微生物检验规范
微生物检测要求
一、无菌操作要求1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。
2.进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。
3.接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。
4.进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。
5.从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。
6.接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。
7.接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。
8.吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
二、无菌间使用要求1.无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5~0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。
2.无菌间内应保持清洁，工作后用2%~3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。
3.无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。
4.处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
5.在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。
三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。
干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法。
1.灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。
微生物取样检测检验规范
气
车间
菌落
总数
≤30个/皿
平板暴露法：车间在30m2以上者，于东、西、南、北（距墙1m处）、中五点；小于30m2者，于一条对角线里、中、外三点，高度均在1.5m处采样，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5 min
取样后的琼脂培养基于37℃温箱培养48h后观察结果，求出5个或3个采样点的平均菌数
2次/月/车间
更衣室
菌落
总数
≤40个/皿
生产用水
菌落
总数
≤100CFU/ml
梯度稀释，倾注接种营养琼脂培养基，36±1℃,48h后计数，报告
对待取样的水龙头进行消毒，并打开水龙头数分钟，用经过灭菌的玻璃采样瓶去水样0.5L后及时送检，采样后按照每125ml水样加入0.1mg硫代硫酸钠除去残留余氯。
1次/月，全年检测完所有水龙头
大肠菌群
不得检出
多管发酵法：1乳糖发酵试验：接种5份10 mL水样双料培养基，每份接种10ml水样，将接种管置36℃士l℃培养箱内，培养24h士2h，如所有乳糖蛋白膝培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。2分离培养：将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃土1℃培养箱内培养18h—24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。3证实试验：经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽抱杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃士1℃培养箱中培养24h士2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。4结果报告：查MPN ( most Probable number，最可能数）检索表，报告每l00ml水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出
临床微生物检验规范总体要求.
二、临床微生物检验存在的问题
微生物标本保存和运送的原则是维持病原菌的活力， 防止非病原菌的污染或过量繁殖，对于不同的目的 病原菌，有不同的保存、运送要求。如夏天病人留 取尿液或粪便细菌培养、送检不及时，可造成非致 病菌过度生长，其结果可能把正常中段尿误诊为菌 尿或导致沙门菌和志贺菌等致病菌死亡，造成漏诊 等等。有关这方面的一些要求，尚未做到人人皆知， 特别是工人运送标本的单位，问题可能更大。
临床微生物检验规范总体要求 2
一、我国临床微生物检验的发展现状 二、临床微生物检验存在的问题
三、临床微生物检验规范总体要求
临床微生物检验规范总体要求
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一、我国临床微生物检验的发展现状
随着国民经济的飞速发展，检验医学和其他医 学学科一样，发生了深刻的变化，从仪器设备 上讲，在全自动生化分析仪，血液分析仪，尿 液分析仪和免疫分析仪进入检验科的同时，全 自动微生物培养鉴定和药敏分析仪也进入很多 医院，相当多的医院使用了质量较好的商品培 养基，药敏纸片等。
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二、临床微生物检验存在的问题
临床往往有反映细菌药敏与临床疗效不符的
现象，虽然原因很多，但与实验室的以上原 因造成不无关系。
临床微生物检验规范总体要求
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二、临床微生物检验存在的问题
4．细菌检验质控工作还要加强：尽管多年来
