《分子生物实验》教学课件：实验二 哺乳动物白细胞DNA分离
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分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
动物组织中DNA的提取与鉴定
实验步骤
（二）DNA的鉴定
1. 取部分DNA溶液加入试管，加4 mL5%（m/V）H2SO4，再用带有长玻 璃管的软木塞塞紧管口，在沸水浴中加入15 min，静置数分钟水解DNA， 取上清进行鉴定分析； 2. 取DNA水解液1 mL，加二苯胺试剂2 mL，摇匀于沸水浴中加热10 min， 观察颜色变化； 3. 取0.5 mL5% AgNO3溶液，逐滴加入10% 氨水，并使沉淀刚好溶解为宜， 然后逐滴加入DNA水解液观察并记录现象； 4. 取0.5 mL DNA水解液，加入Vc-钼酸铵溶液1 mL，摇匀，放置10 min， 有何现象？再将溶液加热，又发生什么变化，请解释之。
实验原理—DNA提取
氯仿-异戊醇溶液可以使核蛋白变性沉淀，将核酸 物质萃取出来；再向萃取液中加入适量乙醇，可 使DNA析出。氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在 DNA纯化研究中非常常用，氯仿-异戊醇抽提的原 理是，氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相 分层；异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。 而DNA不溶于乙醇等有机溶剂，因此可以通过乙 醇沉淀来纯化和浓缩DNA。
思考题
1. 记录DNA提取和鉴定过程中的试验现象，结合实验原 理进行分析；
2. 分析DNA样品的纯度，计算DNA的浓度和得率。
谢谢！
实验步骤
（三）DNA的纯度测定与定量
1. 取DNA提取液0.1 mL，用水或缓冲液稀释一定浓度，用 紫外分光光度计分别测定同一样品的260 nm和280 nm的吸 光值（OD），检测DNA的纯度及浓度。 a) 若A260 nm / A280 nm 接近于1.8，则说明DNA样品的纯度高； b) DNA浓度（μg/mL） = A260 nm × 50 × 稀释倍数 × （1/光 经） c) DNA得率（mg）= DNA浓度 × 最终DNA原液（mL）
课件：实验八 动物组织中DNA的提取
分离到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷 基硫酸钠（SDS）使蛋白质变性，让DNA 游离出来，再用氯仿-异戊醇混和试剂沉 淀除去变性的蛋白质。然后加入95%乙 醇，可将DNA沉淀析出。
为了防止DNA酶解，在提取过程中加柠檬 酸盐、EDTA盐并要求在40C以下进行，以抑 制DNA酶的活性。
三、实验试剂及器材
1. 称取动物肝脏10g，剪碎后加入预冷的 0.15mol/LNaCl-0.015mol/L,pH7.0柠檬酸 钠溶液10ml，在组织捣碎机中捣成匀浆。
2. 4℃，6000rpm,离心15min，弃上清。
3. 沉淀中加入2倍体积的冷0.15mol/LNaCl0.015mol/L,pH7.0柠檬酸钠溶液，搅匀， 4℃， 6000rpm,离心15min，弃上清。
1. 0.15mol/LNaCl-0.015mol/L,pH7.0柠檬酸钠溶液 2. 0.15mol/LNaCl-0.1mol/L, EDTANa2溶液 3. 5%SDS溶液 4. 氯仿-异戊醇溶液：氯仿：异戊醇=24：1 5. 95%乙醇 6. 固体氯化钠 6. 组织捣碎机 7. 冷冻离心机
四、实验操作
动物生物化学实验
实验八 动物组织中DNA的提取
一、实验目的
• 1.学习从动物组织细胞中提取DNA的基本原理。 • 2. 掌握提白质结合成
脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白而存在。这两
种核蛋白在不同浓度的盐溶液中，有不同的 溶解度。在稀盐溶液（0.15mol/L）中，核糖 核蛋白溶解度大，脱氧核糖核蛋白溶解度小； 而在高盐溶液中（ 1mol/L）中，脱氧核糖核 蛋白溶解度大，核糖核蛋白溶解度小。利用 此差异，可见两种核蛋白彼此分开。
7. 将此溶液约4ml倒入离心管中，加入等体积的
氯仿-异戊醇，剧烈振荡10分钟，离心5分钟，可 见离心液分为三层：上层为清液，中层变性蛋白， 下层氯仿-异戊醇。
dna提取课件
dna提取课件DNA提取课件DNA提取是生物学实验中常见的一项技术，它可以从细胞中分离出DNA分子，为后续的实验研究提供基础。
本文将介绍DNA提取的原理、步骤以及在科学研究和医学应用中的重要性。
一、DNA提取的原理DNA提取的原理基于细胞的结构和化学性质。
细胞是生物体的基本单位，其中包含了DNA分子。
DNA分子是由碱基、糖和磷酸组成的巨大分子，它们通过特定的键结合在一起，形成螺旋状的双链结构。
DNA提取的过程主要包括细胞破碎、蛋白质去除和DNA沉淀。
首先，细胞膜需要被破坏，以使DNA从细胞中释放出来。
这可以通过机械破碎、酶解或化学方法来实现。
接下来，蛋白质需要被去除，以避免对DNA的干扰。
最后，通过加入盐和酒精等物质，可以使DNA沉淀下来，从而分离出纯净的DNA。
二、DNA提取的步骤DNA提取的步骤可以分为样本准备、细胞破碎、蛋白质去除和DNA沉淀等几个阶段。
首先，需要准备样本。
样本可以是植物组织、动物组织、细菌或真菌等。
样本的选择和处理对于提取DNA的质量和效果至关重要。
接下来，进行细胞破碎。
这可以通过机械方法（如研磨或振荡）或化学方法（如酶解）来实现。
破碎后的细胞释放出DNA分子。
然后，进行蛋白质去除。
蛋白质会干扰DNA的提取和纯化过程，所以需要将其去除。
这可以通过加入蛋白酶等物质来实现。
最后，进行DNA沉淀。
通过加入盐和酒精等物质，可以使DNA分子沉淀下来。
沉淀后的DNA可以通过离心等方法分离出来。
三、DNA提取的重要性DNA提取在科学研究和医学应用中具有重要的意义。
首先，DNA提取是进行分子生物学实验的基础。
无论是基因克隆、PCR扩增还是基因测序，都需要从细胞中提取纯净的DNA。
DNA提取的质量和纯度直接影响后续实验的结果和可靠性。
其次，DNA提取在遗传学研究中起着关键作用。
通过提取DNA，可以分析基因的组成和结构，研究基因在遗传传递中的作用和变异。
这对于理解遗传性疾病的发生机制、进行基因治疗以及种群遗传学研究等方面具有重要意义。
实验二 动物基因组DNA的提取
容至1000mL。 75％乙醇：750mL的无水乙醇溶于200mL的双蒸水，定容至
1000mL。 4℃预冷。 TE 缓冲液：1M Tris-HCl (pH=8.0 ) 2mL，0.5M EDTA
(pH=8.0 ) 0.2mL与97.8mL双蒸水混匀。
四、实验步骤
（一）动物组织材料的采集、保存(以鱼类分子材料的采集为例)
✓ 取0.05-0.1g 左右的尾鳍组织，充分剪碎，放入1.5mL离心管中； ✓ 向离心管中加入10～15μL的蛋白酶K 、500μL的HOM buffer，在55℃
消化至少2-3h，每隔0.5-1h摇动一次； ✓ 加500μL氯化钠（4.5M），300μL氯仿，混5-20min，期间剧烈摇动。
13000r/min下离心10min； ