组培实验外植体选择处理及接种培养

4．工具用后及时消毒，避免交叉污染。 5．工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸 时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作 过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。
6．由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰 尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应 拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。
中浸15-20s，再用无菌水冲洗数次。
（3）玻璃器皿的灭菌 • 湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进
行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min—30min。 • 干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。 • 煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。
（4）金属器械的灭菌 火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒 精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。 这一步骤应当在无菌操作过程中反复进 行。 干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用 纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防 止污染的发生。
• 2.污染的预防措施
• 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭 菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培 养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污 染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几 种预防措施。
细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～2天即 可发现。 原因：材料带菌
培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种针在使 用前必须在火焰上烧红。
真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后 3～10天才能发现。 原因：周围环境不清洁
1. 选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究， 培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的 种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的， 具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。
2. 选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株 上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代 谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。
刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中 或插在器械灭菌器中，用时在火焰上消毒，待冷却后使 用。每次使用前均需进行用具消毒。
（二）外植体的培养 接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优
点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育 ，研究植物的生命活动。
培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求 进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培 养基的pH值等。
（1）防止材料带菌
①用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预 培养。枝条水洗净插入无糖的营养液或自来水促使抽枝，以这 种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材料的污 染。
或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒 长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。
②选择合适的时间去田间采取外植体
2．温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更 为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多 数植物最适温度在23C-32C之间。培养室一般所 用的温度是25C±2C。低于15C或高于35C，对 生长都是不利的。
3．湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培 养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培 养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动 。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而 干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度 过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内 保持70%-80%的相对湿度。
3.选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物 的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期 取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高； 花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形 成愈伤组织。
4.选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异 。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组 织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
尔敏或75%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使 用前用75%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定 期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。 • （7）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程 序进行
二、外植体的接种和培养 （一）外植体的接种 （二）外植体的培养
（一）外植体的接种
外植体的接种——是把经过表面消毒后的植物材料切碎 或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养 基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操 作过程中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员 本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防 止工作人员本身引起的污染。
很好 很好 很好 最好
好 好 很好 好 较好
（三）污染问题及解决措施 1. 污染的原因 污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌， 导致培养失败的现象。 污染的原因：从病源菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类； 从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭 菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。
• 1．操作人员需着经消毒的白色工作服，戴口罩。进入 接种室前，工作人员的双手必须进行消毒，用肥皂和水 洗涤能达到良好的效果, 进行操作前再用75%的酒精擦 洗双手。
• 无菌操作室的灭菌 • 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用
75%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。 使用前用75%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。 一年中要定期1-2次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。
(二)外植体的处理 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处 理。植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行 修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中 冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和 真菌，因此还需进一步灭菌。
常规的表面灭菌处理方法 ①把材料放进75%的酒精中约30～ 60s。 ②用2.5%的CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡15～20min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润 剂，能增强灭菌效果。
②对易污染而难灭菌的材料用多种药液交替浸泡消毒： • 一是将外植体用洗涤液充分洗净并修整干净； • 二是将材料放入75%洒精中灭菌30-60s； • 三是在1：500的Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中
浸5min； • 四是在2.5%次氯酸钠溶液中灭菌20—30min； • 五是用无菌水冲洗5次，或放入无菌的0.1mol盐酸（HCl）
4 无菌操作技术
一、外植体的选择与处理 二、外植体的接种和培养 三、试管苗的驯化与移栽 四、常见问题与解决措施
一、外植体的选择与处理
（一） 外植体的选择 （二） 外植体的处理 （三）污染问题及解决措施
（一）外植体的选择 植物组织培养的主要作业大致包括：外植体的选择与
处理、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件 的调控。
4．氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液 体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。
2．操作期间经常用75%的酒精擦拭双手和台面。 特别注意防止“双重传递”的污染，例如：器 械被手污染后又污染培养基。
3．在打开培养瓶时，最大的污染危险是管口边沿沾染 的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火 焰烧瓶口。
如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热 度，以杀死存在的细菌。
为避免灰尘污染瓶口，可用纸或者保鲜膜包扎瓶 口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污 染机会。
• （5）布质制品的灭菌 • 湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿
热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅 中，用1.1公斤/厘米2 （即15磅/英寸2），121C的 温度，灭菌20 min～30min。
• （6）无菌操作室的灭菌 • 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁
• 避免阴雨天去田间采取外植体。 • 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染
少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。
• 目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。 在菌类长入组织内部时，要剥去上年生的鳞片， 甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织， 以收到一定的防污染效果。
（2）外植体的灭菌 ①多次灭菌法：一是将切好的外植体放入2.5%的次氯酸盐溶 液中消毒20-30min；二是在无菌蒸馏水中冲洗3次；三是将材 料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；四是第二天 再将外植体用2.5%次氯酸钠灭菌20-30min，然后用蒸馏水洗3 次。对层积过的种子可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要 灭菌。
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂
次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 氯化汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素
使用பைடு நூலகம்度（%）
2—3 2
饱和浓度 0.1—1 70—75 10—12 1—2
1 4—50mg/L
清除的难易
易 易 易 较难 易 最易 易 较难 中
消毒时间 效 果
5—30 5—30 5—30 2—10 0.2—2 5—15 2—10 5—30 30—60
1．光照 对离体培养物的生长发育，光照条件有重 要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下 有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也 有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长 需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮， 促进“异养”向“自养”转化，提高移植的成活率。
普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者 适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。