在细菌质控方面做了大量工作，但在按要求 规范和认识程度上还很不够，美国CLIA88把 细菌培养和药敏试验归属于高度复杂的试验 范畴。对于这一高度复杂的检验工作，必须 严格做好质控。
临床微生物检验规范总体要求
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二、临床微生物检验存在的问题
5．实验室与临床沟通不够：目前国内临床微生物 人员与临床医师间的沟通交流很不够，增加交流对 感染病的正确诊断，提高感染病诊治水平有重要作 用。比如1份痰标本中同时生长了肺炎克雷伯菌及 白假丝酵母菌，这时白假丝酵母菌的重要性如何？ 是否要报告，这种情况下如能结合患者临床情况， 即可得到 客观的结论。再如近年来细菌室在细菌耐 药机制的检测方面做了大量工作，如果细菌室只是 报告耐药酶或耐药基因而不告诉医生该酶或基因的 耐药含义，则可能被一些医生忽视。
微生物限度检查法标准操作规程完整
3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查 供试品微生物计数中 所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性 试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。
4、菌种及菌液的制备
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法 适用性试验。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]
大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102])
乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50094]
白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]
薄膜过滤法采用的滤膜孔径不大于。滤膜直径一般为50mm。滤器及滤膜使用 前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供 试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。为发挥滤膜的最大过滤效率，应 注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要 用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000m1；以免滤膜上的微生物受损伤。取照上述“供试液的制备”和“接种和 稀释”制备的供试液适量（一般取相当于1g、1ml、10cm2的供试品，若供试品 中所含菌数校对，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液总，混匀，过滤，用 适量的冲洗液冲洗滤膜。测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨 琼脂培养基平板上；测定霉菌和酵母菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖 琼脂培养基平板上，按规定条件培养、技术。每株试验菌每种培养基至少制备1张滤膜。同法测定供试品对照组和菌液对照组菌数。
微生物限度检查操作规程
更改历史微生物限度检查操作规程1.0 目的建立微生物限度检查标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确2.0 范围适用于本公司采用微生物限度检查法测定的供试品。
3.0 职责质量部负责按本规程的要求执行微生物限度检查操作。
4.0 工作程序4.1 洁净区间的确认微生物计数检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全部过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品（即待检样品、产品）中微生物的检出。
4.2 培养基4.2.1 应使用按中国药典处方及规定的方法制备的培养基。
4.2.2 所用培养基可按中国药典规定的处方及制备方法自行配制，也可使用按中国药典规定的处方生产的脱水培养基进行配制；或购买商品化的预制培养基。
4.2.3 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2~25℃、避光的环境下保存。
4.2.4 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。
4.2.5 供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
4.2.6 供试品的微生物计数方法、控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数或控制菌检查。
4.3 菌种及菌液制备检查所用的菌种及菌液制备见附件 1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。
稀释剂、冲洗液及其制备的要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查。
4.4 培养基的适用性检查供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
微生物限度检查所用的培养基每批均应进行适用性检查，检查可在供试品检查前或与供试品检查同时进行。
具体要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。
4.5 方法适用性试验供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
微生物检验操作规范
微生物检验操作规范微生物检验是临床上常见的一种检验方法，在检验过程中，如果操作人员操作不规范，很容易导致微生物感染。
一、样品打开和处理接收和打开样本的人员应了解样本对健康的潜在危害，并接受如何使用标准保护方法的培训，特别是在处理破损或泄漏的容器时。
标本的内容器应在生物安全柜中打开，并准备消毒剂。
