核酸化学实验技术
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取核酸（DNA 或 RNA）的基本原理和方法。
2、学习使用各种试剂和仪器进行核酸提取的操作步骤。
3、了解核酸鉴定的常用方法及其原理。
4、培养实验操作技能和科学研究的严谨态度。
二、实验原理核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是生物体遗传信息的携带者。
核酸提取的基本原理是利用细胞裂解液将细胞破碎，使核酸释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法将核酸与其他细胞成分分离，最后得到纯度较高的核酸样品。
DNA 提取常用的方法有酚氯仿抽提法、盐析法等。
酚氯仿抽提法是利用酚和氯仿的混合液去除蛋白质，然后通过乙醇沉淀得到 DNA。
盐析法是利用高浓度的盐使蛋白质变性沉淀，从而分离出 DNA。
RNA 提取常用的方法有异硫氰酸胍法、Trizol 法等。
Trizol 法是基于异硫氰酸胍和酚的作用，能够有效地裂解细胞并抑制 RNA 酶的活性，从而提取出完整的 RNA。
核酸鉴定的方法主要有紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法等。
紫外分光光度法通过测定核酸在 260nm 和 280nm 处的吸光度值（A260 和 A280）来评估核酸的纯度和浓度。
A260/A280 的比值在 18 20 之间表示 DNA 纯度较高，在 19 21 之间表示 RNA 纯度较高。
琼脂糖凝胶电泳法则是根据核酸分子在电场中的迁移率不同来分离和鉴定核酸，DNA 分子在琼脂糖凝胶中迁移距离与分子量大小成反比，RNA 通常会呈现出 28S、18S 和 5S 三条带。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉等）或培养的细胞。
大肠杆菌菌液。
2、实验试剂细胞裂解液（含蛋白酶 K）。
酚氯仿混合液（酚：氯仿＝ 1:1）。
无水乙醇、75%乙醇。
3M 醋酸钠（pH 52）。
Trizol 试剂。
异丙醇。
RNA 酶抑制剂。
琼脂糖。
50×TAE 电泳缓冲液。
核酸染料（如 EB 或 GelRed）。
11 生物化学实验--核酸的定性分析
核酸的定性分析【目的】1 ．掌握测定核酸的组成从而定性分析 DNA 或 RNA 的方法。
2 ．熟悉测定核酸的组成从而定性分析 DNA 或 RNA 的原理。
【原理】RNA 和 DNA 均可被硫酸水解生成含氮碱（嘌呤碱与嘧啶碱）、戊糖（ RNA 中的核糖与 DNA 中的脱氧核糖）和磷酸。
水解产物可用下列方法鉴定。
1 ．嘌呤碱的鉴定原理嘌呤碱在弱碱性环境中能与硝酸银作用形成嘌呤银化合物。
初为乳白色，稍放久为浅灰褐色絮状物。
2 ．核糖的鉴定原理核糖经浓盐酸或浓硫酸作用，脱水生成糠醛，后者能与 3 ， 5- 二羟甲苯缩合形成鲜绿色化合物。
该反应需三氯化铁作为催化剂。
3 ．脱氧核糖的鉴定原理脱氧核糖在浓酸中脱水生成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与二苯胺作用生成蓝色化合物。
4 ．磷酸的鉴定原理定磷试剂中的钼酸铵在酸性环境中以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸。
后者在还原剂氨基萘酚磺酸作用下形成蓝色的钼蓝。
【器材】1 ．试管与滴管2 ． PH 试纸3 ．沸水浴4 ．带有长玻璃管的胶塞【试剂】1 ． 5% 硫酸2 ． 5% 硝酸银溶液3 ．浓氨水4 ． 3,5- 二羟甲苯试剂取FeCl 3 ·6H 2 O 1.0g 溶于 6ml 水中，加浓盐酸 100ml ，混匀，此为 A 液。
另配制 6%3,5- 二羟甲苯乙醇溶液为 B 液。
临用时用 A 液 100ml 加 B 液3.5ml 混合即可。
5 ．二苯胺试剂取二苯胺 1.0g 溶于 100ml 冰乙酸中，加浓硫酸 2.75ml 。
此二苯胺试剂遇光易变绿色，故临用前配制，贮于棕色瓶中，置冰箱保存。
6 ．钼酸试剂取钼酸铵 2.5g 溶于 20ml 水中，加浓硫酸（A·R ） 8.5ml, 冷却后再加水至100ml ，放冷处可保存 4 周左右。
7 ．氨基萘酚磺酸溶液取 15% 亚硫酸氢钠溶液 195ml 与 20% 亚硫酸钠溶液 5ml 混合，加氨基萘酚磺酸 0.5g ，在热水浴中搅拌使固体溶解（如不全溶，可滴加 20% 亚硫酸钠数滴，至多不超过 1ml 即可）。
《生物化学实验》教学课件—22 核酸的定量测定-定糖法
核酸的定量测定—— 定糖法（地衣酚法）
实验类型： 验证性 教学时数：3
一、实验目的
学习和掌握测定RNA含量的定糖法（地 衣酚法）的原理和操作技术
生物化学实验技术
二、实验原理
核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解， 形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3,5-二羟 基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用 三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在 670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~200 μg/mL范围内，吸光度与RNA的浓度成正比关 系。
生物化学实验技术
地衣酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核 糖，不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各 不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种 RNA的含量存在误差。最好用被测样品相同来 源的纯化RNA作RNA-核糖标准曲线，然后从 曲线求得被测样品的RNA含量。
生物化学实验技术
三、仪器与试剂
1、仪器：试管及管架 、水浴锅 、移液管、 可见光分光光度计。 2、试剂：RNA标准溶液，RNA样品溶液， 0.1%地衣酚试剂。
