到含有营养物质的培养基上。
这培养基可神奇了，就像是给植物细胞做的营养餐，里面有各种营养成分，像糖类呀，维生素呀，矿物质呀，都是细胞生长需要的东西。
接种的时候也得小心翼翼的，要在无菌的环境下进行。
就像给小宠物找个干净的小窝一样，要是有细菌混进去了，细胞可就长不好了。
四、初代培养。
接种完了，细胞就开始在培养基上生长啦，这就是初代培养。
细胞就像小婴儿一样，开始慢慢适应新环境，吸收培养基里的营养，慢慢长大。
在这个过程中，有时候细胞会开始分化，形成一些小的组织块，就像小婴儿开始学会做一些小动作一样。
不过有时候也会遇到问题呢，比如说细胞可能不生长，或者长得很慢，这时候就得找找原因了，是不是培养基的营养不够啊，还是环境温度不合适呀。
组培苗生产技术—外植体的选择、处理与接种(植物组织培养课件)
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
外植体的选择和灭菌ppt课件
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
吐温的使用：0.1%，表面活性剂，浸润作用 无菌水:在用灭菌剂之前和之后均需用无菌水冲 洗数遍.
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资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
第一部分
组织培养技术
第四章 外植体的选择和灭菌
外植体（explant）：从植物体上分离的用于离体培养的植 物体部分。
第一节 外植体的选择
一、外植体的部位：根、茎、叶、花、果等 二、其它：如季节、生理状态和发育年龄等 三、外植体的大小
三、培养条件
温度：25±2℃； 光照：包括光照、光质和光周期； 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 离子， pH应在5.2以下. 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 培养 室的湿度70-80%. 气体:氧;二氧化碳;乙烯等.
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资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
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资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
取材季节
一般取母株生长旺盛的季节的材料
外植体的大小
植物组织培养 组培苗生产技术外植体的选择处理与接种护理课件
ห้องสมุดไป่ตู้湿度
保持培养环境湿度适宜， 以防止培养基干燥和外植 体失水。
培养过程中的观察与记录
定期观察外植体的生长状 况，包括颜色、质地、生 长速度等，并记录观察结 果。
观察外植体是否有异常表 现，如病变、死亡或生长 异常等，及时采取相应措 施。
记录外植体的生长曲线， 以便了解其生长动态和规 律。
培养过程中的问题处理
污染问题
如发现外植体受到微生物污染， 应及时采取措施，如更换培养基、
增加消毒频率等。
褐化问题
外植体褐化是常见的现象，可以通 过添加抗氧化剂、调整培养基成分 等方法减轻褐化程度。
玻璃化现象
玻璃化是指培养中的植物组织出现 半透明状的现象，可以通过降低激 素浓度、增加培养基湿度等方法进 行改善。
外植体的繁殖与移栽
生根过程
无根苗在生根培养基上生长，经过细胞分裂和分 化形成根原基，进而发育成完整的根系。
移栽前的准备
在生根培养过程中，需要对外植体进行适当的炼 苗处理，以适应外界环境，提高移栽成活率。
移栽与驯化
移栽是将培养好的组培苗从培养 容器中取出，移植到自然环境中 的过程。
移栽后的管理：保持适宜的光照、 温度、湿度和水分条件，及时除 草、防治病虫害，促进组培苗健 康生长。
外植体的接种
无菌操作技 术
操作前准备
在操作前，需要对外植体进行彻底清洗，去除表面的污垢 和微生物。同时，操作人员需要对手部进行消毒，确保无 菌操作。
灭菌处理 外植体需要进行严格的灭菌处理，以消除附着在表面上的 微生物。常用的灭菌方法包括使用酒精、次氯酸钠或氯化 汞等消毒剂。
接种环境
接种环境需要保持无菌状态，通常在超净工作台或无菌室 内进行。同时，接种工具也需要进行消毒处理，避免交叉 污染。
第四章 外植体的选择和灭菌
作业题 1、简述植物各种组织的表面消毒方法。 简述植物各种组织的表面消毒方法。 2、如何防止外植体的细菌污染和真菌污 染？
真菌污染
1、现象 、 真菌污染就是培养基上长霉，一般接种后3~5天就可发现 真菌污染就是培养基上长霉，一般接种后 天就可发现 霉的颜色有黑、 黄等。 霉的颜色有黑、白、黄等。 2、原因 、 一般多以周围环境不清洁和空气污染造成。 一般多以周围环境不清洁和空气污染造成。如：接种室 的空气本身不洁净，灰尘较多； 的空气本身不洁净，灰尘较多；超净工作台的过滤装置失 培养用器皿的口径过大，操作不慎等原因引起。 效；培养用器皿的口径过大，操作不慎等原因引起。 3、 防治措施 、 在接种前要求无菌室内做到用空气循环过滤装置使空气过 滤灭菌或通过紫外线照射灭菌外，再利用超净工作台接种 滤灭菌或通过紫外线照射灭菌外， 应开机15min以达到空气的充分过滤灭菌。而且接种 以达到空气的充分过滤灭菌。 前，应开机 以达到空气的充分过滤灭菌 时严格操作，如在接种前去掉橡皮筋， 时严格操作，如在接种前去掉橡皮筋，打开棉塞时动作要 轻及去掉瓶塞后瓶子应拿成斜角， 轻及去掉瓶塞后瓶子应拿成斜角，最好瓶口放在酒精火焰 的前方等等。 的前方等等菌两大类。 污染的病原分为细菌和真菌两大类。培养基 的污染可能的来源有培养容器、培养基本身、 的污染可能的来源有培养容器、培养基本身、 外植体、接种室的环境、 外植体、接种室的环境、再接种和继代时用 以转接植物材料的器械、 以转接植物材料的器械、培养室的环境以及 操作者本人。 操作者本人。
花药的灭菌
70%酒精浸泡数秒钟 无菌水冲洗 酒精浸泡数秒钟+无菌水冲洗 酒精浸泡数秒钟 无菌水冲洗2~3次+ 次 漂白粉溶液中浸泡10min+无菌水冲洗 漂白粉溶液中浸泡 无菌水冲洗 2~3次 次
第四章 外植体的选择、消毒和接种
目的要求
掌握选择外植体的方法； 熟练掌握接种方法。
第一节 外植体的选择
外植体的来源是决定植物组织培养成败的一个 重要因素。根据植物细胞全能性的的理论，任何细 胞、组织和器官都可以作为外植体，但实际上，不 同品种、不同器官之间的分化能力有巨大区别。
第一，选择优良的种质；
(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和 咳嗽等；
(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
接种前外植体消毒顺序:
第三节 培养条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条 件，培养基组成、ＰＨ值、渗透压等各种化学环境条件 都会影响组培苗的生长和发育。