打开试样进行加工时：1、标本管应在生物安全柜内打开。
2、必须戴手套，并建议保护眼睛和粘膜（护目镜或口罩）。
3、打开试样管时，用纸或纱布抓住塞子，防止飞溅。
二、避免注入传染性物质1、通过认真的实践和操作，避免了因损坏玻璃器皿刺伤而引起的接种感染。
尽量用塑料制品代替玻璃制品。
2、尖锐的工具损坏（如通过皮下注射针、巴斯德玻璃吸管和碎玻璃）可能导致意外注入感染性物质。
3、以下两点可以减少针刺损伤：（1）减少注射器和针头的使用（可以使用一些简单的工具打开瓶塞，然后用吸管代替注射器和针头取样）；（2）当必须使用注射器和针头时，采用配套的锐器装置以确保安全安装。
4、不要再将护套放在用过的注射器针头上。
一次性物品应丢弃在容器中，容器盖应能防止锐器渗透。
三、血清分离1、这项工作只能由受过严格训练的人员进行。
2、术中戴手套及眼、粘膜防护用品。
3、标准的实验操作技术可以避免或减少飞溅物和气溶胶的产生。
血液和血清应小心吸取，不得倾倒。
禁止用嘴吸液体。
4、吸管使用后应完全浸入消毒剂中。
移液管应在消毒剂中浸泡一段时间，然后丢弃或消毒并清洗以供再次使用。
5、带血凝块的废弃样品管加盖后，应放置在适当的防漏容器中进行高压灭菌和/或焚烧。
6、应准备一种合适的消毒剂，以清洗溅出的样本。
四、血液和其他体液、组织和排泄物的标准保护方法设计标准保护方法（包括“常规预防措施”），以降低已知或未知感染源的微生物传播风险。
五、玻璃器皿和锐器1、尽量用塑料制品代替玻璃制品。
只能使用实验室级（硼硅酸盐）玻璃，任何破碎或破裂的玻璃产品都应丢弃。
2、皮下注射针不能用作吸管。
微生物限度检查标准操作规程
微生物限度检查标准操作规程《微生物限度检查标准操作规程》一、目的微生物限度检查是药品、食品、化妆品等产品质量的重要指标之一，其目的是为了保障产品的安全性和稳定性。
本标准操作规程旨在规范微生物限度检查的操作流程，确保检查结果的准确性和可靠性。
二、范围本标准操作规程适用于药品、食品、化妆品等产品的微生物限度检查，包括大肠菌群、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌等微生物指标的检查。
三、检查设备和试剂1. 培养基：根据不同的微生物指标选择适当的培养基，如大肠培养基、Mannitol盐琼脂、Sabouraud葡萄糖琼脂等。
2. 培养皿：使用符合规定的试验培养皿。
3. 培养箱：保证培养条件的恒温培养箱。
4. 其他常用实验用具：包括无菌采样容器、吸管、移液器、无菌培养皿等。
四、操作流程1. 样品采集：从产品中采集适量样品，保持无菌状态。
2. 制备稀释液：根据样品的特性，选择适当的稀释液将样品进行适当稀释。
3. 接种培养：将稀释后的样品接种在适当的培养基上，并在符合条件的培养箱中进行培养。
4. 观察和统计：观察培养皿中微生物的生长情况，统计出微生物的数量。
5. 结果判定：根据标准规定的微生物限度标准，判断检测结果是否符合规定。
五、质量控制1. 实验员必须进行严格的无菌操作训练，并使用正确的个人防护用具。
2. 培养基的质量必须符合规定，避免培养基带有细菌污染。
3. 检查设备必须经过定期的检查和校准，保持正常的工作状态。
4. 标本的采集、处理、保存和运送必须符合规定，避免外界的污染和干扰。
六、结果报告根据检测结果和规定的限度标准，出具检测报告，标明产品的微生物限度是否符合规定，以及具体的检测结果数据。
七、总结微生物限度检查是产品质量检验的重要环节，严格按照标准操作规程进行操作，可以保证检测结果的准确性和可靠性。
实验员在操作过程中也需严格遵守规程，做好个人防护措施，确保实验室的安全和卫生。
微生物检验流程及操作标准
微生物检验流程及操作标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：微生物检验是一种重要的实验室技术，用于检测食品、水质、环境等样品中的微生物存在情况。
微生物检验需要严格遵守一系列操作标准和流程，以确保检验结果的准确性和可靠性。
下面我们将介绍一下微生物检验的流程及操作标准。
一、样品采集1. 样品的采集需要采用无菌工具，并保持样品在采集过程中不受到外界环境的污染。
2. 样品的采集过程应尽量避免接触到任何可能引入外源微生物的物质，比如皮肤、空气等。
3. 采集的样品应标明正确的标识信息，包括样品名称、采集地点、采集日期等。
二、样品处理1. 样品收到实验室后，需要尽快进行处理，避免样品内的微生物增殖或死亡。
2. 样品处理过程需要保持在无菌条件下进行，使用无菌工具进行操作。
3. 样品处理过程中需要按照检验要求进行适当的稀释，以确保实验得出准确的结果。
三、培养基准备1. 培养基的制备需要按照标准的配方和步骤进行，以确保培养基的质量符合要求。
2. 制备培养基时需要严格遵守无菌操作规范，避免细菌、真菌等外源微生物的污染。
3. 制备好的培养基需要在适当的条件下保存，确保培养基的稳定性和有效性。
四、接种操作1. 在进行微生物检验之前，需要准备好无菌的接种环、移液器等工具。
2. 采取适当的方法将处理好的样品接种到培养基上，避免接种时引入外源微生物。
3. 接种操作需要在无菌条件下进行，避免培养物受到任何污染。
五、培养与观察1. 接种后的培养基需要置于适当的温度和湿度条件下进行培养，促使样品中的微生物生长。
2. 定期观察培养基上的生长情况，记录生长的数量和形态，用于后续的分析和鉴定。
3. 在观察过程中需要注意反复进行无菌操作，避免细菌、真菌等外源微生物的污染。
六、鉴定与结果解读1. 当样品中的微生物生长到一定程度时，需要进行鉴定和分析，确定其种属和数量。
2. 鉴定过程需要参考相关的鉴定手册和标准，进行适当的试验和测试。
3. 根据鉴定结果进行结果解读，判断样品中微生物的种类和数量是否符合标准要求。
药品微生物检验技术基础操作规范
⑪试验前准备
消毒(工作台面和地面) ↓ 进行空间灭菌处理(开启净化系统和紫外线灯 ↓ 试验器具与供试品进入无菌室(通过物流) ↓ 操作人员进入第一缓冲间(洗手、消毒液消毒手) ↓ 操作人员进入第二缓冲间(穿戴无菌工作服、鞋、帽、口罩) ↓ 操作人员进入无菌室 ↓ 点燃酒精灯，消毒液的棉球消毒手 ↓ 进行试验操作。
