外植体的选择与灭菌
外植体及消毒
灭菌(STERILIZATION)
6、培养室灭菌
熏蒸灭菌： 2ml/m3甲醛 + 0.2g/m3 高锰酸钾
新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次； 隔2-5天用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰
酸钾擦架1次； 喷洒75%酒精灭菌降尘。
消毒(SANITIZATION)
消毒(Sanitization)：杀死、消除或抑制部分微生 物，使之不发生作用。
因此，外植体选择需要具有明确的目的，选择具有一 定代表性的基因型，以提高成功率及实用性。
外植体取材部位
不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导 条件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有 的部位很难脱分化，或者再分化频率很低，甚至只 分化出芽不长根或只分化出根而不长芽。 如百合科不同属的植物:风信子、虎眼万年青易于 再生形成小植株、而郁金香较难；同种百合鳞茎的 鳞片外层比内层再生能力强，下段比中上段再生能 力强。 对大多数植物来讲，茎尖是较好的部位，其形态 已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，但易受材 料来源的限制。因此，茎段、叶片、花粉、胚珠等 材料也是常用的取材部位。
抗生素（ANTIBIOTIC）
烟草、西番莲的组培中发现，植株下部组织产生营养 芽的比例高，而上部组织产生花器官的比例高；木本 植物幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条做外植体效果 较好。
外植体大小
外植体的大小，应根据培养目的而定。
如果是胚胎培养或脱毒，则外植体宜小；如果是进行 快速繁殖，外植体宜大。
但外植体过大，杀菌不彻底，易于污染；过小 离体培养难于操作、成活。
一般外植体大小在0.5—1.0cm为宜。具体说叶片、花 瓣等约为5mm2，茎段则长约0.5mm，茎尖分生组织带 一两个叶原基0.2—0.3mm大小等。
第四章 外植体的选择、消毒和接种
接种材料预处理:
(1)接种材料预培养 (2)就地套袋 (3)接种材料修整 (4)冲洗
接种前准备:
1
2
3
456外植体 Nhomakorabea毒:外植体剪切:
1.叶片0.5cm×0.5cm 2.微茎尖0.2-0.5mm 3.带节茎段0.5-1.0cm 4.芽丛分离
六、外植体的褐变及其防止措施
褐变
• 褐变是指外植体在培养过程中体内的多 酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质 氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐 化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐 色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影 响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐 而死亡的现象
影响褐变的因素
• 植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量 高的植物易发生褐变 。
(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和 咳嗽等；
(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
接种前外植体消毒顺序:
第三节 培养条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条 件，培养基组成、ＰＨ值、渗透压等各种化学环境条件 都会影响组培苗的生长和发育。
污染的原因及其预防措施
1、污染：植物组织培养 过程中培养基和培养材 料滋生杂菌，导致培养 失败的现象
2、污染的原因 • 一是病原菌污染（细菌、
真菌） • 二是外植体、培养基、
培养器皿带菌 • 三是操作人员未遵守操
作规程。
真菌污染
污染的预防措施
组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽 视的技术环节。预防措施有： • 防止材料带菌------选择取材时间、材料与培养、 外植体灭菌等措施； • 防止用具带菌------器皿与金属器械灭菌； • 操作室要处于无菌状态------工作室、培养室灭菌 等； • 操作人员要按照操作程序进行。 • 在培养基中加入抗菌素 • 分散接种
4 外植体的选择和灭菌
吐温的使用:0.1%,表面活性剂, 吐温的使用:0.1%,表面活性剂,浸润作用 无菌水: 无菌水:在用灭菌剂之前和之后均需用无菌水冲 洗数遍. 洗数遍.
8
二,外植体的灭菌方法
具体的灭菌方法和步骤: 具体的灭菌方法和步骤:依不同的材料而不同
P61:图4-1 P61: 植物外植体消毒的一般程序
9
第三节 外植体的接种和培养
二,外植体的接种
擦—冲—开—灭—切— 冲 开 灭 切 烧—取—烧—夹—放—烧—包 取 烧 夹 放 烧 包
10
三,培养条件
温度:25±2℃; 温度:25±2℃; 光照:包括光照,光质和光周期; 光照:包括光照,光质和光周期; 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 pH:5.6 离子, pH应在5.2以下 应在5.2以下. 离子, pH应在5.2以下. 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 培养 室的湿度70 70室的湿度70-80%. 气体: 气体:氧;二氧化碳;乙烯等. 二氧化碳;乙烯等.