第四，取材季节合理；
对于大多数植物而言，应在其生长的季节开始采 样。在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能 对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
第五，考虑器官的生理状态和发育年龄；
一般认为，沿着植物的主轴，越 向上的部分所形成的器官的生长时间 越短，其生理年龄也相应越老，越接 近发育上的成熟，越易形成花器官。 反之，越向基部，其生理年龄越小。
一、温度
温度是组织培养过程中的重要因素。 组织培养在最适温 度下生长分化表现良好， 大多数组织培养都是在23～27℃之 间进行，很多研究者采用了25±２℃的恒温条件。低于15℃ 时培养，组织会表现生长停止，高于35℃时对生长不利。
不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20℃、月 季是25～27℃、番茄是28℃。 温度不仅影响组培苗的生长速 度， 也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽 的形成28℃为最好， 在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。
第四章灭菌接种与培养
第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱 内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、 无菌水、手表等。用70%酒精浸10-30s。处理完的材料在无 菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根
❖ 化学消毒剂能使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统， 或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细 胞破裂或溶解。
❖ 一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越 好。消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强， 但石炭酸和酒精例外。
❖ 常用熏蒸剂是甲醛。熏蒸时，房间关闭紧密，按 6～8ml/m3用量，将甲醛置于广口容器中，加５g高 锰酸钾促进挥发。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效 果不如甲醛。
(3) 体细胞胚状体的发生与发育：体细胞胚状体类似于合 子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子 叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细 胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面发生，也可从外 植体表面已分化的细胞产生，或从悬浮培养的细胞产生。
初代培养外植体的褐变：
❖ 外植体褐变是指在接种后，其表面开始变褐，有时甚 至会使整个培养基变褐的现象。
4、接种完毕后将培养瓶封口，贴上标签，注明姓名，接种时 间和材料名称。整理好超净工作台台面，搞好清洁卫生。
【实验结果与分析】 （50分）
❖ 接种后7天观察污染情况 ❖ 污染率(％)=(污染的材料数/接种材料总数)×100％ ❖ 对实验结果进行分析：（1）若无污染，请总结成功的经验；
（2）若有污染，请说明导致污染的可能原因。
4、操作规程过程禁止不必要的谈话和咳嗽。还要尽量减 少工作人员在接种室内的走动。
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒1、外植体的选择外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。
从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。
但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异，培养的难易程度不同。
为保证植物组织培养获得成功，选择合适的外植体是非常重要的。
（1）选择优良的种质及母株无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。
尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。
（2）选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。
若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。
花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。
百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。
叶子花的腋芽培养，如果在1月至翌年2月间采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3-8月间采集，萌发的数目多，萌发速度快。
（3）选取适宜的大小培养材料的大小根据植物种类、器官和目的来确定。
通常情况下，快速繁殖时叶片、花瓣等面积为5mm2，其他培养材料的大小为0.5~1.0cm。
如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
材料太大，不易彻底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。
（4）外植体来源要丰富为了建立一个高效而稳定的植物组织离体培养体系，往往需要反复实验，并要求实验结果具有可重复性。
因此，就需要外植体材料丰富并容易获得。
（5）外植体要易于消毒在选择外植体时，应尽量选择带杂菌少的器官或组织，降低初代培养时的污染率。
第四章——组培外植体的选择及无菌操作
三，组培污染原因和预防措施
1、污染原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生
杂菌，导致培养失败的现象。 病原菌：细菌及真菌两大类。
⑴细菌污染特点-菌斑呈黏液状，接种后1-2天发现。 污染途径： 外植体带菌
培养基及器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程
⑵真菌污染的特点-污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-10天发现。 污染途径： 周围环境不清洁 超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大