⑧在接种霉菌、放线菌时，应在铺有浸过消毒液的湿纱 布上操作，以防孢子散落传播。 ⑨试验时使用的培养皿打开盖时开口朝向火焰，不得将 盖放工作台上，拔出玻璃容器塞子时应用小指夹住塞子 拔出，不得将塞子放在工作台上，以免造成污染。 ⑩在实验过程中观察平板培养物时，一般不宜开盖观。 如取菌落或菌苔涂片、染色，或做玻片凝集实验时，在 近火焰处操作，平皿盖可适当开启（45°），开口朝向 火焰，挑取菌落。 ⑩在涂片、染色时．应使用夹子夹持载玻片，切勿用手 直接拿载玻片，用过的玻载片和盖玻片应置消毒液中消 毒后，洗刷清洁的器皿经消毒后再洗刷，放置固定处， 备用。
⑫检验操作规程
①试验全过程应在近火焰处操作，动作要轻。 ②标记 ③使用接种环（针），灼烧灭菌。 ④用吸管吸取供试液或培养液等，用橡胶乳头吸取。 ⑤用过的玻璃器皿应立即放入消毒液缸（桶）内进行 灭菌。 ⑥用注射器吸取供试品或培养物时，注射器内应无空 气，从密封容器内抽取液体时，应通过火焰注入无菌 空气。 ⑦在开启菌种管或其他供试品安瓿之前，应用碘伏溶 液、碘酒棉球消毒容器。刻痕用的砂轮、锯刀也应消 毒，截断时要防止污染，安瓿切口通过火焰灭菌。
供试液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性， 采取适宜的方法制备供试液。供试液制 备若需加温时，应均匀加热，且温度不 应超过45℃。供试液从制备至加入检验 用培养基，不得超过1小时。 除另有规定外，常用的供试液制备方法如 下。
微生物检测标准
微生物取样方法、微生物检测标准举例一：一、空气采样及检验方法1培养基：普通营养琼脂平板，按GB4789.28中3.7条配制2采样（空气沉降法）2.1布点：面积小于30平方米的车间，设一对角线，在线上取3点，即中心一点，两端在距墙1米处各取一点；面积大于30平方米的车间，设东、西、南、北、中5个点，其中东、西、南、北点均距墙1米。
2.2采样高度：与地面垂直高度80-150厘米。
2.3采样方法；用直径为9厘米的普通营养琼脂平板在采样点上暴露20分钟盖上送检培养。
3培养：于37°C培养24小时。
4检测频率：每周空气质量标准：生车间、熟车间、成品车间：低于100个半成品库、成品库：低于10个二、设备的采样与检验方法根据生产过程所要求的重点卫生部位，实验室对其进行涂抹采样，进行细菌总数检验。
1采样方法1.1涂抹法（适用于表面平坦的设备和工器具产品接触面）取经过灭菌的铝片框（框内面积为50平方厘米）放在需检查的部位上，用无菌棉球蘸上无菌生理盐水擦拭铝片中间方框部分，擦完后立即将棉球投入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。
1.2贴纸法（适用于表面不平坦的设备和工器具接处面）将无菌规格纸（5X5厘米，纸质要薄而软）用无菌生理盐水泡湿后，于需测部分分别贴上两张，两张纸面积共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升无菌生理盐水的试管中，此液每毫升代表5平方厘米。
2检验方法2.1细菌总数的检验将上述样液充分振摇，根据卫生情况，相应地做10倍递增稀释，选择其中2-3个合适的稀释度作平皿倾注培养，培养基用普通营养琼脂，每个稀释度作2个平皿，每个平皿注入1毫升样液，于37C培养24小时后计菌落数。
结果计算表面细菌总数（cfu/cm2）=平皿上菌落的平均数X样液稀释倍数/30X22.2致病菌的检验沙门氏菌，参照GB4789.4进行金黄色葡球菌，参照GB7918.5进行4.检验合格标准：细菌总数10—100个/cm2，5.关键点：细菌总数W10个/cm2一般区域：细菌总数W100个/cm2三、人员手表面细菌污染情况的检验1.采样方法：用一支蘸有无菌生理盐水的棉拭子涂擦被检对象手的全部，反复两次，涂擦的时候棉拭子要相应地转动，擦完后，将手接触部分剪去，将棉拭子放入装有10毫升无菌生理盐水的试管内送检培养。
微生物检验规范
微生物检验规范1.目的明确微生物检验方法和监控标准，规范微生物检验的各项操作，通过对原料、产品及生产线各要求环节进行微生物测试，从检测结果来判定原料、产品及生产线微检监控点的微生物情况是否符合公司和国家规定的标准，确保产品品质。
2.适用范围公司所有需要作微生物检验的原料、每批产品及微检监控点。
3.职责3.1 品保微生物检验员负责微生物检验实验器材和无菌室的准备工作。
3.2品保微生物检验员负责原料和生产线微检监控点的微检样品抽样、保存、登记和微生物检测工作。
3.3成品制程人员负责成品微检样品的抽样工作，品保微生物检验员负责成品微检样品的保存、登记和微生物检测工作。
3.4品保微生物检验员负责出具检测报告并作出符合性判定。
3.5品保科长负责微生物检测报告的审核。
4.作业程序4.1实验器材4.1.1 实验器材、培养基和试剂1．超净工作台 2．恒温培养箱 36±1℃3．低温培养箱 25-28℃ 4．恒温水浴锅 46±1℃5．电子/托盘天平（精确到0. 1g） 6．高压蒸汽杀菌锅7．烘箱 8．酒精灯9．记号笔 10．打火机11．镊子 12．药匙13. 生物滤膜 14．培养皿 9cm/6cm15. 锥形瓶 300ml/500ml+硅橡胶塞 16．试管17．小发酵管 18．试管架19．接种环 20．显微镜21．塑料篮子 22．移液管 1ml、5ml、10ml23. 膜过滤设备 24. 医用不锈钢剪刀4.1.2培养基和试剂1．总菌数培养基平板计数琼脂培养基2．大肠菌群培养基结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、煌绿乳糖胆盐（BGLB）3. 霉菌、酵母菌培养基虎红培养基4．氯化钠6．乙醇7．二氧化氯粉剂8. 过氧乙酸4.2 微生物检验的前准备4.2.1检验所需器具的灭菌4.2.1.1培养皿及移液管的干热灭菌洁净干燥的培养皿，倒放于专用培养皿铁筒内，洁净干燥的移液管，尖端朝下，置于移液管专用的铁筒内，把铁筒放在烘箱中，于 120℃干热灭菌120分钟后，调至 160-180℃干热灭菌120分钟后，关掉烘箱，自然冷却至60℃以下，方可打开烘箱门取出置无菌室冷却备用。
微生物检验中应该注意的重要细节和操作规范
微生物检验中应该注意的重要细节和操作规范微生物检验是现代医学和工业生产中不可或缺的重要环节。
无论是医院实验室，食品安全监督机构，还是化工企业，都需要进行微生物检验来保障产品的质量与安全。
然而，在实际的微生物检验中，由于工作人员对于操作规范和细节的不充分理解，或者对于标准所要求的操作流程没有严格遵守，导致的错误结果和数据偏差影响了检测的准确性与可信度。