时的取样毫升数，求得有机磷的质量浓度（μg/mL）。 按下式计算样品中核酸的质量分数：
CV × 11 W = m × 100%
W：核酸的质量分数（％）； C：有机磷的质量浓度（μg/mL）； V：样品总体积（mL）； 11：因核酸中含磷量为9％左右，1μg磷相当于11μg核酸； M：样品质量（μg）。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
×
100%
生物化学实验技术
3、无机磷的测定 吸取样液（2mg/mL）1.0mL，置于
100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取 3.0mL置试管中，加定磷试剂3.0mL，45℃水 浴中保温10min，测A660nm。
核酸的提取与鉴定实验报告
核酸的提取与鉴定实验报告
实验报告：核酸的提取与鉴定
I. 实验目的：
通过实验学习核酸提取和鉴定的步骤，掌握核酸提取实验技能，初步了解PCR技术及其在分子生物学中的应用。
II. 实验原理：
DNA分子在水性条件下具有极强的极性，由此，在化学性质上只要是极性且亲水性的溶剂都能迅速膨胀和破裂DNA分子的双链
结构，并溶解其中的碱基、核苷酸、脱氧糖等。
利用这一原理，
我们可以用溶液来提取含有核酸的样品，然后通过紫外吸光度计
检测该提取物中核酸的含量。
此外，PCR技术是一种被广泛运用
于DNA扩增的技术，其主要原理是通过DNA聚合酶扩增DNA
的特定片段。
III. 实验步骤及结果：
1. 核酸提取：将实验样品加入细胞破解液并混匀，离心后取上
清液，加入等体积的异丙醇，轻轻振荡混合并离心15分钟，然后
弃上清液，加入70%无水乙醇并离心，倒掉液体后用氧气吹干。
最终的核酸提取物的溶解液浑浊且无法肉眼辨认样品。
2. 核酸鉴定：将已经提取的样品分别用紫外吸光度计测量其光密度，结果表明与对照的D.W相比，样品中的核酸具有极高的光密度值，证明核酸提取步骤成功，核酸鉴定实验成功。
IV. 结论：
通过本次实验，我们成功地提取了样品中的核酸，并对提取后的核酸进行了鉴定，证明提取物中含有大量的核酸，表明核酸提取和鉴定实验成功，也为分子生物学的研究提供了基础。
测定核酸含量实验报告
一、实验目的1. 掌握定磷法测定核酸含量的原理与方法。
2. 学习核酸提取、纯化及定量测定的基本操作。
3. 了解实验数据的处理与分析方法。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，由核苷酸单元组成。
本实验采用定磷法测定核酸含量，其原理如下：1. 核酸分子中含有一定比例的磷，RNA中含磷量为10%，DNA中含磷量为8%。
2. 用强酸将核酸分子中的有机磷消化成为无机磷，使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵。
3. 在还原剂存在的情况下，Mo6+被还原成Mo4+，与试剂中的其他MoO42-结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8，形成蓝色化合物，称为钼蓝。
4. 在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可通过比色法测定核酸含量。
三、实验器材与试剂1. 实验器材：- 粗核酸- 克氏烧瓶（50ml）- 小漏斗（4cm）- 容量瓶（100ml、50ml）- 吸管- 试管（X18cm）- 722型或XX型分光光度计- 电炉- 水浴锅2. 实验试剂：- 标准磷溶液：将磷酸二氢钾于100℃烘至恒重，准确称取溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，加入5ml 5mol/L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液每毫升含磷400μg。
临用时准确稀释20倍。
- 定磷试剂：17%硫酸：17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中。
2%钼酸铵溶液。
四、实验步骤1. 核酸提取：取一定量的粗核酸，加入适量的水，用玻璃棒搅拌，使核酸充分溶解。
然后加入一定量的强酸，使核酸分子中的有机磷消化成为无机磷。
2. 核酸纯化：将消化后的核酸溶液通过离心、沉淀等方法进行纯化。
3. 核酸定量测定：a. 准备标准曲线：取一定量的标准磷溶液，分别加入定磷试剂，制备标准曲线。
b. 样品测定：取一定量的纯化后的核酸溶液，加入定磷试剂，制备样品溶液。
在分光光度计上测定样品溶液的吸光度，通过标准曲线计算出样品中核酸含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的绘制：根据标准磷溶液的浓度和吸光度，绘制标准曲线。
化学实验知识：核酸纯化技术在生物实验中的应用和操作技巧
化学实验知识：“核酸纯化技术在生物实验中的应用和操作技巧”本文将介绍核酸纯化技术在生物实验中的应用和操作技巧。
核酸是生命体中重要的分子，包括DNA和RNA两种类型。
在生物实验中，我们常常需要对这些核酸进行纯化才能获得高质量的样品。
核酸纯化技术可以通过去除杂质、消除分子间的相互作用以及提高产品纯度等方式来大大提高核酸样品的纯度和质量。
接下来将详细介绍核酸纯化技术的应用和操作技巧。
一、核酸纯化技术的应用1、PCRPCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的核酸扩增技术，PCR需要一定的模板DNA，普遍的杂质和缺陷可能导致PCR扩增效率低下或失败，因此核酸纯化在PCR前处理样品非常重要。
无论是从细胞，细菌或者病毒含量多的全血情况下，核酸纯化技术都是重要的前沿扩增技术。
一些PCR前处理的核酸纯化技术是基于锂离子、硅胶或磨砂等工艺的，这些工艺有效地移除了一些影响PCR扩增的杂质。
2、基因测序基因测序是分析基因身上的核苷酸序列的方法，可以用来探寻DNA 中的变异、突变以及基因水平的异质性。
基因测序需要高质量的DNA 样品，而核酸纯化技术可以大大提高DNA样品的质量。
此外，核酸纯化技术中常用的钨酸盐沉淀方法可有效去除重金属离子、盐类等自然成分对DNA测序的影响，同时也可以去除样品中的RNA，提高测序的准确度。
3、基因表达研究在基因表达研究中，核酸纯化可以有效减少与采集样品相关的污染，从而获得高质量，可靠的数据结果。