• 在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高，而且增殖 率也大。
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
3，器官的生理状态和发育年龄
作为外植体的器官，其生理状态和发育年龄直接影响形态发生。一般 情况下，幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力，生理年龄越老的 组织或器官，越接近发育上的成熟，其再生能力逐渐减弱甚至完全失去再 生能力。
括号内为该类型植物使用该种外植体做组织培养的频率
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
1，外植体的部位
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
1，外植体的部位
对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已基 本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重 要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎段可解 决培养材料不足的困难。
1.1 外植体的选择对组培成功的影响
4，外植体的来源
• 生长在自然环境下的植物 • 有目的地培育在温室控制条件下生长的植物 • 无菌环境下已经过离体培养的植物
自然环境中生长的植株，一般带有微生物，甚至与某些微 生物具有寄生关系，使植株具有内生菌。取自这些植物的外植 体，在培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养效果。
已离体培养植株
多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物 材料作为外植体来源，减少培养过程中的微生物感染概率。同时， 生长在控制条件下的植物可以保持培养料间的一致性，提高实验 的可重复性，也便于培养技术的规范。
外植体材料的预处理、消毒及接种
外植体材料的预处理、消毒及接种（一）对采来的植物材料进行适当的预处理。
除去不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植物材料清洁程度而定。
这在污染严重时特别有用。
（二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100ml水）等浸洗上述植物材料约5min，再用自来水冲净洗衣粉水。
这是进一步减少污染的处理。
同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。
（三）将接种用具、无菌水等从80℃烘箱中或直接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。
打开超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少30min后关掉紫外灯。
（四）操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。
坐到超净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作台上操作。
（五）具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、浓度一定并且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液的0.5%，或每100mL消毒液滴加10~15滴）Tween-80（土温-80）等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料至少0.5cm），开始计算灭菌时间。
也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30秒。
（六）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。
在灭菌时间结束前1min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。
接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。
一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止。
无菌水的清洗时间每次约3min；清洗5次。
（七）倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植物材料的切割及接种。
逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。
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无菌操作可按以下步骤进行：
(1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌； (2)在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭 工作台面；
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过 火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和 咳嗽等；
(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 若连外植体消毒顺序:
第三节 培养条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条 件，培养基组成、ＰＨ值、渗透压等各种化学环境条件 都会影响组培苗的生长和发育。
一般情况下，幼年组织比老年组 织具有较高的形态发生能力。随着组 织年龄的增加，器官的再生能力逐渐 减弱甚至完全失去再生能力。
第六，选择大小合适的外植体；
建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材 料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至 难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5~ 1.00cm之间。如 果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
第四，取材季节合理；
对于大多数植物而言，应在其生长的季节开始采 样。在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能 对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