因此，为了保证微生物检测的结果准确可靠，特别是在2023年这个科技迅速发展的时代，必须严格遵守操作规范和注意细节。
一、操作规范对于微生物检验来说，操作规范非常关键。
严格按照标准程序和操作规范开展检验是确保结果准确的重要保障。
具体应注意以下几点：1. 样品采集应准确无误在微生物检验中，样品的采集和处理是至关重要的。
不同的样品有着不同的采集方法和要求，应该注意其中的区别。
例如，在食品样品检测中，不同的食品产品对于样品的采集和处理有着不同的要求，针对性地进行处理，可以提高检测的准确性。
2. 样品的保存和运输应正确无误在进行微生物检验之前，样品的保存和运输也是需要特别注意的。
不同的样品有着不同的保藏方法和要求，需要根据标准程序进行处理。
同时，针对不同的样品还需要根据标准要求选用适当的运输方式和工具，以保证样品的完整性和准确性。
3. 设备的使用和操作应规范无误在微生物检验中，使用符合标准要求的设备和仪器是必不可少的。
工作人员需要对于设备的使用和操作有着清晰的认识，并严格按照标准程序进行操作。
同时，不同设备的使用也有着不同的注意点和操作流程，根据具体情况进行操作和维护。
4. 根据标准程序进行样品准备在进行样品检测之前，还需要进行样品的预处理和准备工作。
根据标准程序对于样品进行处理，保证样品的质量和准确性。
同时，对于样品的预处理和准备需要严格按照标准要求进行，避免对后面的检验结果产生影响。
二、注意细节除了操作规范之外，在进行微生物检验时还需要注意一些细节问题，以提高检测的准确性。
临床微生物检验基本技术标准-2023年5月1日实施
目次范围 (1) 1规范性引用文件 (1) 2术语和定义 (1) 3无菌操作及消毒灭菌技术要求 (2) 4标本处理及制片技术要求 (3) 5染色技术要求 (4) 6显微镜检查技术要求 (4) 7接种技术要求 (5) 8培养技术要求 (7) 9鉴定技术要求 (8) 10分子检测技术要求 (11) 11免疫学检测技术要求 (12) 12质量保证 (12) 13临床微生物检验基本技术标准1 范围本标准规定了医学实验室在临床微生物检验领域的基本技术要求。
本标准适用于开展临床微生物检验的医学实验室。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
GB 19489 实验室生物安全通用要求WS/T 442 临床实验室生物安全指南WS/T 639 抗菌药物敏感性试验的技术要求WS/T 497 侵袭性真菌病临床实验室诊断操作指南3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。
3.1消毒 disinfection杀灭或清除物体上活的病原微生物的方法。
3.2灭菌 sterilization杀灭物体上所有微生物（包括细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物）的方法。
3.3无菌 asepsis指不存在活菌。
3.4无菌操作 aseptic operation防止微生物进入人体或无菌物品、无菌区域的操作。
3.5接种 inoculation将目标微生物转移至适于生长繁殖的人工培养基或活的生物体内的方法。
3.6荧光淬灭 fluorescence quenching指由于荧光分子与其他分子发生作用而出现的光度降低、发光时间缩短乃至停止发光的现象。
3.7一套血培养 a set of blood culture从同一个穿刺点采集的血液，通常分别注入一个需氧血培养瓶和一个厌氧血培养瓶进行血培养。
微生物检验流程及操作标准
微生物检验流程及操作标准微生物检验的流程包括以下步骤：1. 标本采集：根据患者的症状和规章制度正确采集标本，及时将采集到的标本送至检验科进行接种处理。
在运送标本的过程中，需要保持相应的温度和氧气，以防止标本干燥。
2. 镜检：检验人员运用显微镜直接观察标本，辨别相关致病菌的形态与数目，并进行初步判断。
必要时，还需要对标本进行染色后再观察，以对致病菌的性质和来源进行鉴别，更能排除污染因素，使标本致病菌的检出率得到大幅度提升。
3. 分离培养：采集的标本中不可避免地会吸附细菌，如果在镜检环节发现标本上吸附的细菌，就需要对标本实施分离纯化，并将其接种于适宜的培养基上，如显色培养基、血平板培养基、营养琼脂培养基等。
再将空气和温度调整至适合细菌生长的数值，获得便于进一步鉴定的细菌。
4. 细菌鉴定：检验人员通过细菌形态、菌落特点、酶类检测、血清学试验、生化反应等方式鉴定分析分离获得的标本，明确致病原因。
微生物检验的操作标准如下：1. 尽量在病程早期、症状典型以及在使用抗生素之前采集标本。
2. 标本应使用无菌容器盛放。
3. 血液为无菌液体，因此在采集时要避免皮肤的正常菌群污染。
多采用血培养瓶运送，随后放入血培养系统自动培养。
如有报阳则进行下一步检验：涂片镜检报给临床初步结果；需氧和厌氧瓶分别转种血平板，巧克力平板与厌氧血平板等；随后进行菌种鉴定以及药敏试验。
4. 脑脊液标本一般需要进行离心，以富集细胞。
一般检验流程为进行涂片镜检，包括革兰染色，抗酸染色与墨汁染色等。
增菌管进行增菌，分离培养转至血平板，巧克力平板，沙保弱平板等。
5. 痰液镜检一般包括革兰染色与抗酸染色，分离培养多用巧克力平板和血平板。
6. 尿液常做定量检测，取10微升尿液进行连续划线。
7. 粪便常用革兰染色做菌群比检测；分离培养多用麦康凯与SS平板。
8. 各类微生物标本应通过传递窗进行传递。
以上信息仅供参考，建议咨询专业人士获取准确信息。
微生物限度检验操作规程
1目的规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠。
2依据《中国药典》2015版。
3范围本标准适用于微生物限度检验。
4责任中心化验室负责人：对本规程的实施负责。
中心化验室检验人员：严格按照本规程执行检验操作。
5程序5.1执行标准：《中国药典》2015版。
5.2抽样：照《取样标准操作规程》进行。
6内容6.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。
检查时，按已验证的计数方法进行供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。
