核酸化学实验技术

课后研讨题

6.结合本次实验，说明PCR技术的主要用途和发展。 7.通过本次实验，谈谈你对转基因食品安全性的认识。 8.查阅资料，比较转基因食品检测的主要方法的优缺点。 9.查阅资料，综述常用的物种分子鉴定技术。

10.案例分析：在美国海豹突击队击毙本拉登几个小时后， 美国总统奥巴马向全世界宣布拉登已被成功击毙，死者 确定为本拉登的可能性是99.9%。查阅资料，根据所学 核酸分子鉴定技术，分析如何对其进行法医鉴定。

SDS：真核生物的DNA与组蛋白结合形成DNP，SDS能够破坏DNA与蛋白
质之间的静电引力或配位键，可使DNA与蛋白质解聚，释放出DNA。

CTAB：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物， 在高盐溶液（NaCl>0.7M）中是可溶的，当NaCl降低到0.3M 时，可沉
淀CTAB-核酸复合物。

[2]燕勇,朱心强,朱武通等. rDNA-ITS序列分析鉴定1例念珠菌性甲真菌病病原
[J]. 临床检验杂志.2009, 27(5):373-375. [3]王华民, Hong Guo,王英等.应用rDNA ITS测序检测海南岛条件致病性真 菌[J].海南医学院学报.2008, 14(1):1-5.
载体的构建
标记基因
启动子
外源目的基因
终止序列
转基因食品的核酸检测技术

检测对象：转基因的启动子、终止子、抗性筛选基 因、目的基因等外源基因 检测方法：普通定性PCR、实时荧光定量PCR、基 因芯片 其中以普通定性PCR、实时荧光定量PCR最常用。


核酸定性PCR法检测转基因食品
核酸定性PCR法检测转基因食品 一般步骤
相关事项

实验习惯 ——药品配制与保存
小组上交材料 材料名称 实验设计方案 实验记录 实验论文 课后研讨题 汇报ppt 份数 1 1 2 2 1 分值 15% 10% 50% 10% 15%

实验记录
实验交流 实验论文
论文格式模板
研讨课要求

以大组为单位课后总结结果，讨论，制作一份 ppt，课内讨论汇报。 ppt内容包括：实验背景和目的，实验主要原 理，实验条件的选择，各小组实验结果和分析， 课后研讨题，实验体会等。
全班分成4大组，各选一个题目。 每个大组3个小组，2名同学一个小组。 以大组为单位进行实验准备和讨论。 以小组为单位进行实验设计和操作。
实验目标

学习从各种材料（动物、植物组织、微生物）中提取 和纯化DNA的原理和操作技术。

学习水平式琼脂糖凝胶电泳及紫外检测，确定DNA的纯 度、含量与分子大小。

问题：如何准确鉴定其种属 ？
生物遗传物质携带了物种的特异信息，在属种间具有 高度的保守性。因此，可应用分子生物学鉴定手段对真菌 进行种类鉴定和系统分类。

真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S、5S、 18S和5.8S rDNA 4种，在染色体上头尾相连，串联排列， 相互间由间隔区分隔。 18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元（图1）， 三者高度保守，适合较高等级水平生物群体间的系统分 析。 其间的间隔区为内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS），包括ITS1和ITS2，进化相对迅速，具 有多态性，适合较低等级水平的系统学研究。
基于rDNA-ITS序列在真菌分子鉴定中的应用，你如何 获得高质量的基因组DNA并鉴定菌株的目的基因序列？
真菌rDNA-ITS通用引物
表1 真菌rDNA-ITS通用扩增引物
Primer
ITS1 ITS2
Sequence（5’- 3’）
TCCGTAGGTGAACCTGCGG GCTGCGTTCTTCATCGATGC


[4]赵颖茹, 苟小军, 颜军.两株银杉根际土壤真菌的分离与分子鉴定[J].成都大 学学报(自然科学版).2005,28(2):94-97.
[5]张志华, 康应田.海洋真菌分类鉴定方法探析[J].安徽农业科学. 2009, 37 (21) : 9825-9826. [6]赵有玺, 饶志明,王正祥等.转基因食品的快速PCR鉴定[J].无锡轻工大学学 报.2004,23(6):6-8. [7]赵艳.转基因稻米加工食品的PCR检测技术研究[J].中国粮油学报.2006,21 (3):198-201. [8]中华人民共和国国家标准GBT 19495.(1-8)-2004转基因产品的检测
学习PCR的基本原理和操作方法。 掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪、PCR 仪等仪器设备的使用。