此外，核酸纯化也可以分离出单基因的DNA或RNA样品，从而获得与某一特定条件有关的表达水平。
这对于研究生物学和医学领域的基因表达调控非常有帮助。
二、核酸纯化操作技巧1、样品处理样品处理是核酸纯化的一个重要步骤。
在样品处理时需要处理完整的细胞、组织或其他核酸来源（如血浆、血清、尿液等），尽量减少不必要的杂质和其他干扰物，避免样品的污染和交叉污染。
处理样品时应遵循标准化的操作流程，确保样品处理的一致性和可靠性。
常见的生物化学实验方法
常见的生物化学实验方法生物化学实验是研究生物分子结构、功能和相互作用的重要手段，广泛应用于生物医学研究、药物开发和环境保护等领域。
本文将介绍一些常见的生物化学实验方法。
一、色谱技术色谱技术是一种分离和分析物质的方法，根据分子的化学性质和大小差异，将混合物分离成各个组分。
常见的色谱技术包括气相色谱（GC）、液相色谱（LC）和薄层色谱（TLC）等。
在生物化学实验中，色谱技术常用于对生物样品中的分子进行纯化和分析。
例如，气相色谱可用于分析氨基酸和脂肪酸等小分子化合物，液相色谱则可以用于分离蛋白质、核酸和多糖等生物大分子。
二、电泳技术电泳技术是利用电场作用下物质的电荷和大小差异，将混合物分离成各个组分的方法。
常见的电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和凝胶过滤电泳等。
在生物化学实验中，电泳技术常用于分离和检测蛋白质和核酸等生物大分子。
例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分离和测定蛋白质分子量，SDS-PAGE则可以用于检测蛋白质的纯度。
三、质谱技术质谱技术是利用质量分析仪器对物质的质量和结构进行分析的方法。
常见的质谱技术包括质谱仪、飞行时间质谱（TOF-MS）和液相色谱质谱联用（LC-MS）等。
在生物化学实验中，质谱技术常用于鉴定和定量生物分子。
例如，利用质谱仪可以对蛋白质进行鉴定，通过测定样品中蛋白质的质量和碎片离子的质量谱图，确定蛋白质的氨基酸序列。
四、核酸杂交技术核酸杂交技术是利用互补的DNA或RNA序列进行结合，从而检测目标序列的方法。
常见的核酸杂交技术包括Southern blot、Northernblot和in situ hybridization等。
在生物化学实验中，核酸杂交技术常用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在。
例如，Southern blot可用于检测DNA片段在基因组中的分布和拷贝数，Northern blot则可用于检测特定mRNA的表达水平。
12 生物化学实验--核酸的定量分析
核酸的定量分析【目的】1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的方法。
2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。
【原理】核酸分子中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之一即可推算出核酸含量。
1 ．定糖法通过测定 DNA 或 RNA 分子中戊糖的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
RNA 在强酸环境中加热可水解产生核糖。
核糖在浓酸作用下脱水形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - 二羟基甲苯（地衣酚）缩合成绿色化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最大吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进行比色即可测定出 RNA 的含量。
DNA 在强酸环境中加热水解生成的脱氧核糖与浓酸共热脱水生成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与能与二苯胺反应生成蓝色化合物（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进行比色即可测定出DNA 的含量。
2 ．定磷法通过测定核酸中磷的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。
用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，立即被还原为蓝色的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为660nm 。
当无机磷浓度在 2.5~25μg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正比。
本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中无机磷的含量，将测得的总磷量减去原无机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进而计算核酸的含量。
3 ．紫外吸收法核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最大吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。
核酸提取方法三种
核酸提取方法三种核酸（DNA或RNA）的提取是生物学和分子生物学研究中的一项重要技术。
这些提取方法可分为化学法、机械法和磁珠法三种。
1. 化学法：化学法是最常用的核酸提取方法之一，其基本原理是通过化学试剂破坏细胞膜和核膜，使得核酸被释放出来。
常用的化学试剂包括胰蛋白酶、SDS、EDTA、蛋白酶K等。
首先，组织样品需经过细胞破碎，方法可以是机械破碎或液氮冲击。
接下来，将样品中的蛋白质通过蛋白酶处理，以去除干扰。
然后，加入一定的试剂将DNA 或RNA稳定起来，并用氯仿醇萃取法或硅胶柱纯化法来分离核酸。
最后，用适当的缓冲液溶解核酸，使其适合后续实验使用。
2. 机械法：机械法适用于提取植物细胞原生质体中的DNA或RNA。
它的基本原理是通过物理力量破碎细胞壁和细胞膜，释放细胞质中的核酸。