2
Байду номын сангаас
外植体种类
带芽外植体 胚 分化器官, 分化器官,组织 花粉, 花粉,雌配子体中的单倍体细胞
3
外植体的部位选择
原则上可用植物的任何部位; 原则上可用植物的任何部位 但不同种类植物及同 一植物的不同部位对诱导条件反应不同; 一植物的不同部位对诱导条件反应不同 选择优良种 质,增殖能力强的外植体 外植体应容易得到 应考虑得到无毒苗 注意:外植体的幼化程度,年龄 与着生部位. 注意:外植体的幼化程度, 与着生部位. 易形成花器官. 植物主轴 向上的部分 生理年龄老 易形成花器官 向基部的部分 生理年龄小 易形成根等器官. 易形成根等器官 幼年组织较老年组织具有较高的形态发生能力
组织培养技术
第五章组织培养技术第一节植物组织培养所谓植物组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织. 器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
狭义上是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也包括在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植株。
一、概述（一）概念1. 植物组织培养：是指通过无菌操作，把植物的外植体接种于人工配置的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其成为完整植株的方法。
2. 外植体：是指用于植物组织培养的接种材料，它包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。
3. 愈伤组织（Callus ）:原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
（二）组织培养类型1. 根据接种的外植体不同分：胚胎培养；器官培养；3组织培养；细胞培养；原生质体培养；2. 根据培养基态相不同分：固体培养；液体培养；3. 根据培养过程不同分：初代培养；继代培养；（三）植物组织培养历史植物组织培养是20 世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的。
有以下过程：思想准备阶段；理论奠基阶段；技术建立阶段；形态发生阶段；应用研究阶段；1902 年德国植物学家Haberlandt 提出了细胞全能性概念。
1939 年White 报道了烟草组培成功。
并提出植物细胞全能性学说。
同年，Gautheret 与Nobecourt 培养胡萝卜成功。
三人被誉为植物组培奠基人。
罗士韦是我国植物组织和细胞培养研究的开拓者和奠基人之一（四）植物组织培养的应用1•植物的快速繁殖：⑴园艺、花卉植物的大规模快速繁殖；⑵抢救濒危珍稀植物⑶进行某些植物的种质资源保存2•培育无病毒的植物，如脱病毒草莓等；3•制造人工种子。
4 突变体的筛选培育5 药用植物的工厂化生产6 花药培养和花粉单倍体育种7 基因工程的应用等二、实验室设计和设备（一）实验室设计一般具有：1. 准备室器皿洗涤，培养基配制、分装、高压灭菌，植物材料的预处理，重蒸馏水的制备以及进行生理、生化因素的分析等各种操作都要在此室中进行2. 缓冲室进入无菌室前需在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。
外植体采集,处理和灭菌的操作流程
外植体采集,处理和灭菌的操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!外植体采集、处理与灭菌的操作流程详解在植物组织培养中，外植体的采集、处理和灭菌是至关重要的步骤，它们直接影响到后续的培养效果和实验的成功率。
花卉组培技术
D、调整培养基的pH值。多数园林植物都要求pH5.5～6.5 的条件下进行组培。
E、培养基的分装：通常1L培养基分装13杯或33～35瓶。 不得沾染，及时加盖。
母液
称取
大量元素 微量元素 铁盐 有机物 生长调节物质
琼脂
蔗糖
加水混合、溶解
调节pH值
用1NHCl或NaOH
2、取材季节
组织培养选择材料时，要注意植物的生长季 节和植物的生长发育阶段。一般进行快速繁殖时 应在植株生长的最适时期取材，如选取茎尖。春 天刚抽的新芽，一是微生物侵染较少；二是外植 体的生理年龄小；三是接种后容易恢复生活力。 这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高， 携带细菌数量较少，在器官建成上也更为容易。 此外，嫩叶、花蕾等携菌量较少，容易形成愈伤 组织。
成分
微量元素
MnSO4·4H2O ZnSO4·4H2O
H3BO3 KI
Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O
MS mg/L 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025
B5 mg/L
10 2 3 0.75 0.25 0.025 0.025
N6 mg/L 4.4 1.5 1.6 0.8 —— —— ——
通过器官发生形成植株：通过培养的组织产生芽及根，使用 的器官材料有：茎尖产生芽，芽别离培养成植株；外植体产 生不定芽发育成植株。
愈伤组织分化成植株：将花卉的局部组织培养成愈伤组织， 再诱导分化成芽和根，形成植株。
胚状体发生形成植株：将培养产生的愈伤组织，通过悬浮培 养或直接产生胚状体，再发育成完整的植株