实验设计需包含的主要技术内容

基因组DNA提取：可选用浓盐法、阴离子去污剂法、 苯酚抽提法、水抽提法、试剂盒法等 DNA含量测定：可选用二苯胺法、紫外分光光度法等 DNA纯度测定：紫外分光光度法 DNA分子大小测定：琼脂糖凝胶电泳 PCR技术
《生化实验技术与应用》
主讲教师：钱国英 浙江万里学院 生物科学系
实验课程内容体系

第一讲 核酸化学实验技术


第二讲 蛋白质化学实验技术
第三讲 酶学实验技术
第四讲 糖类化学实验技术
第五讲 脂类化学实验技术
第六讲 维生素和辅酶化学实验技术
实验实施流程
课堂理论学习：辅导生化大分子基本性质、提取、分 离纯化及含量纯度测定相关的基础知识
2.蛋白质的去除

苯酚-氯仿-异戊醇：苯酚、氯仿能变性蛋白质，离心分层，DNA溶于
上层水相，变性蛋白质位于水相和有机相之间。异戊醇可减少抽提过
程的泡沫产生。
核酸分离纯化
RNA的去除

用不含DNA酶的RNase处理，使RNA降解。 添加RNase处理后，可再用等量的苯酚/氯仿抽提， 离心除去蛋白质及寡核苷酸。
实验项目与任务布置 实验题目：
基因组DNA的提取与PCR鉴定
实验设计要求：
根据案例提交一个具体解决基因组提取及分离鉴定的实 验设计方案，包括从提供的不同材料中提取、分离得到基 因组DNA，测定所得DNA的含量、纯度及分子大小，并 利用已知引物进行PCR扩增，分析PCR检测的结果。
分组题目

项目1：定性PCR法检测转基因食品 项目2：rDNA-ITS扩增法鉴定真菌种类
合。
二、分离纯化核酸的总原则

保持基因组DNA结构相对完整：防止各种因素引
起的降解。

纯度高：尽量排除其他大分子成分的污染（蛋白 质、多糖和RNA等）。 得率好：选用合适的方法获得足够量的DNA。

三、基因组DNA提取的原理和方法
准备适宜的材料 裂解细胞，释放DNA 核酸分离纯化 沉淀并吸附核酸 核酸溶解（缓冲液）

理论介绍
一、内容提要

基因组是指细胞内遗传信息的携带者DNA的总体。 为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不 同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物体内的 分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。

从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度
也不同。真核生物的DNA主要存在于细胞核中，与蛋白 质结合构成染色体，原核生物的DNA不与任何蛋白质结

转基因食品：以转基因生物为直接食品或为原料加工 生产的食品。 转基因食品利用现代分子生物技术，将某些生物的基 因转移到其他物种中去，改造生物的遗传物质，使其 在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的 目标转变。

转基因育种的程序？
目前，世界各国对转 基因食品的检测主要 从外源DNA和蛋白质 两种生物大分子入手
课程内容 学时
2
综合训练内容
实验教学模式介绍，案例引导， 项目内容发布，实验设计要求， DNA提取与鉴定技术理论介绍
基因组DNA提取
理论辅导与实验 设计
16 实验1 基因组DNA的提 取与PCR鉴定
DNA含量和纯度测定
DNA琼脂糖凝胶电泳 PCR及产物检测
课堂研讨
2
实验过程总结，实验成果、创新 技术分享，教师点评和总结



基因组DNA提取注意事项

使用新鲜、幼嫩的材料；材料应适量，过少造成核酸提取 量少，过多影响裂解，导致DNA量少。（推荐0.2-5g）。 简化操作步骤，缩短提取过程，避免物理、化学和生物的 因素对核酸的降解，如机械剪切力、高温和DNase等酶， 防止过酸、过碱，避免剧烈振荡和混合。 采用酚-氯仿抽提时应采用上下颠倒的方法充分混匀，但 动作要轻柔，离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。 沉淀DNA用的异戊醇、乙醇事先放入-20℃冰箱，待用时取 出。