机械法提取核酸的方法有刀切法、研磨法和玻璃珠破碎法等。
在刀切法中，样品被切成细小片段，然后用块状试剂研磨，最后用缓冲液洗净，使核酸溶解。
研磨法和玻璃珠破碎法则通过高速旋转或震荡的方法，利用玻璃珠等硬质物体对样品进行破碎。
3. 磁珠法：磁珠法是一种快速高效的核酸提取方法。
它利用表面修饰的磁性珠，通过磁场的作用来实现核酸的捕获、纯化和洗脱。
这种方法常用于自动化的核酸提取设备中，并通过磁力分离技术简化了传统柱层析法的操作步骤。
在磁珠法中，首先制备表面修饰的磁性珠，以使其能够选择性结合DNA或RNA。
然后，将样品与磁珠混合，使核酸与磁珠结合。
通过磁场的引导和离心沉降，磁珠与被结合的核酸被分离出来。
最后，通过洗脱步骤，将核酸从磁珠上解离，使其溶解在适当的缓冲液中。
总结：核酸提取是分子生物学研究中至关重要的一步，能够从组织样品中提取出纯度较高的DNA或RNA。
化学法、机械法和磁珠法是常用的核酸提取方法。
化学法利用试剂破坏细胞和核膜，使核酸被释放出来；机械法通过物理力量破碎细胞壁和细胞膜，释放细胞质中的核酸；磁珠法则利用表面修饰的磁性珠来捕获、纯化和洗脱核酸。
核酸纯化的基本原理
核酸纯化的基本原理导言核酸纯化是分子生物学和生物化学实验中常见的一个步骤。
通过纯化核酸样品，可以去除杂质和其他分子，从而得到高纯度的核酸。
本文将深入探讨核酸纯化的基本原理，包括纯化方法、常用纯化试剂和步骤。
核酸纯化方法核酸纯化方法主要可以分为两大类：固相法和溶液相法。
固相法1. 硅胶柱层析硅胶柱层析法是最常见的核酸纯化方法之一。
其基本原理是利用硅胶对核酸具有选择性吸附的特性，将核酸样品与硅胶柱共同处理，以实现去除杂质、富集核酸的目的。
步骤如下：1.制备硅胶柱：将硅胶填充到柱子中，并经过紫外灭菌处理。
2.样品处理：将待纯化的核酸样品与缓冲液混合，加入硅胶柱中。
3.洗脱：通过加入洗脱缓冲液使核酸从硅胶柱中洗脱出来。
硅胶柱层析法适用于小规模实验室中对核酸的纯化，能够得到较高的纯度，但对核酸的损失较大。
2. 磁珠法磁珠法是一种基于磁珠颗粒表面的亲和性分离纯化核酸的方法。
通过表面修饰磁珠上的配体，可选择性地吸附纯化目标核酸。
步骤如下：1.磁珠上的配体修饰：将磁珠与特异性亲和核酸配体进行偶联。
2.样品处理：将待纯化的核酸样品与磁珠混合，使核酸与磁珠上的配体结合。
3.磁珠分离：利用磁力将磁珠与非特异性成分分离。
4.洗脱：通过改变离子浓度或pH值等方式，使核酸从磁珠上洗脱下来。
磁珠法具有操作简便、灵敏度高、纯度好等优点，适用于大规模的核酸纯化。
溶液相法溶液相法又称沉淀法，通过加入适当的物质使核酸在溶液中沉淀，然后通过离心去除杂质，得到纯化后的核酸。
1. 乙醇沉淀乙醇沉淀是最常见的溶液相法之一。
其原理是通过加入乙醇来沉淀核酸，然后通过离心将核酸精确地分离出来。
步骤如下：1.样品处理：将待纯化的核酸样品与适量的乙醇混合。
2.沉淀：将混合物离心，使核酸沉淀到离心管底部。
3.去除上清：将上清倒掉，保留沉淀。
4.洗涤：加入乙醇洗涤沉淀，去除杂质。
5.干燥：将离心管在恒温下干燥，使核酸得到最终纯化。
乙醇沉淀法简单易行，适用于小规模分子生物学实验室中的核酸纯化。
核酸的研究方法
靶DNA的扩增
5’
(a)
引物2 5’
(b)
3’
3’
3’ 5’ 引物1
5’ (c) 引物2互补链
3’
3’ 引物1互补链
5’
(d)
3’
5’
新引
5’
物
3’
(e) 不同长度的链
单位长度的链
(f) 引物2互补链
5’
3’
(g)
3’ 引物1互补链
5’
目的片段（不同长度的链未示出）
docin/sundae_meng
英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖 1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖
合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。
docin/sundae_meng
docin/sundae_meng
末端终止法——Sanger
1、紫外吸收法 1个A～50μg/ml 双链DNA ～40μg/ml RNA或单链DNA
2、定糖法 RNA：核糖→ 糠醛→ →绿色物质（670-680nm）
浓HCl 苔黑酚/地衣酚
DNA：脱氧核糖+二苯胺→兰色物质（595-620nm）
浓硫酸
docin/sundae_meng
3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸
ρ ：浮力密度 ω ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离
docin/sundae_meng
（二）测定DNA的G-C含量
G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 ρ=0.1 xG-C + 1.658 xG-C =（ρ-1.658）× 10
docin/sundae_meng
12生物化学实验--核酸的定量分析
12⽣物化学实验--核酸的定量分析核酸的定量分析【⽬的】1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的⽅法。
2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。
【原理】核酸分⼦中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之⼀即可推算出核酸含量。
1 ．定糖法通过测定 DNA 或 RNA 分⼦中戊糖的含量，从⽽计算出 DNA 或 RNA 含量的⽅法。
RNA 在强酸环境中加热可⽔解产⽣核糖。
核糖在浓酸作⽤下脱⽔形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - ⼆羟基甲苯（地⾐酚）缩合成绿⾊化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最⼤吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进⾏⽐⾊即可测定出 RNA 的含量。