6.1.1设备、仪器及用具6.1.1.1设备微生物限度检测室、净化工作台、生化培养箱（30〜35£）、生化培养箱（20〜25£）、电热恒温水浴锅、烘箱、脉动真空灭菌柜、紫外灯等。
6.1.1.2仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、移液枪及吸头、薄膜过滤器等。
6.1.1.3用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.1.2试液6.1.2.1消毒液A.0.1%新洁尔灭溶液B.75%乙醇溶液6.1.2.2稀释液、试剂及配制A. pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g,加纯化水1000ml，微温溶解，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。
B.聚山梨酯80C.无菌十四烷酸异丙酯D. pH6.8无菌磷酸盐缓冲液6.1.3培养基胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基6.1.4操作方法6.1.4.1试验前准备6.1.4.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、移液枪吸头（1ml、10ml）、量筒、稀释液、培养基等移至传递窗内。
每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。
6.1.4.1.2开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。
微生物检验的操作规范
微生物检验的操作规范一、检验样品的制备1、冷冻样品先使之融化，可在0-4℃融化，时间不超过18小时，也可在不超过45℃的环境中融化，时间不超过15分钟，放入无菌室。
2、按照程序进入第一道缓冲间换上工作服，口罩、工作帽、拖鞋，经过第二道缓冲间进入无菌室。
3、先将自己的手部用70%-75%的酒精棉消毒，然后开始制样。
4、包装的样品，应先将包装物表面擦干净，然后用70%-75%的酒精消毒开启部位及其周围。
5、用灭菌手术剪及镊子打开包装，剪取25G样品于无菌袋中，加入225ML稀释剂或培养基进行均质（10%稀释）。
6、工器具及加工设备的样液充分摇匀，待检。
7、样品从均质到接种相隔时间不应超过15分钟。
二、检验1、成品按出口微生物学检验方法标准GB/T4789.2、GB/T4789.3、GB/T4789.4、GB/T4789.38进行，或根据客户需要采用客户指定的检验方法。
2、生产用水微生物检验按GB5750进行。
3、工器具及加工设备等要根据其污染的程度做倍加稀释，然后进行检验。
三、检验过程中的要求：1、在检验过程中，样品、稀释剂、试剂、培养基及所用一切器具等必须经过有效的灭菌程序。
2、所用检验操作必须严格遵循无菌程序。
3、制备试剂和培养基所用的水应为去离子水或玻璃器皿蒸馏水。
4、检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、器皿等必须尽快灭菌和洗刷，清洗过的器皿不残留洗剂痕迹。
5、检验结束后，用有效的消毒液消毒工作台面及手部以保证安全。
四、检验记录和结果报告1、经检验的样品应填写详细的真实的完整的检验记录，不得随意涂改，检验记录以月为单位，装订成册备查。
记录内容有：样品名称、样品数量、样品编号、生产日期、取样日期和检验日期、检验项目及各项反应情况，评语和结论、检验结束日期、检验人等。
2、检验结束后，应尽快根据实际检验结果填写检验结果报告单，经有关人复核无误后分送生产经理、品管部、生产厂长、质检科，并留底存档，备查两年。
微生物检验总则GB-4789
随机性
代表性 无菌性
3.2采样方案 (1) 根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程 度等确定采样方案。 (2) 采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、c和 m 值,三级采样方案设有n、c、m 和 M 值。 n:同一批次产品应采集的样品件数; c:最大可允许超出 m 值的样品 数; m:微生物指标可接受水平限量值(三级采样方案)或最高安全限 量值(二级采样方案); M:微生物指标的最高安全限量值。
2.3.3干热灭菌
是利用恒温干燥箱内120ºC～150ºC的高热，并 保持90～120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的 的一种方法。主要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中 进行灭菌，且不易被高温损坏的玻璃器皿、金属器 械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。用此方法灭 菌的物品干燥，易于贮存。
2.3.4过滤除菌
食品安全国家标准食品微生物学检验总则 GB 4789.1-2016
目录
一、范围 二、实验室基本要求 三、样品的采集 四、检验 五、生物安全与质量控制 六、记录与报告 七、检验后样品的处理
1/范围
本标准规定了食品微生物学检验基本 原则和要求。 本标准适用于食品微生物学检验。
2/实验室基本要求
2.1检验人员 (1) 应具有相应的微生物专业教育或培训经历,具备相应的资质,能 够理解并正确实施检验。 (2)应掌握实验室生物安全操作和消毒知识。 (3) 应在检验过程中保持个人整洁与卫生,防止人为污染样品。 (4) 应在检验过程中遵守相关安全措施的规定,确保自身安全。 (5) 有颜色视觉障碍的人员不能从事涉及辨色的实验。
2.2微生物基本操作
30%
梯度稀释
平板倾注
45%
35%
平板划线
微生物检验操作规范
微生物检验操作规范一、目的通过对纯化水的微生物限度进行检验，以确保能够达到要求。
二、适用范围适用于纯化水的微生物限度检验。
三、检验依据2010版《中国药典》附录微生物限度检查法。
四、检验环境（地点：微生物限度室）微生物限度检查在环境洁净度万级实验室内的百级洁净工作台。