样品基因组DNA的提取


DNA提取质量检测
特有序列的PCR
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
进一步验证：测序、PCR产物酶切鉴定、实时荧 光定量PCR方法等
案例2

某实验人员从土壤中分离筛选出一株产植酸酶的菌株， 经形态学和生理生化特性初步鉴定为真菌。
真菌种类繁多，地球上大约存在150万种真菌，已经被 发现和运用的大约有69000种。
沉淀并吸附核酸

含DNA的水相可用1倍体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇 沉淀。
基因组的大分子DNA沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用 吸头将其挑出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附在壁 上及底部。 如果DNA沉淀量少或无法捞出，可离心获取沉淀。 沉淀DNA前，为提高沉淀效果，可加入NaAC、乙酸铵等盐 类促进沉淀。 获取的沉淀需再用70%乙醇洗涤除去残留的有机物、无机 盐等。

实验结果要求

各标准曲线
基因组DNA产品得率（mg/100g)
基因组DNA产品纯度 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 PCR产物分子大小（bp）
检测结论
推荐的参考资料

[1]钱国英,斯越秀,汪财生等. 生化实验技术与实施教程[M].杭州：浙江大学出 版社.2009.
第一节 实验项目发布与设计方案评价
案例1

目前，人们的生活中充斥了越来越多的转基因产品， 如转基因大豆、转基因棉花、转基因玉米、马铃薯、 水稻等等。 转基因作为一种新兴的生物技术手段，它的不成熟和 不确定性，使得转基因食品的安全性成为人们关注的 焦点。

问题：如何检测转基因食品？
什么是转基因食品？
项目内容发布：通过案例引导的方式发布实验项目内 容、实验设计和实施要求 实验设计：分组——查阅资料——设计实验方案—— 网上递交——教师修改及审核 实验准备与实验操作：以大组为Βιβλιοθήκη Baidu位进行实验试剂 器材的准备，以小组为单位完成实验操作 实验论文＋课堂讨论：以大组为单位进行ppt汇报
第一讲 核酸化学实验技术




实验时间安排

基因组DNA提取
4学时
DNA的含量与纯度测定
DNA的琼脂糖凝胶电泳 PCR及产物检测
4学时
4学时
4学时
课后研讨题

1.DNA提取的方法主要有哪些？并说明各方法的原理。

2.结合本人实验操作的体会，试述在提取过程中应如何 避免大分子DNA的降解和断裂？
3.查阅资料，说明提取的基因组DNA有哪些方面的用途？ 4.查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应用和发 展。 5.琼脂糖凝胶电泳所用DNA染料EB具有潜在的致癌性， 查阅资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。
去除蛋白质、 RNA等杂质
细胞破碎

化学法、机械法、生物法
细菌—溶菌酶（降解细胞壁），EDTA（抑制DNA 酶，防止DNA降解），去垢剂SDS（破坏细胞膜） 酵母—破壁酶或液氮研磨


植物材料—液氮研磨（使细胞冻结，用研钵碾制 成粉状） 动物组织—匀浆或液氮研磨

核酸分离纯化
DNA与蛋白质的分离 1.DNP中DNA与蛋白质的分离
Length(bp)
19 20
ITS3
ITS4
GCATCGATGAAGAACGCAGC
TCCTCCGCTTATTGATATGC
20
20
ITS1 primer
ITS2 primer
5
18S rDNA
ITS1
5.8S rDNA
ITS2 ITS3 primer
28S rDNA
ITS4 primer
3
图1 真菌rDNA转录区和相关引物
ITS1 primer ITS2 primer


5
18S rDNA
ITS1
5.8S rDNA
ITS2 ITS3 primer
28S rDNA
ITS4 primer
3
图1 真菌rDNA转录区和相关引物

设计特定引物对该真菌菌株中的基因组中的rDNA 转录区的特定核苷酸片段进行PCR扩增，通过对所 获得的PCR产物进行测序分析，与已知真菌序列比 对即可确定该菌株在系统分类学上的位置。