DNA 在强酸环境中加热⽔解⽣成的脱氧核糖与浓酸共热脱⽔⽣成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与能与⼆苯胺反应⽣成蓝⾊化合物（反应式见实验 11 ），其最⼤吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进⾏⽐⾊即可测定出DNA 的含量。
2 ．定磷法通过测定核酸中磷的含量，从⽽计算出 DNA 或 RNA 含量的⽅法。
核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。
⽤强酸使核酸分⼦中的有机磷消化成⽆机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作⽤⽣成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏⾎酸、α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，⽴即被还原为蓝⾊的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最⼤吸收峰波长为660nm 。
当⽆机磷浓度在 2.5~25µg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正⽐。
本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中⽆机磷的含量，将测得的总磷量减去原⽆机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进⽽计算核酸的含量。
3 ．紫外吸收法核酸分⼦中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最⼤吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。
11生物化学实验--核酸的定性分析
.核酸的定性分析【目的】1 ．掌握测定核酸的组成从而定性分析DNA或RNA的方法。
2 ．熟悉测定核酸的组成从而定性分析DNA 或 RNA 的原理。
【原理】RNA 和 DNA 均可被硫酸水解生成含氮碱（嘌呤碱与嘧啶碱）、戊糖（ RNA 中的核糖与 DNA 中的脱氧核糖）和磷酸。
水解产物可用下列方法鉴定。
1 ．嘌呤碱的鉴定原理嘌呤碱在弱碱性环境中能与硝酸银作用形成嘌呤银化合物。
初为乳白色，稍放久为浅灰褐色絮状物。
2 ．核糖的鉴定原理核糖经浓盐酸或浓硫酸作用，脱水生成糠醛，后者能与 3 ，5-二羟甲苯缩合形成鲜绿色化合物。
该反应需三氯化铁作为催化剂。
3．脱氧核糖的鉴定原理脱氧核糖在浓酸中脱水生成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与二苯胺作用生成蓝色化合物。
.4．磷酸的鉴定原理定磷试剂中的钼酸铵在酸性环境中以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸。
后者在还原剂氨基萘酚磺酸作用下形成蓝色的钼蓝。
【器材】1 ．试管与滴管2．PH 试纸3．沸水浴4．带有长玻璃管的胶塞【试剂】1．5%硫酸2． 5% 硝酸银溶液3．浓氨水4． 3,5- 二羟甲苯试剂取 FeCl 3 ·6H 2 O1.0g 溶于 6ml 水中，加浓盐酸 100ml ，混匀，此为 A 液。
另配制 6%3,5- 二羟甲苯乙醇溶液为 B 液。
临用时用 A 液 100ml 加 B 液 3.5ml 混合即可。
5．二苯胺试剂取二苯胺 1.0g 溶于 100ml 冰乙酸中，加浓硫酸 2.75ml 。
此二苯胺试剂遇光易变绿色，故临用前配制，贮于棕色瓶中，置冰箱保存。
6 ．钼酸试剂取钼酸铵 2.5g 溶于 20ml 水中，加浓硫酸（ A·R ） 8.5ml, 冷却后再加水至100ml ，放冷处可保存 4 周左右。
7 ．氨基萘酚磺酸溶液取 15% 亚硫酸氢钠溶液 195ml 与 20% 亚硫酸钠溶液 5ml 混合，加氨基萘酚磺酸0.5g ，在热水浴中搅拌使固体溶解（如不全溶，可滴加 20% 亚硫酸钠数滴，至多不超过 1ml 即可）。
核酸生物化学实验手册
核酸生物化学实验手册一、实验目的本实验手册旨在介绍核酸生物化学实验的基本操作流程及注意事项，帮助实验人员准确、高效地进行相关实验，确保实验结果的准确性和可靠性。
二、实验仪器和试剂1. 离心机2. PCR仪3. 电泳仪4. 热循环仪5. 磁力搅拌器6. DNA/RNA提取试剂盒7. 蛋白酶K8. DNase I9. RNase A10. 乙醇11. 琼脂糖12. 干冰13. 紫外可见分光光度计14. 等电聚焦仪三、实验操作流程1. DNA/RNA提取步骤一：将待提取样品加入DNA/RNA提取试剂，进行细胞裂解。
步骤二：加入蛋白酶K、DNase I和RNase A，消化蛋白质和RNA。
步骤三：使用乙醇沉淀DNA/RNA，将上清转移到新离心管中。
2. PCR扩增步骤一：配置PCR扩增体系，包括引物、模板DNA/RNA、dNTPs、Taq酶和缓冲液。
步骤二：设置PCR程序，包括变性、退火和延伸。
步骤三：进行PCR扩增反应，获取目的片段。
3. 凝胶电泳步骤一：制备琼脂糖凝胶，注入样品槽。
步骤二：加入DNA样品，在电泳仪中进行电泳分离。
步骤三：使用紫外可见分光光度计观察凝胶中DNA条带。
4. 蛋白质等电聚焦步骤一：制备等电聚焦槽，配置等电聚焦缓冲液。
步骤二：加载样品，进行等电聚焦分离。
步骤三：使用染色方法显示蛋白条带。
四、实验注意事项1. 操作过程中需注意无菌操作，避免污染实验样品。
2. 实验前需检查实验仪器的工作状态，确保正常运行。
3. 提取DNA/RNA需注意避免RNA降解，加入RNase A防止降解。
4. PCR扩增体系中引物的浓度和配对需合理搭配，避免影响扩增效果。
5. 实验结束后，及时清理实验台和仪器，保持实验环境整洁。
五、实验结果分析1. 根据凝胶电泳结果，识别目的DNA条带，并判定扩增效果。
2. 根据等电聚焦蛋白条带图谱，分析蛋白质的等电点及分子量。
3. 根据实验数据，综合分析实验结果，得出结论并提出下一步研究方向。
核酸的检测实验报告
一、实验目的1. 了解核酸的基本概念和特性。
2. 掌握核酸提取、纯化及检测的方法。
3. 学会使用紫外分光光度计进行核酸定量分析。
