林可霉素工业生产发酵工艺优化

林可霉素工业生产发酵工艺优化谢婷;武培;韩德全;马朝安;张增辉;李胜利;赵晓强【摘要】为了提高林可霉素工业生产发酵效价,该研究对林可霉素发酵工艺进行了优化.结果表明,林可霉素最佳发酵条件为二级种子罐发酵培养基中淀粉和黄豆饼粉添加量分别为0.97％和1.43％、延长二级种子移种菌龄至48h及四级发酵罐基础料计料体积为8m3.在此优化发酵工艺条件下,林可霉素发酵四级放罐效价高达7505 U/mL,比原始工艺四级放罐效价提高了16％.初步优化了林可霉素工业生产发酵工艺,提高了林可霉素发酵效能和产量.%In order to increase the fermentation potency of lincomycin industrial production,the fermentation process of lincomycin was optimized.The results showed that the optimum fermentation conditions of lincomycin were as follow:the concentrations of starch and soybean cake powder in the fermentation medium of two-stage seeds fermenter were 0.97％ and 1.43％,respectively,the transplanting cell age of two-stage seeds was extended to 48 h and the volume of the base material of four-stage fermentation tank was 8 m3.Under the optimum fermentation conditions,the fermentation potency of lincomycin after four-stage fermentation was up to 7 505 U/ml,which was 16％ higher than that of the original fermentation process.The fermentation process of lincomycin industrial production was optimized preliminarily,and the fermentation efficiency and yield of lincomycin were improved.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2017(036)009【总页数】4页(P60-63)【关键词】林肯链霉菌;林可霉素;工业生产;发酵工艺优化【作者】谢婷;武培;韩德全;马朝安;张增辉;李胜利;赵晓强【作者单位】天方药业有限公司,河南驻马店463000;天方药业有限公司,河南驻马店463000;天方药业有限公司,河南驻马店463000;天方药业有限公司,河南驻马店463000;天方药业有限公司,河南驻马店463000;天方药业有限公司,河南驻马店463000;天方药业有限公司,河南驻马店463000【正文语种】中文【中图分类】S216.4林可霉素又称林肯霉素、洁霉素，是由林肯链霉菌（Streptomyces lincolnensis）通过好氧发酵产生的一种广谱抗生素，属于林可酰胺类素[1-4]。

林可霉素及其衍生物是一类通过抑制菌体中蛋白质的合成而起作用的药物，是一种较有前途的抗生素。

临床上适用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染，对革兰氏阴性菌也有效[5-7]。

林可霉素用药途径较多，副反应较少，适用于青霉素过敏的病人，己成为临床应用上主要的抗生素之一[8-10]。

目前对林可霉素的研究主要集中在培养基优化、无机盐或前体等物质添加、物料研究以及发酵过程控制等方面[11-16]。

研究发现，林可霉素发酵生产培养基中主要碳源为淀粉和葡萄糖，葡萄糖浓度过低时会明显影响菌体的生长，浓度过高时又会产生葡萄糖效应，从而会降低林可霉素的产量，葡萄糖效应并不是葡萄糖本身所产生的作用，而是其分解产物所致，所以在发酵过程中，选择缓慢利用的碳源，保持低浓度的葡萄糖，是避开葡萄糖效应的一种有效的方法；氮源中的黄豆饼粉降解为氨基酸或氨的速率很慢，而不至于会阻遏抗生素的合成，因此，在林可霉素的发酵生产中常用其作为氮源；pH影响林可霉素的合成，在弱碱性的环境中，有利于林可霉素的生物合成；林肯链霉菌为好氧菌，转速控制在150～190 r/min时，不但能提高发酵体系溶解氧浓度，而且不会使菌丝体过分断裂[17-21]。

国内外对林可霉素摇瓶培养阶段和发酵罐发酵阶段研究较多。

国内发酵小试或中试一般以二级发酵为主，工业生产多采用三级发酵[22-23]。

林可霉素的发酵过程可分为初期（0～24 h）、前期（24～48 h）、中期（48～140 h）和发酵后期（140 h至发酵终点）[24-25]。

国内林可霉素生产工艺普遍采用分批补料，分批补料培养基中通常含葡萄糖、玉米浆、黄豆饼粉及一些金属离子。

这些成分在发酵过程中可防止菌丝生长过盛或延缓菌体衰老，延长菌体产生林可霉素的时间，大幅提高林可霉素的效价[22]。

本研究通过考察二级种子罐发酵培养基中碳源和氮源、二级种子移种菌龄及四级发酵罐基础料计料体积对林肯链霉菌四级发酵产林可霉素的影响，优化林可霉素工业生产发酵工艺条件，以期能通过基础研究解决林可霉素工业生产实际问题，提高发酵效能和产量。

1.1 材料与试剂1.1.1 菌种林肯链霉菌（Streptomyces lincolnensis）：由天方药业有限公司提供。

1.1.2 培养基斜面培养基：淀粉2.11%，黄豆粉饼0.50%，FeSO4·7H2O 0.001%，KNO30.09%，K2HPO40.04%，MgSO4·7H2O 0.40%，NaCl 0.07%，琼脂2.00%，pH值为7.00。