d、有机物母液〔配1L200倍的母
植物组织培养复习题(标准)
植物组织培养复习题一、填空题：1.植物脱病毒一般采用茎尖培养脱毒和热处理两种方法。
2.最典型的培养基是1962年发表的的一种适合于烟草愈伤组织快速生长的改良培养基，该培养基后来被称为MS培养基，现已广泛用于植物组织培养。
3.胚状体发育顺次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期。
4.具有防止褐变作用的维生素是Vc。
5.植物组织培养按培养对象分为愈伤组织培养、器官培养、胚培养、细胞和原生质体培养等几种类型。
6.在通过微茎尖培养脱毒时，外植体的大小应以成苗率和脱毒率综合确定，一般以0.3～0.5mm、带1～3个叶原基为好。
7.对植物组织培养的培养基灭菌时，一般情况采用的条件是121温度，保持时间是15～20分钟。
8.在幼胚培养基中，蔗糖的主要作用是维持渗透压、提供碳源和能源和防止幼胚早熟萌发。
9.植物组织培养中，微量元素铁的用量较大，由于在较高pH下，易形成Fe(OH)3沉淀，难以被吸收，所以多用硫酸亚铁（FeSO4·7H20）和乙二胺四乙酸（Na2-EDTA）形成的螯合物，并且单独配制。
10.种质保存大致分为原地保存和异地保寸两种方式。
11.外植体选择的原则是：选择优良的种质、选择健壮的植株、选择最适时期、选取适宜的大小。
12.细胞悬浮培养的方法有成批培养和连续培养等。
13.植物原生质体分离的方法有酶解法和机械法。
14.植板率是指已形成细胞团的单细胞与接种总细胞数的百分数。
15.花粉分离的方法有挤压法、磁搅拌法、漂浮释放法。
16.植物组织培养发展可分为三个时期：萌芽阶段、奠基阶段、快速发展和应用阶段。
17.一个年产4-20万株苗的商业性组织培养实验室，其总面积不应少于60平方米，可划分为准备室、缓冲室、无菌操作室和培养室。
18.盐酸硫胺素VB1是脱羧酶辅酶，吡哆醛VB6是转氨酶辅酶。
19.愈伤组织形成大致经历三个时期，即：诱导期、分裂期、分化期。
20.茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为茎尖分生组织组织培养和普通茎尖培养两种类型。
园艺植物组织培养
器官发生型(organogenesis type)：
▪ 诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培
养形成芽、根再生成植株的方式。 ▪ 技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早
期挑选，使其来源尽量一致。 ▪ 特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再
生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。
芦荟、烟草、油菜等
无菌母株制备
▪ 优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。
三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、 丝石竹等
原球茎型(protocorm type)
▪ 兰属特有的方式， 即外植体经培养产 生原球茎，再直接 长成植株。
▪ 原球茎：兰科植物组织培养中形成的一种 特殊的中间繁殖体，是呈珠粒状、由胚性 细胞组成、基部生假根、类似嫩茎的器官。 圆球茎可以增殖形成原球茎丛。
▪ 在试管内形成小鳞茎需较长时间
百合
郁金香
孢子型
▪ 用成熟或未成熟的孢子进行培养
▪ 孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时 间较长
▪ 地钱
狼尾蕨
根茎型
▪ 蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为 组织培养的最佳外植体。
▪ 根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢 子型快
▪ 肾蕨等
微枝扦插型
▪ 带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 ▪ 为木本植物进行快速繁殖的主要方式 ▪ 葡萄、杨树
合子胚与体胚比较
合 子 心 型 胚 正 在 萌 发 的 体 胚
针叶松体细胞胚及体胚萌发生长
花椰菜体胚发育的不同阶段
菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察
不定芽型（adventitious bud type)：
▪ 选取具有顶芽和腋芽的短枝 无菌培养，诱导芽萌发成苗 或增殖产生许多不定芽发育 成苗，将新萌生的枝条再转 接继代，重复芽到苗的增殖 过程，最后使其生根形成植 株的方式。
植物组织培养
植物组织培养重点名词解释：1、植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。
又称为植物离体培养2、外植体（explant）：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞。
3、愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。
4、离体生态学（in vitro ecology）：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件。