二、实验原理核酸是生物细胞中重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于细胞质中。
核酸的检测方法主要包括提取、纯化和定量分析。
1. 提取：通过化学或物理方法将核酸从细胞或其他生物材料中分离出来。
2. 纯化：去除提取过程中产生的杂质，提高核酸的纯度。
3. 定量分析：通过紫外分光光度计测定核酸的浓度。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌细胞、提取缓冲液、乙醇、RNAase抑制剂等。
2. 仪器：紫外分光光度计、离心机、电子天平、移液器、研钵、试管等。
四、实验步骤1. 核酸提取（1）将大肠杆菌细胞加入提取缓冲液中，充分振荡混匀。
（2）将混匀后的细胞溶液转移至离心管中，离心5分钟，弃去上清液。
（3）向离心管中加入等体积的70%乙醇，充分混匀。
（4）再次离心5分钟，弃去上清液。
（5）将沉淀用少量提取缓冲液溶解，转移至新的离心管中。
2. 核酸纯化（1）向含有核酸的离心管中加入等体积的70%乙醇，充分混匀。
（2）离心5分钟，弃去上清液。
（3）将沉淀用少量RNAase抑制剂溶液溶解，转移至新的离心管中。
3. 核酸定量分析（1）使用紫外分光光度计测定核酸溶液的吸光度。
（2）根据标准曲线计算核酸浓度。
五、实验结果与分析1. 核酸提取：通过观察离心管中的沉淀，可判断核酸是否成功提取。
2. 核酸纯化：通过观察离心管中的沉淀，可判断核酸是否成功纯化。
3. 核酸定量分析：根据标准曲线，计算核酸浓度。
六、实验讨论1. 在核酸提取过程中，注意细胞破碎程度，以确保核酸充分释放。
2. 在核酸纯化过程中，注意去除杂质，提高核酸纯度。
3. 在核酸定量分析过程中，注意标准曲线的制作和吸光度的测定。
七、实验结论通过本实验，成功提取、纯化和定量分析了大肠杆菌细胞中的核酸。
实验结果表明，核酸提取、纯化和定量分析方法在生物研究领域具有重要意义。
核酸高效脱盐技术
核酸高效脱盐技术核酸高效脱盐技术是一种在生物化学和分子生物学研究中常用的实验技术，用于去除核酸溶液中的盐类。
本文将详细介绍核酸高效脱盐技术的原理、方法和应用。
一、原理核酸高效脱盐技术的原理基于离心沉淀和洗涤的原理。
核酸在高盐浓度下会与盐离结合形成复杂的离子对，导致核酸的溶解度降低。
通过逐渐降低盐浓度，可以使核酸逐渐解离出离子对，最终实现核酸的脱盐。
二、方法核酸高效脱盐技术通常分为两个步骤：沉淀和洗涤。
1. 沉淀将含有核酸的溶液加入到离心管中。
然后，向溶液中加入适量的盐类（如氯化钠），使盐浓度达到高浓度。
接下来，将离心管放入高速离心机中，在适当的离心力下离心数分钟。
离心后，核酸会以沉淀的形式沉积在离心管底部。
2. 洗涤将上述沉淀得到的核酸溶于去离子水中，形成溶液。
然后，将溶液倒入新的离心管中，加入去离子水，使溶液的体积增加。
接着，将离心管放入高速离心机中，进行离心。
离心后，将上清液倒掉，保留沉淀。
重复上述步骤，直至获得无盐或低盐的核酸溶液。
三、应用核酸高效脱盐技术在许多生物化学和分子生物学实验中都得到了广泛应用。
1. DNA纯化在DNA提取和纯化过程中，常常需要去除DNA溶液中的盐类。
核酸高效脱盐技术可以快速、高效地去除盐类，得到纯净的DNA样品。
2. RNA纯化在RNA提取和纯化过程中，也需要进行盐类的去除。
核酸高效脱盐技术同样适用于RNA的脱盐，可以得到高质量的RNA样品。
3. 核酸结构研究在核酸结构研究中，盐对核酸的结构和稳定性有着重要的影响。
通过核酸高效脱盐技术可以去除盐类，从而探究核酸在无盐或低盐条件下的结构和功能。
4. 核酸酶反应在核酸酶反应中，盐会对酶的活性和稳定性产生影响。
通过核酸高效脱盐技术可以去除盐类，为核酸酶反应提供适宜的条件。
核酸高效脱盐技术是一种常用的实验技术，可以快速、高效地去除核酸溶液中的盐类。
该技术在DNA和RNA的纯化、核酸结构研究以及核酸酶反应等领域都有广泛的应用。
生物素标记核酸方法
生物素标记核酸方法引言：生物素标记核酸方法是一种常用的实验技术，通过将生物素与核酸分子结合，可以追踪和检测特定的核酸序列。
本文将介绍生物素标记核酸的原理、方法以及应用领域。
一、原理生物素是一种小分子有机物，具有很强的亲和力。
生物素标记核酸方法利用生物素与亲和剂亲和结合的特性，将生物素连接到核酸分子上。
通常采用二亚甲基双亲和剂（EDC）或过氧化物酶（H2O2）等化学试剂进行反应，将生物素共价地连接到核酸分子上。
二、方法1. 生物素标记DNA方法（1）制备DNA探针：将需要标记的DNA序列与生物素探针连接，通常采用连接试剂进行反应，生成生物素标记的DNA探针。
（2）标记DNA探针：将连接了生物素的DNA探针与目标DNA 序列进行杂交反应，使生物素与目标DNA结合。
（3）检测信号：通过酶标法、荧光染料或放射性同位素等方法，将生物素标记的DNA探针检测出来。
2. 生物素标记RNA方法（1）制备RNA探针：将需要标记的RNA序列与生物素探针连接，通常采用连接试剂进行反应，生成生物素标记的RNA探针。
（2）标记RNA探针：将连接了生物素的RNA探针与目标RNA序列进行杂交反应，使生物素与目标RNA结合。
（3）检测信号：通过酶标法、荧光染料或放射性同位素等方法，将生物素标记的RNA探针检测出来。
三、应用领域1. 基因表达分析：生物素标记核酸方法可以用于研究基因的表达水平，通过标记mRNA或miRNA等核酸分子，可以检测它们在细胞或组织中的表达情况。
2. 分子诊断：生物素标记核酸方法可以用于检测病原体的核酸序列，如病毒、细菌等，用于疾病的诊断和监测。
3. 分子遗传学研究：生物素标记核酸方法可以用于研究基因的遗传变异、突变等，从而揭示基因与表型之间的关系。
4. 蛋白质相互作用研究：生物素标记核酸方法可以用于研究蛋白质与核酸的相互作用，通过标记DNA或RNA分子，可以检测它们与特定蛋白质的结合情况。
结论：生物素标记核酸方法是一种重要的实验技术，可以用于追踪和检测特定的核酸序列。
核酸生物化学实验技术实验
核酸生物化学实验步骤（一）酵母中RNA的提取及紫外分光光度法测定核酸浓度1．稀碱法提取酵母中RNA实验原理：基于核酸不溶于乙醇。
先用稀碱将酵母细胞裂解，采用酸中和，通过离心去除菌体细胞的大碎片，采用乙醇可将上清液中的RNA沉淀出来。
该方法提取的核酸分子为变性失活的RNA。