五、实验材料的准备（地点：理化实验室）1、培养基及稀释液A. 营养琼脂培养基；B. 玫瑰红钠琼脂培养基；C. 0.9%氯化钠溶液2、培养基的制备直接购买配制好的干粉培养基，按培养基包装上的说明，取规定量的干粉培养基及纯化水进行配制，之后，按说明上的温度、时间要求，对培养基进行灭菌。
3、其它实验材料（1）微孔滤膜（孔径≤0.45微米，直径约50mm）；（2)量筒；（3）不锈钢镊子；（4）具塞三角烧瓶；（5）75%酒精棉；（6）1ml单标线移液管；（7）不锈钢试管架；（8）规格为90mm的培养皿。
以上材料中1ml单标线移液管和培养皿（用牛皮纸包裹住）需经过120℃时间为30min的湿热灭菌。
其它物品不需要进行灭菌处理。
六、实验设备1）高压蒸汽灭菌器；2）生化培养箱；3）智能集菌仪；4）洁净工作台；5）电热鼓风干燥箱七、样品取样数量2个出水口的样品各50ml八、实验操作（地点：微生物限度室）实验前的准备：1ml单标线移液管和培养皿在灭完菌后需要电热鼓风干燥箱中进行烘干，以免有水珠影响到实验结果。
因冲洗液（0.9%氯化钠溶液）也需要灭菌所以用量筒量取100ml 分别装入具塞三角烧瓶中，其中装需要样品的两个具塞三角烧瓶则只需移取10ml的0.9%氯化钠溶液即可。
先把智能集菌仪及其配件在洁净工作台内进行组装（使用方法请见智能集菌仪作业指导书），然后把所需要的器具在灭菌烘干完毕后，移入用消毒剂（0.1%新洁尔灭或75%酒精）擦拭过的万级实验室的洁净工作台内，并打开洁净工作台内的紫外灯，同时，开启车间内的净化系统和紫外灯（填写相应的表格）。
在开启紫外灯的同时进行培养基和冲洗液的灭菌。
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微生物检验规范1.目的明确微生物检验方法和监控标准，规范微生物检验的各项操作，通过对原料、产品及生产线各要求环节进行微生物测试，从检测结果来判定原料、产品及生产线微检监控点的微生物情况是否符合公司和国家规定的标准，确保产品品质。
2.适用范围公司所有需要作微生物检验的原料、每批产品及微检监控点。
3.职责3.1 品保微生物检验员负责微生物检验实验器材和无菌室的准备工作。
3.2品保微生物检验员负责原料和生产线微检监控点的微检样品抽样、保存、登记和微生物检测工作。
3.3成品制程人员负责成品微检样品的抽样工作，品保微生物检验员负责成品微检样品的保存、登记和微生物检测工作。
3.4品保微生物检验员负责出具检测报告并作出符合性判定。
3.5品保科长负责微生物检测报告的审核。
4.作业程序4.1实验器材4.1.1 实验器材、培养基和试剂1．超净工作台2．恒温培养箱36±1℃3．低温培养箱25-28℃4．恒温水浴锅46±1℃5．电子/托盘天平（精确到0. 1g）6．高压蒸汽杀菌锅7．烘箱8．酒精灯9．记号笔10．打火机11．镊子12．药匙13. 生物滤膜14．培养皿9cm/6cm15. 锥形瓶300ml/500ml+硅橡胶塞16．试管17．小发酵管18．试管架19．接种环20．显微镜21．塑料篮子22．移液管1ml、5ml、10ml23. 膜过滤设备24. 医用不锈钢剪刀4.1.2培养基和试剂1．总菌数培养基平板计数琼脂培养基2．大肠菌群培养基结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、煌绿乳糖胆盐（BGLB）3. 霉菌、酵母菌培养基虎红培养基4．氯化钠6．乙醇7．二氧化氯粉剂8. 过氧乙酸4.2 微生物检验的前准备4.2.1检验所需器具的灭菌4.2.1.1培养皿及移液管的干热灭菌洁净干燥的培养皿，倒放于专用培养皿铁筒内，洁净干燥的移液管，尖端朝下，置于移液管专用的铁筒内，把铁筒放在烘箱中，于120℃干热灭菌120分钟后，调至160-180℃干热灭菌120分钟后，关掉烘箱，自然冷却至60℃以下，方可打开烘箱门取出置无菌室冷却备用。
4.2.1.2锥形瓶及移液管的湿热灭菌洁净的锥形瓶，塞上硅橡胶塞并用牛皮纸包扎好瓶口，洁净的移液管，用牛皮纸包扎完善后，置于蒸汽灭菌锅中，于121℃湿热灭菌20分钟即可。
4.2.1.3镊子、接种环等的火焰灭菌接种环、镊子要在酒精灯上须灼烧过方可使用；稀释操作时试管口应在火焰上方；培养基容器口边在火焰上方。
4.2.1.4化学灭菌（75%酒精、100×10-6ClO2）无菌超净台，手部及不能加热灭菌的PE或塑胶制品，桌子等需用化学灭菌法；操作台、桌子、凳子、地面在使用完后均用100×10-6 ClO2擦洗灭菌。
4.2.2培养基及其缓冲稀释液的配制和湿热灭菌4.2.2.1 0.9%生理盐水的配制称取2.25g氯化钠，溶于250ml蒸馏水中，经湿热灭菌即可。
4.2.2.2 75%酒精的配制取375ml无水酒精，则需加水375/0.75-375=125ml4.2.2.3培养基的配制和灭菌条件灭菌完全后的培养基置于46±1℃的水浴锅中,待培养基的温度降至46±1℃方可用.4.2.2.4 湿热灭菌的步骤：（1）检查蒸压釜中有否足够的水。
（2）检查所有载有液体瓶子的螺旋盖（或塞）是否有松动。
（3）检查各待灭菌物品是否已用牛皮纸包裹完善。
（4）小心地关好杀菌釜的盖/门。
除非每个锁都已彻底锁紧，否则不得加压。
（5）检查排气道或排气阀是否打开。
（6）加热，使所有空气从排气道中随着蒸汽自动排出。
蒸汽要猛烈排放2-3min，以保证蒸压釜内冷空气全部排出。
关闭通风阀或排气阀。
（7）继续加热，至达到预定压力及温度。
设备和培养基将在121℃下维持20min，以进行灭菌。
所需压力要连续维持一定时间。
（8）所需加热时间一过，停止加热。
在排气阀不打开的情况下让压力自动下降到零。
否则不要打开蒸压釜。
当压力为零时，小心打开排气阀，待蒸气排尽后，打开蒸压釜盖，让它敞开几分钟以泄去多余的热蒸汽，并将釜内原载有的物品充分冷却。
（9）取出釜内原载有培养基或生理盐水的瓶子，将这些瓶子存放在无菌室的传递箱中待之冷却备用。
灭菌完成后的培养基，温度降至46±1℃方可使用。
所有灭菌完成后的物品，在使用前都必须保持包裹完善无破损的状态。
4.2.3无菌室及超净台的灭菌4.2.3.1每天实验前、后把无菌室地面及超净台打扫干净，每天用100×10-6ClO2消毒桌面、地面。
每月用2%过氧乙酸熏蒸。
4.2.3.2实验结束后打开紫外灯对无菌室空间和表面进行杀菌1小时。
4.2.3.3实验前，提前1小时打开超净台紫外灯及无菌室紫外灯。