5、植物细胞全能性（totipotency）：是指任何携带完整遗传信息的植物活细胞都具有表达其所有遗传信息的能力，能够发育成完整的植株。
胞需经过脱分化和再分化过程才能表现其全能性。
6、脱分化（dedifferentiation）：成熟细胞或分化细胞转变为分生状态（即形成愈伤组织）的过程。
7、再分化（redifferentiation）：成熟细胞或分化细胞脱分化转变为愈伤组织后重新分化成异质细胞的过程。
8、植物茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养的技术。
9、茎尖培养（shoot tip culture or apical meristem culture）是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。
10、叶培养的意义：研究叶形态建成、光合作用、叶绿体形成等；叶细胞全能性；原生质体融合；无性繁殖系；诱变育种。
11、离体叶组织发育途径：直接产生不定芽，由愈伤组织产生不定芽，胚状体和其他。
12、植物器官培养是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。
13、植物胚胎培养是指对植物的胚、胚乳、胚珠和子房等进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。
包括：胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。
14、胚乳培养是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术15、胚珠培养是将胚珠从母体分离出来，无菌条件下让其进一步生长发育，使其形成植株的技术。
《植物组织培养技术》 知识清单
《植物组织培养技术》知识清单一、什么是植物组织培养技术植物组织培养技术是在无菌的条件下，将植物的离体器官、组织、细胞或原生质体等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，使其生长、分化并发育成完整植株的技术。
这一技术的核心在于利用植物细胞的全能性，即植物的每个细胞都具有发育成完整植株的潜在能力。
通过特定的培养条件和激素调控，诱导细胞分裂、分化和器官形成。
二、植物组织培养技术的发展历程植物组织培养技术的发展可以追溯到 20 世纪初。
早期的研究者们在探索植物细胞的生理特性时，偶然发现了植物细胞在适宜条件下能够再生出完整植株的现象。
在 20 世纪中叶，随着生物技术的不断进步，植物组织培养技术逐渐成熟。
科学家们能够更精确地控制培养条件，提高培养的成功率，并将其应用于植物的快速繁殖、品种改良等领域。
近年来，随着基因工程技术的发展，植物组织培养技术与基因工程相结合，为植物的遗传改良开辟了新的途径。
三、植物组织培养技术的基本步骤1、外植体的选择与消毒外植体是指用于培养的植物组织或器官。
常见的外植体包括茎尖、叶片、花药等。
在选择外植体时，要考虑其生理状态和来源，通常选择生长旺盛、无病虫害的部位。
选择好外植体后，需要进行严格的消毒处理，以去除表面的微生物，常用的消毒方法有酒精浸泡、次氯酸钠溶液消毒等。
2、培养基的配制培养基是植物组织培养的基础，为外植体提供生长所需的营养物质和激素。
培养基通常包含大量元素、微量元素、有机成分、植物生长调节剂等。
常用的培养基有 MS 培养基、White 培养基等。
在配制培养基时，要按照配方准确称量各种成分，并调节 pH 值至适宜范围。
3、接种将消毒后的外植体接种到培养基上，操作过程要在无菌环境中进行，以防止污染。
4、培养接种后的培养物需要放置在适宜的环境中进行培养。
培养条件包括温度、光照、湿度等。
温度一般在 25℃左右，光照强度和光照时间根据不同的植物和培养阶段进行调整，湿度通常保持在较高水平。
半夏块茎外植体的分离、接种和培养需要注意的点
半夏块茎外植体的分离、接种和培养需要注意的点一、分离1.选择健康的半夏块茎在分离外植体之前，需要选择外表无病斑，质地坚实，具有一定营养价值的半夏块茎作为外植体的来源。
只有健康的半夏块茎才能保证外植体的生长和培养成功。
2.消毒在分离外植体之前，需要对半夏块茎进行消毒处理，以避免外植体在分离过程中受到细菌和病毒的侵害。
常用的消毒方法包括漂白粉浸泡、酒精消毒等。
3.分离外植体将经过消毒处理的半夏块茎切割成小块，然后用无菌手术刀将外植体分离出来。
分离过程需要在无菌条件下进行，以保证外植体的无菌状态。
二、接种1.选择合适的培养基在接种外植体之前，需要选择合适的培养基进行培养。
培养基的选择应考虑外植体的生长需求，包括营养成分、pH值、激素等。
2.无菌操作在接种外植体的过程中，需要在无菌条件下进行，避免细菌和病毒的侵害。
使用无菌技术和无菌器具进行操作，确保外植体的无菌状态。
3.接种外植体将分离好的外植体放置在培养基上并轻轻压实，然后进行培养。
接种过程需要轻柔，避免外植体的损伤。
三、培养1.温度和光照在外植体培养的过程中，需要注意控制温度和光照条件。
根据外植体的生长需求，保持适宜的温度和光照条件，促进外植体的生长和分化。
2.营养外植体在培养的过程中需要充足的营养供应。
根据外植体的生长阶段和特点，调整培养基的营养成分，保证外植体的正常生长。
3.无菌管理在外植体培养的过程中，需要进行严格的无菌管理，避免细菌和病毒的侵害。
定期对培养器皿和培养环境进行消毒和无菌处理，确保外植体的无菌状态。