摇瓶培养基：淀粉2.11%，黄豆粉饼1.58%，葡萄糖1.60%，玉米浆3.00%，（NH4）2SO40.15%，CaCO30.40%，pH值为7.00。

一级种子罐培养基：淀粉0.45%，黄豆粉饼1.00%，葡萄糖3.00%，玉米浆1.45%，（NH4）2SO40.06%，NaNO30.43%，KH2PO40.03%，CaCO30.95%，NaCl 0.65%，片碱0.10%，NH4NO30.30%，泡敌0.08%，消泡剂0.09%，pH值为7.00。

二级种子罐培养基：淀粉0.87%，黄豆粉饼1.33%，葡萄糖3.80%，玉米浆1.33%，（NH4）2SO40.40%，NaNO30.63%，KH2PO40.03%，CaCO30.75%，NaCl 0.71%，片碱0.10%，NH4NO30.40%，泡敌0.04%，消泡剂0.06%，pH值为7.00。

三级种子罐培养基：淀粉0.50%，黄豆粉饼1.35%，葡萄糖6.30%，玉米浆1.50%，（NH4）2SO40.45%，NaNO30.50%，KH2PO40.03%，CaCO30.80%，NaCl 0.88%，片碱0.10%，NH4NO30.45%，泡敌0.04%，消泡剂0.03%，pH值为7.00。

四级发酵罐培养基：淀粉0.44%，黄豆粉饼1.32%，葡萄糖6.50%，玉米浆1.32%，（NH4）2SO40.44%，NaNO30.44%，KH2PO40.03%，CaCO30.74%，NaCl 0.81%，片碱0.10%，NH4NO30.44%，泡敌0.04%，消泡剂0.03%，pH值为7.00。

大稀料培养基：黄豆粉饼10.00%，玉米浆13.00%，CaCO3 0.40%，泡敌0.08%，消泡剂0.08%，pH值为5.00。

以上培养基灭菌条件：121℃，30 min。

液化糖：淀粉30.00%，淀粉酶0.60%，液化酶0.60%，硫酸铵1.80%，115℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备HI2211pH计：北京哈纳仪器厂；TDL-80-2B台式低速离心机：上海安亭科学仪器厂；GZF-GF101-BS干燥箱：上海跃进医疗器械厂；XWW25/450旋转摇瓶机：乐山三九长征药业股份有限公司；XG1.X（Y）中型压力灭菌器：山东新华医疗器械厂；一级（2 m3）、二级（20 m3）、三级（70 m3）和四级（100m3）发酵罐：武汉同创工程设备有限公司；CX31-12L02显微镜：南京庚辰科学仪器有限公司。

1.3 方法1.3.1 林可霉素四级发酵工艺流程林可霉素的发酵工艺为四级发酵，其发酵工艺流程如下：操作要点：种子摇瓶培养：挖取斜面培养基上1 cm2左右的菌块，接种于装有100mL种子培养基的1000mL三角瓶中，30℃、220 r/min培养40～50 h，接种pH为7.00～7.40。

一级种子罐：0.10%的接种量，30℃，培养40～50 h，移种pH值为7.00～7.40。

二级种子罐：10～15%的接种量，30℃，培养20～50 h，移种pH值为7.00～7.40。

三级种子罐：15～30%的接种量，30℃，培养45～70 h，移种pH值为7.00～7.40。

四级发酵罐：30～40%的接种量，30℃，培养150～180h；稀料：30 h后每8 h 补一次，每次1～3 m3；补糖：接种后至放罐整个发酵体系中还原糖控制在0.20～1.80%；调节pH值为6.40～7.00。

1.3.2培养方法（1）二级种子罐发酵培养基中碳源的优化在原二级种子罐发酵培养基碳源基础上优化淀粉的浓度，比较二级种子罐发酵培养基中淀粉含量分别为0.77%、0.87%、0.97%和1.07%时后续四级放罐效价，以原二级种子罐发酵培养基淀粉含量0.87%为对照，确定林肯链霉菌产林可霉素的二级种子罐发酵培养基中淀粉的最优浓度。

（2）二级种子罐发酵培养基中氮源的优化在已优化淀粉浓度以及原二级种子罐发酵培养基中氮源的基础上优化黄豆饼粉的浓度，比较二级种子罐发酵培养基中黄豆饼粉含量分别为1.23%、1.33%、1.43%和1.53%时后续四级放罐效价，以原二级种子罐发酵培养基黄豆饼粉浓度1.33%为对照，确定林肯链霉菌产林可霉素的二级种子罐发酵培养基中黄豆饼粉的最优浓度。

（3）二级种子移种菌龄的确定采用管道压差法对二级种子罐接种后，考虑到工业生产四级发酵各阶段时间衔接以及生产成本，将二级种子移种菌龄由26 h延长至48 h。

通过比较二级种子移种时发酵液菌浓和四级放罐效价，确定林肯链霉菌产林可霉素的二级种子移种菌龄。