第五，考虑器官的生理状态和发育年龄；
一般认为，沿着植物的主轴，越 向上的部分所形成的器官的生长时间 越短，其生理年龄也相应越老，越接 近发育上的成熟，越易形成花器官。 反之，越向基部，其生理年龄越小。
接种操作:
横插法与竖插法:
接种室要严格消毒
接种时有一个敞口的过程，是极易引起污染的时期，主要 由空气中的细菌和工作人员本身引起，因此，接种室要严格进 行空间消毒。接种室内保持定期用1％~3％的高锰酸钾溶液对 设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭 菌外，还可在使用期间用70％的酒精或3％的来苏儿喷雾，使 空气中灰尘颗粒沉降下来。
第四章 外植体的选择、消毒和接种
目的要求
掌握选择外植体的方法； 熟练掌握接种方法。
第一节 外植体的选择
外植体的来源是决定植物组织培养成败的一个 重要因素。根据植物细胞全能性的的理论，任何细 胞、组织和器官都可以作为外植体，但实际上，不 同品种、不同器官之间的分化能力有巨大区别。
第一，选择优良的种质；
第二节 外植体的消毒、接种
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地 带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便 会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的 表面灭菌处理。
已消毒的外植体经无菌操作，接到培养基上， 这一过程叫做接种。
外植体接种的一般步骤：
外植体的修剪 流水冲洗 浸润灭菌 接种
完玻无菌1可2自至去..成璃菌将把操用来数不要需材，棒水已适水小作将用在要料当龙时准、、消，采的的切超的头。备手7毒接来部割0部刷下净好表的％到分成的子流分台消等外酒培仔适刷水植。或毒。植细当精养洗冲物接洗大的体。洗、基材种干小几烧经消上料净。箱分杯无毒。除，置钟内、液、
无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培 养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质 或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定 的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。
第二，选择健壮的植株；
组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株 上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代 谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能 是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持 所致。
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一、温度
温度是组织培养过程中的重要因素。 组织培养在最适温 度下生长分化表现良好， 大多数组织培养都是在23～27℃之 间进行，很多研究者采用了25±２℃的恒温条件。低于15℃ 时培养，组织会表现生长停止，高于35℃时对生长不利。
不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20℃、月 季是25～27℃、番茄是28℃。 温度不仅影响组培苗的生长速 度， 也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽 的形成28℃为最好， 在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。
第三，选择合适的部位；
植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功， 这些部位包括：茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表 皮、块茎的储藏薄壁细胞、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚 珠和花药等。
但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条 件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难 脱分化，或者在分化频率很低。
3.易漂浮或细小的材料，可装 入纱布袋内冲洗。 4.洗衣粉、吐温可除去轻度附 着在植物表面的污物，除去脂 质性的物质。
接种材料预处理:
(1)接种材料预培养 (2)就地套袋 (3)接种材料修整 (4)冲洗
接种前准备:
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外植体消毒:
外植体剪切:
1.叶片0.5cm×0.5cm 2.微茎尖0.2-0.5mm 3.带节茎段0.5-1.0cm 4.芽丛分离
不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30℃
下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25℃下的高。 桃
胚在2～5℃条件进行一定时间的低温处理， 有利于提高胚培
养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3～5天，可得到
无病毒苗。
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二、光照
组织培养中光照也是重要的条件之一。
1．光照强度 从目前的研究情况看，光照强度对外植体、 细胞的最初分裂增殖和器官的分化有重要影响。 一般来说， 光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容 易徒长。 2．光质 光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖以及器 官的分化都有明显的影响。 如百合珠芽在红光下培养，８ 周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下， 几周后才出现愈伤 组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出 现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。
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3．光周期 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，