结语半夏块茎外植体的分离、接种和培养是一项复杂的过程，需要严格的无菌操作和专业的技术支持。
只有在合适的环境和条件下进行培养，才能保证外植体的正常生长和分化，最终获得高质量的植株。
希望以上的指导能帮助大家更好地进行半夏块茎外植体的分离、接种和培养工作。
半夏块茎是一种常见的中药材，对其外植体的分离、接种和培养过程进行合理的操作和管理，能够有效地提高外植体的存活率和快速生长，进而获得高质量的植株。
植物组织培养：第4章 外植体的选择、灭菌及培养
防细菌滤膜的网孔的直径为0.45μm以下，当溶液 通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直 径而被阻。
在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置； 液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤 膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射 器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出 的溶液就是无菌溶液。
由于在消毒后的环境里和物品上没有活着的微生物， 所以通过严格消毒灭菌的操作空间(接种室、超净台、 等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何 活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无 菌操作。
一 常用的灭菌方法 物理方法
化学方法
湿热灭菌(常压或高压蒸煮) 干热灭菌(烘烧和灼烧) 射线处理(紫外线、超声波、微波) 过滤除菌 大量无菌水冲洗
3. 叶片：由于叶片的来源最有保证，因而许多植物的组 织培养以叶片为起始培养物，如，玫瑰、海棠、矮牵 牛和豆瓣绿等许多植物。
4.子叶或下胚轴：对一些培养较困难的植物，则往往可 以通过其子叶或下胚轴来建立其组织培养体系。 若有可能，最好对培养较困难的植物各部位的诱导及 分化能力进行比较，从中筛选出最佳外植体。
甲醛(福尔马林)
过氧化氢 高锰酸钾 来苏儿 漂白粉 次氯酸钠 升汞(氯化汞) 酒精
（一）物理方法灭菌
1.湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）—培养基灭菌
培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌 的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢， 压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度 也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。 在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐 热的芽孢。
植物组织培养的基本技术与设施
（三）几种外植体的灭菌方法
1、茎尖、茎段及叶片等的消毒 ➢消毒前要经自来水较长时间的冲洗。 ➢消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗2～3次，然后用2%～ 10%的次氯酸钠溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中 加入几滴吐温-80，或者用0.1％～0.2％升汞浸泡消毒5～10分钟消毒 后，用无菌水冲洗3次后方可接种。
➢入无菌室前，要洗手。l%新洁尔灭溶液内5分钟 ➢入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 ➢操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准 讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把 工具在火焰上消毒。 ➢必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖 前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖 上。
（二） 外植体灭菌的一般步骤
1．预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将 准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材 料，其表面仍有很多细菌和真菌。
2．将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒 精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。
3. 将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活 化剂Tween20或Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖 上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须 把玻璃瓶摇动2～3次。 4．消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无 菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复3～4次。
