第四章-外植体的选择、消毒和接种

接种操作:
横插法与竖插法:
接种室要严格消毒
接种时有一个敞口的过程，是极易引起污染的时期，主要 由空气中的细菌和工作人员本身引起，因此，接种室要严格进 行空间消毒。接种室内保持定期用1％~3％的高锰酸钾溶液对 设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭 菌外，还可在使用期间用70％的酒精或3％的来苏儿喷雾，使 空气中灰尘颗粒沉降下来。
第四，取材季节合理；
对于大多数植物而言，应在其生长的季节开始采 样。在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能 对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
第五，考虑器官的生理状态和发育年龄；
一般认为，沿着植物的主轴，越 向上的部分所形成的器官的生长时间 越短，其生理年龄也相应越老，越接 近发育上的成熟，越易形成花器官。 反之，越向基部，其生理年龄越小。
第四章 外植体的选择、消毒和接种
目的要求
掌握选择外植体的方法； 熟练掌握接种方法。
第一节 外植体的选择
外植体的来源是决定植物组织培养成败的一个 重要因素。根据植物细胞全能性的的理论，任何细 胞、组织和器官都可以作为外植体，但实际上，不 同品种、不同器官之间的分化能力有巨大区别。
第一，选择优良的种质；
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一、温度
温度是组织培养过程中的重要因素。 组织培养在最适温 度下生长分化表现良好， 大多数组织培养都是在23～27℃之 间进行，很多研究者采用了25±２℃的恒温条件。低于15℃ 时培养，组织会表现生长停止，高于35℃时对生长不利。
不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20℃、月 季是25～27℃、番茄是28℃。 温度不仅影响组培苗的生长速 度， 也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽 的形成28℃为最好， 在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。
(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和 咳嗽等；
(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
接种前外植体消毒顺序:
第三节 培养条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条 件，培养基组成、ＰＨ值、渗透压等各种化学环境条件 都会影响组培苗的生长和发育。
3.易漂浮或细小的材料，可装 入纱布袋内冲洗。 4.洗衣粉、吐温可除去轻度附 着在植物表面的污物，除去脂 质性的物质。
接种材料预处理:
(1)接种材料预培养 (2)就地套袋 (3)接种材料修整 (4)冲洗
接种前准备:
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外植体消毒:
外植体剪切:
1.叶片0.5cm×0.5cm 2.微茎尖0.2-0.5mm 3.带节茎段0.5-1.0cm 4.芽丛分离
无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培 养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质 或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定 的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。
第二，选择健壮的植株；
组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株 上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代 谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能 是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持 所致。
第三，选择合适的部位；
植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功， 这些部位包括：茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表 皮、块茎的储藏薄壁细wk.baidu.com、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚 珠和花药等。
但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条 件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难 脱分化，或者在分化频率很低。
第二节 外植体的消毒、接种
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地 带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便 会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的 表面灭菌处理。
已消毒的外植体经无菌操作，接到培养基上， 这一过程叫做接种。
外植体接种的一般步骤：
外植体的修剪 流水冲洗 浸润灭菌 接种
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一般情况下，幼年组织比老年组 织具有较高的形态发生能力。随着组 织年龄的增加，器官的再生能力逐渐 减弱甚至完全失去再生能力。
第六，选择大小合适的外植体；
建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材 料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至 难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5~ 1.00cm之间。如 果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
无菌操作可按以下步骤进行：
(1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌； (2)在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭 工作台面；
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过 火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
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3．光周期 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，
不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30℃
下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25℃下的高。 桃
胚在2～5℃条件进行一定时间的低温处理， 有利于提高胚培
养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3～5天，可得到
无病毒苗。
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二、光照
组织培养中光照也是重要的条件之一。
1．光照强度 从目前的研究情况看，光照强度对外植体、 细胞的最初分裂增殖和器官的分化有重要影响。 一般来说， 光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容 易徒长。 2．光质 光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖以及器 官的分化都有明显的影响。 如百合珠芽在红光下培养，８ 周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下， 几周后才出现愈伤 组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出 现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。