关掉紫外灯后，打开无菌室和超净台通风装置，30分钟后，即可进行实验操作。
4.3.样品的抽样和判定标准4.3.1实验前应登记样品，给样品编号，记录检验时间、品项、规格、生产日期、批号、检测项目等，并根据样品数来配制培养基。
4.3.2样品的抽样和判定标准天然水的产品名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准备注：按抽样频率，检验方法一半采用GB-4789，一半采用滤膜法。
4.3.3生产线微检监控点的样品的抽样和判定标准各监控点名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准4.4微生物检测方法4.4.1滤膜法: 适用于进行滤膜法检测的各种微检样品。
4.4.1.1 仪器：冰箱：0～4℃；恒温培养箱：36±1℃/25-28℃；恒温水浴锅：46±1℃；电子天平：精确至0.1g；灭菌平皿:直径60mm或90mm；膜过滤设备；滤杯；0.45μm滤膜；超净工作台；真空泵；高压灭菌锅；灭菌的剪子、镊子、玻璃瓶及其它物品。
4.4.1.2试剂与培养基平板计数培养基、虎红培养基、煌绿乳糖胆盐培养基，0.9%生理盐水，121℃灭菌20min；结晶紫中性红胆盐琼脂煮沸灭菌2min；75%乙醇；100ppm二氧化氯。
4.4.1.3操作步骤:（1）将样品摇匀，取100ml倒入膜过滤装置中，打开抽滤泵，开始抽滤，抽干滤液后关上抽滤泵。
（2）将镊子在火焰上灭菌，膜用灭菌过的镊子取下，在火焰旁正面贴于预先制备的培养基平皿中，平板计数琼脂培养基用于培养菌落总数，虎红琼脂培养基用于培养霉菌和酵母菌，VRBA培养基用于培养大肠菌群，膜下避免出现气泡。
（3）培养a.菌落总数：倒置于36±1℃的恒温箱中，培养48h±2h。
菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。
b.霉菌和酵母菌：倒置于25-28℃恒温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。
菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。
c.大肠菌群①倒置于36±1℃的恒温箱中，培养18h-24h。
取出平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
②从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24h~48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
③大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以①中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每100ml样品中大肠菌群数。
例：在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10/100ml=60cfu/100ml。
4.4.2国标法：适用于不能用滤膜法检测的各种微检样品以及规定用国标法检测的样品。
4.4.2.1菌落总数4.4.2.1.1设备与材料：冰箱：0～4℃；恒温培养箱：36±1℃；恒温水浴锅：46±1℃；电子天平：精确至0.1g；灭菌吸管；灭菌平皿：直径90mm或60mm；超净工作台；高压灭菌锅及其它物品。
4.4.2.1.2培养基与试剂：平板计数琼脂培养基，0.9%生理盐水，121℃灭菌20min；75%乙醇；100×10-6 ClO2溶液。
4.4.2.1.3操作步骤：（1）样品稀释及培养a.以无菌操作取样品。
b.取样品25（g）ml加入到225ml灭菌生理盐水中，经充分混匀制成1：10的样品匀液。
c.用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。
d.另取1ml灭菌吸管，按上述操作方法，制备10倍系列递增稀释样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
e.根据食品卫生标准要求或对试样污染情况估计，选择2个-3个适宜稀释度（液体样品可包括原液），对于菌数较少的样品，采用原倍。
在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入两个无菌平皿内，同时分别取1ml稀释液加入无菌平皿中作空白对照。
及时将6-7ml或15-20ml冷却至46℃的培养基倾注入平皿。
采用原倍培养的，直接将培养基注入培养皿中作为空白。
f.待琼脂凝固后，翻转平板，置36℃±1℃恒温箱内培养48±2h。
(2)菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器。
记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。
a.选取菌落数在30-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
b.其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
c.当平板上出现菌藻间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
(3) 菌落总数的计算方法a.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。
b.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：N=∑C/（n1+0.1n2）d式中：N——样品中菌落数；∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一个适宜稀释度平板上的菌落数；n2——第二个适宜稀释度平板上的菌落数；d——稀释因子（第一稀释度）。
c.若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
d.若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。