行灭菌？ 5．离体培养的植物材料对光、温、湿度有何要求？
如何调控？ 6. 何谓玻璃化？何谓褐化？如何克服？
第二节 实验室的设计与设备
一、实验室设计
准备间、缓冲室、接种室、培养间 驯化室、温室
第三章 离体培养的操作方法
8
• 按状态分
固体培养基
培养材料与培养基接触不充分 有毒物质容易积累 污染局部 通气好
液体培养基
培养材料与培养基接触充分 有毒物质不容易积累 污染全部 通气不好
9
2、培养基的成分 、
无机盐 激素 有机物质 琼脂 碳源 大量元素 微量元素
10
2-1、大量元素 、
N、P、S、K、Ca、Mg 、 、 、 、 、
5
选择合适的大小
根据不同植物而异。太大容易污染，太小， 根据不同植物而异。太大容易污染，太小，多形 成愈伤组织，甚至难于成活。一般在0.5 1.0cm。 0.5成愈伤组织，甚至难于成活。一般在0.5-1.0cm。 如果是胚胎培养或脱毒的外植体，则更小。 如果是胚胎培养或脱毒的外植体，则更小。
选择外植体的时期
24
培养基配制过程
• 自制录相
25
三、无菌技术
培养基灭菌 器皿试材和接种工具的灭菌 培养室和接种室的灭菌
26
污染的情况
真菌污染长孢子 细菌污染长菌落
真菌污染长孢子
27
一、无菌室
培养室和接种室
室内灭菌可用 2%新洁尔敏擦洗 2%新洁尔敏擦洗 75%乙醇喷雾 75%乙醇喷雾 UV照射20分钟 UV照射20分钟 照射20
When stationery supports are needed gelling agent can be used. But please bvear in mind that gelling agent is not the only measure that works for stationery purpose. Others are filter paper, cotton, cheesecloth, vermiculite 16 and special membrane rafts within a liquid medium
植物组织培养资料
一、名词解释。
1、植物组织培养：植物的离体器官、组织或细胞在人工制备的培养基上进行无菌培养，并在人工控制的环境条件下，使其发育成完整植株的科学技术。
2、脱分化：指失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞即愈伤组织的现象。
3、再分化：愈伤组织形成不定芽或不定根或胚状体。
4、外植体：植物组织培养过程中从活体植株上切去下来的用于离体培养的一切材料。
5、愈伤组织：原本指植物在受伤后于其伤口表面形成的一团薄壁细胞。
在组培中，则指人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞。
6、器官发生：胚胎时期由胚层器官原基发育成器官的过程。
包括细胞分化和器官形成。
7、胚状体发生：在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一个或一些体细胞经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。
可进一步发育成植株。
8、细胞全能性：指植物的每一个细胞都携带有一完整的基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。
9、细胞分化：一个尚未特化的细胞发育出特征性结构和功能的过程。
10、极性：细胞内的一端与另一端在形态结构和生理生化上的差异。
11、试管苗：通过组织培养产生的植株。
12、看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。
这块愈伤组织被称为看护组织。
13、固相化培养：将细胞或原生质体固着在琼脂糖、藻（月元）酸盐或多聚赖氨酸中，然后将他们放入液体培养基中震荡培养。
这种培养方法既利用了振荡培养室营养物质和气体易于交换的优点，有利用了固相化使细胞免受振荡时剪切力的作用。
14、悬浮细胞培养：将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增值的技术。
适用于大规模的培养，使细胞工程的基本平台。
15、离体授粉：将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来,进行无菌培养,并以一定的方式授以无菌花粉,使之在试管内实现受精的技术,又称为离体受精或试管受精。
16、器官培养：指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。
外植体的选取原则
• 产生原因:是在某个环节消毒灭菌布彻底， 如:无菌水消毒布彻底，或操作中某种工具带菌， 违反操作规程、说话、咳嗽等都能引起杂菌感染。 • 因此，接外植体，进行无菌操作前工作人员一定 要注意自身卫生，最好戴帽子和口罩操作。
②真菌污染
• 病症：首先在有真菌孢子存在的地方产生白色的 菌丝，经常可以在外植体和培养基表面看到。特 别是夏季阴雨天，空气湿度大，周围环境不清洁， 含孢子量较多，甚至棉花塞上也落上了孢子。
外植体取材方法--确定大小
取大小适中的茎段、芽体进行清洗、灭菌，大了容易污染，小了不项