操作方法：（1）称取2 g干酵母粉，放入100 mL烧杯中，加入20 mL 的1%氢氧化钠水溶液，搅拌30 min （玻璃棒手动充分搅拌）。
（2）30 min后，向（1）中加入少量乙酸调节pH至中性（切忌调节pH低于3，RNA的等电点2-2.5），试纸检查。
（3）将（2）全部转移至离心管中，3800 rpm离心10 min（最大装液量离心管体积的三分之二，等分两个离心管进行离心）。
弃沉淀（主要是细胞壁等碎片），留上清（含有RNA）。
（4）将上清液转移至干净的100 mL烧杯中，加入15 mL 95%的乙醇，充分混匀，静置10 min。
（此时，大部分RNA沉积于烧杯底部，转移时需要搅动，以免丢失RNA。
因此该步骤也可将上清液直接转移到离心管，静置10 min是必要的）（5）将（4）转移至离心管，3800 rpm离心5 min（一次离心管装不下，分两次离心），弃掉上清液，用95%乙醇重悬，离心洗涤2次，每次95%乙醇用量5 mL。
（6）将洗涤后的样品转移至干净的表面皿（已称重）上，95℃水浴蒸汽干燥（约10 min左右），称重计算干酵母中RNA含量。
干酵母中RNA含量(%)=提取的RNA重量（g）干酵母重量（g）×100%2．紫外吸收法测定提取RNA干粉中核酸含量实验原理：核酸分子在260 nm处具有特异性吸收峰试验方法：（1）称取实验1中提取的RNA干粉20 mg，加入少量0.5 mol/L的氢氧化钠水溶液溶解，然后加入去离子水，用50 mL容量瓶定容，（2）以去离子水做空白，测260 nm处的吸光度（A），计算提取的RNA干粉中核酸含量。
核酸的定量测定-定磷法
3. 苔黑酚（地衣酚）法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为 糠醛，后者与地衣酚（3,5-二羟甲苯）作用生成 绿色化合物，在670nm处有最大吸收，RNA浓 度在10~100微克/毫升范围内，光密度与RNA的 浓度成正比关系。
注意事项： 1．地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及 其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，可先测定样品 中DNA含量，再算出RNA含量。 2．本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯 醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干扰。
钼兰（Mo4+）兰色
钼兰在一定浓度范围内(无机磷含量在1—25μg范围内)。兰色的深浅和磷酸的含 量成正比（660nm），可用比色法测定其光吸收值。 1、标准曲线的制作 2、总磷的测定 3、无机磷的测定
▪用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
▪无机磷再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。 PO43- + 3NH4 + + 12MoO4 2- + 24H+ (NH4)3PO4· 12MoO3· 2O↓(黄色)+6H2O 6H ▪ 当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再 与试剂中的其它MoO42－结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8呈兰 色，称为钼兰。
倒入容量瓶，再加水至刻度。
混匀后，吸取3.0ml置于试管中，加定磷试剂3.0ml，摇匀， 45℃保温15分钟，冷却。测其A660nm。
3、无机磷的测定 吸取样品液（2mg/1ml）1.0 ml，置于100 ml容 量瓶中，加水至刻度，摇匀后，吸取3.0 ml置于试 管中，加定试剂3.0 ml，45℃水浴保温15分钟，冷 却，测其光吸收值。
优点：简单、快速、灵敏度高（可达3μg/ml的检测水平）。 缺点： 受蛋白质和核苷酸的干扰影响。
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转基因食品：以转基因生物为直接食品或为原料加工 生产的食品。 转基因食品利用现代分子生物技术，将某些生物的基 因转移到其他物种中去，改造生物的遗传物质，使其 在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的 目标转变。
转基因育种的程序？
目前，世界各国对转 基因食品的检测主要 从外源DNA和蛋白质 两种生物大分子入手
基于rDNA-ITS序列在真菌分子鉴定中的应用，你如何 获得高质量的基因组DNA并鉴定菌株的目的基因序列？
真菌rDNA-ITS通用引物
表1 真菌rDNA-ITS通用扩增引物
Primer
ITS1 ITS2
Sequence（5’- 3’）
TCCGTAGGTGAACCTGCGG GCTGCGTTCTTCATCGATGC
ITS1 primer ITS2 primer
5
18S rDNA
ITS1
5.8S rDNA
ITS2 ITS3 primer
28S rDNA
ITS4 primer
3
图1 真菌rDNA转录区和相关引物
设计特定引物对该真菌菌株中的基因组中的rDNA 转录区的特定核苷酸片段进行PCR扩增，通过对所 获得的PCR产物进行测序分析，与已知真菌序列比 对即可确定该菌株在系统分类学上的位置。
全班分成4大组，各选一个题目。 每个大组3个小组，2名同学一个小组。 以大组为单位进行实验准备和讨论。 以小组为单位进行实验设计和操作。
实验目标
学习从各种材料（动物、植物组织、微生物）中提取 和纯化DNA的原理和操作技术。
学习水平式琼脂糖凝胶电泳及紫外检测，确定DNA的纯 度、含量与分子大小。
SDS：真核生物的DNA与组蛋白结合形成DNP，SDS能够破坏DNA与蛋白
质之间的静电引力或配位键，可使DNA与蛋白质解聚，释放出DNA。
CTAB：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物， 在高盐溶液（NaCl>0.7M）中是可溶的，当NaCl降低到0.3M 时，可沉
淀CTAB-核酸复合物。
[4]赵颖茹, 苟小军, 颜军.两株银杉根际土壤真菌的分离与分子鉴定[J].成都大 学学报(自然科学版).2005,28(2):94-97.