1．采样 2．洗涤 3．表面灭菌 4．分割（外植体切割） 5．接种
1．采样
• 在采样前除应预先制备好用于接种的培养 基外，还应携带刀、剪、广口瓶、塑料袋、 采集箱（袋）等， • 到田间或盆栽植物中选取洁净、无病虫伤 害的健壮植株。剪取比较幼嫩，生长能力 较强的部位，但又不能太嫩，
组织培养中降低污染率是工厂化生产 中不可忽视的技术环节 1、防止材料带菌 2、防止用具带菌 3、操作室要处于无菌状态 4、操作人员要按照操作程序进行
对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已 基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗 的重要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎 段可解决培养材料不足的困难。
常用的外植体种类： ①茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发 生遗传变异，但取材有限） ②茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） ③叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株， 取材容易，操作方便，但易发生变异）； ④花球和花蕾 ⑤种子、根、块根、块茎、花瓣、胚等。
外植体取材方法--清洗
剪切好一定大小的外植体，在灭菌前要充分浸泡、冲洗，尽量降低 均量。
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（5）外植体要易于消毒
在选择外植体时，应尽量选择带杂菌少的器官或组织，降低初代培养时的污染率。一般地上组织比地下组织消毒容易，一年生组织比多年生组织消毒容易，幼嫩组织比老龄和受伤组织消毒容易。
（3）选取适宜的大小
培养材料的大小根据植物种类、器官和目的来确定。通常情况下，快速繁殖时叶片、花瓣等面积为5mm2，其他培养材料的大小为0.5~1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。材料太大，不易彻底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。
（4）外植体来源要丰富
灭菌
①茎尖、茎段及叶片等的消毒
消毒前先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，然后用自来水冲洗。对于一些表面不光滑或长有绒毛的材料，可用洗涤剂清洗，必要时用毛刷充分刷洗，硬质材料可用刀刮。
消毒时在超净台上操作，先用70%酒精浸泡10~30s，以无菌水冲洗2~3次，然后按材料的老、嫩和枝条的坚实程度，分别采用2%次氯酸钠浸泡10~15min或用0.1%升汞浸5~10min。消毒时要不断搅动，使植物材料与消毒剂充分地接触。若材料有绒毛，最好在消毒液中加入几滴Tween-20，最后用无菌水冲洗3~5次。
在操作时要根据材料的大小、幼嫩、质地等差异做出判断后，再选择适宜的消毒剂种类大限度地杀死材料上的微生物，而又对材料的损伤最小为好。
③花药的消毒
用于组织培养的花药多未成熟，其外面有花萼、花瓣或颖片保护，处于无菌状态。消毒时将整个花蕾或幼穗用70%酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗2~3次，再在漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗2~3次。
④根及底下部器官的消毒
由于这类材料生长于土壤中，表面带菌量大，消毒较为困难。可先用自来水冲洗，软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1%升汞中浸5~10min或2%次氯酸钠中浸10~15min，最后用无菌水冲洗3次。
（2）选择适当的时期
组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。叶子花的腋芽培养，如果在1月至翌年2月间采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3-8月间采集，萌发的数目多，萌发速度快。
植物体的各个部位(从低等的藻类到苔藓、蕨类、种子植物等高等植物的各类、各部分都可采用作为组织培养的材料，一般裸子植物多采用幼苗、芽、韧皮部细胞，被子植物采用胚、胚乳、子叶、幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药、花粉、子房和胚珠等各个部分。)
※生长开始的季节采样：较幼嫩的材料
※器官的生理状态和发肓年龄
※外植体的大小为0.5－1.0cm
（1）选择优良的种质及母株
无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。
②果实及种子的消毒
先用自来水冲洗10~20min，再用酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠浸10min，后用无菌水冲洗2~3次。种子则先用10%次氯酸钠浸泡20~30min，难以消毒的可用0.1%升汞消毒5~10min。对于种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4%次氯酸钠浸泡8~10min。