[5]张志华, 康应田.海洋真菌分类鉴定方法探析[J].安徽农业科学. 2009, 37 (21) : 9825-9826. [6]赵有玺, 饶志明,王正祥等.转基因食品的快速PCR鉴定[J].无锡轻工大学学 报.2004,23(6):6-8. [7]赵艳.转基因稻米加工食品的PCR检测技术研究[J].中国粮油学报.2006,21 (3):198-201. [8]中华人民共和国国家标准GBT 19495.(1-8)-2004转基因产品的检测
课程内容 学时
2
综合训练内容
实验教学模式介绍，案例引导， 项目内容发布，实验设计要求， DNA提取与鉴定技术理论介绍
基因组DNA提取
理论辅导与实验 设计
16 实验1 基因组DNA的提 取与PCR鉴定
DNA含量和纯度测定
DNA琼脂糖凝胶电泳 PCR及产物检测
课堂研讨
2
实验过程总结，实验成果、创新 技术分享，教师点评和总结
去除蛋白质、 RNA等杂质
细胞破碎
化学法、机械法、生物法
细菌—溶菌酶（降解细胞壁），EDTA（抑制DNA 酶，防止DNA降解），去垢剂SDS（破坏细胞膜） 酵母—破壁酶或液氮研磨
植物材料—液氮研磨（使细胞冻结，用研钵碾制 成粉状） 动物组织—匀浆或液氮研磨
核酸分离纯化
DNA与蛋白质的分离 1.DNP中DNA与蛋白质的分离
Length(bp)
19 20
ITS3
ITS4
GCATCGATGAAGAACGCAGC
TCCTCCGCTTATTGATATGC
20
20
ITS1 primer
ITS2 primer源自518S rDNA
ITS1
5.8S rDNA
ITS2 ITS3 primer
28S rDNA
ITS4 primer
3
图1 真菌rDNA转录区和相关引物
实验时间安排
基因组DNA提取
4学时
DNA的含量与纯度测定
DNA的琼脂糖凝胶电泳 PCR及产物检测
4学时
4学时
4学时
课后研讨题
1.DNA提取的方法主要有哪些？并说明各方法的原理。
2.结合本人实验操作的体会，试述在提取过程中应如何 避免大分子DNA的降解和断裂？
3.查阅资料，说明提取的基因组DNA有哪些方面的用途？ 4.查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应用和发 展。 5.琼脂糖凝胶电泳所用DNA染料EB具有潜在的致癌性， 查阅资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。
第一节 实验项目发布与设计方案评价
案例1
目前，人们的生活中充斥了越来越多的转基因产品， 如转基因大豆、转基因棉花、转基因玉米、马铃薯、 水稻等等。 转基因作为一种新兴的生物技术手段，它的不成熟和 不确定性，使得转基因食品的安全性成为人们关注的 焦点。
问题：如何检测转基因食品？
什么是转基因食品？
[2]燕勇,朱心强,朱武通等. rDNA-ITS序列分析鉴定1例念珠菌性甲真菌病病原
[J]. 临床检验杂志.2009, 27(5):373-375. [3]王华民, Hong Guo,王英等.应用rDNA ITS测序检测海南岛条件致病性真 菌[J].海南医学院学报.2008, 14(1):1-5.
项目内容发布：通过案例引导的方式发布实验项目内 容、实验设计和实施要求 实验设计：分组——查阅资料——设计实验方案—— 网上递交——教师修改及审核 实验准备与实验操作：以大组为单位进行实验试剂 器材的准备，以小组为单位完成实验操作 实验论文＋课堂讨论：以大组为单位进行ppt汇报
第一讲 核酸化学实验技术
载体的构建
标记基因
启动子
外源目的基因
终止序列
转基因食品的核酸检测技术
检测对象：转基因的启动子、终止子、抗性筛选基 因、目的基因等外源基因 检测方法：普通定性PCR、实时荧光定量PCR、基 因芯片 其中以普通定性PCR、实时荧光定量PCR最常用。
核酸定性PCR法检测转基因食品
核酸定性PCR法检测转基因食品 一般步骤
样品基因组DNA的提取
DNA提取质量检测
特有序列的PCR
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
进一步验证：测序、PCR产物酶切鉴定、实时荧 光定量PCR方法等
案例2
某实验人员从土壤中分离筛选出一株产植酸酶的菌株， 经形态学和生理生化特性初步鉴定为真菌。
真菌种类繁多，地球上大约存在150万种真菌，已经被 发现和运用的大约有69000种。
问题：如何准确鉴定其种属 ？
生物遗传物质携带了物种的特异信息，在属种间具有 高度的保守性。因此，可应用分子生物学鉴定手段对真菌 进行种类鉴定和系统分类。
真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S、5S、 18S和5.8S rDNA 4种，在染色体上头尾相连，串联排列， 相互间由间隔区分隔。 18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元（图1）， 三者高度保守，适合较高等级水平生物群体间的系统分 析。 其间的间隔区为内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS），包括ITS1和ITS2，进化相对迅速，具 有多态性，适合较低等级水平的系统学研究。
实验项目与任务布置 实验题目：
基因组DNA的提取与PCR鉴定
实验设计要求：
根据案例提交一个具体解决基因组提取及分离鉴定的实 验设计方案，包括从提供的不同材料中提取、分离得到基 因组DNA，测定所得DNA的含量、纯度及分子大小，并 利用已知引物进行PCR扩增，分析PCR检测的结果。
分组题目
项目1：定性PCR法检测转基因食品 项目2：rDNA-ITS扩增法鉴定真菌种类
沉淀并吸附核酸
含DNA的水相可用1倍体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇 沉淀。
基因组的大分子DNA沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用 吸头将其挑出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附在壁 上及底部。 如果DNA沉淀量少或无法捞出，可离心获取沉淀。 沉淀DNA前，为提高沉淀效果，可加入NaAC、乙酸铵等盐 类促进沉淀。 获取的沉淀需再用70%乙醇洗涤除去残留的有机物、无机 盐等。
2.蛋白质的去除
苯酚-氯仿-异戊醇：苯酚、氯仿能变性蛋白质，离心分层，DNA溶于
上层水相，变性蛋白质位于水相和有机相之间。异戊醇可减少抽提过
程的泡沫产生。
核酸分离纯化
RNA的去除
用不含DNA酶的RNase处理，使RNA降解。 添加RNase处理后，可再用等量的苯酚/氯仿抽提， 离心除去蛋白质及寡核苷酸。
基因组DNA提取注意事项
使用新鲜、幼嫩的材料；材料应适量，过少造成核酸提取 量少，过多影响裂解，导致DNA量少。（推荐0.2-5g）。 简化操作步骤，缩短提取过程，避免物理、化学和生物的 因素对核酸的降解，如机械剪切力、高温和DNase等酶， 防止过酸、过碱，避免剧烈振荡和混合。 采用酚-氯仿抽提时应采用上下颠倒的方法充分混匀，但 动作要轻柔，离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。 沉淀DNA用的异戊醇、乙醇事先放入-20℃冰箱，待用时取 出。
《生化实验技术与应用》
主讲教师：钱国英 浙江万里学院 生物科学系
实验课程内容体系
第一讲 核酸化学实验技术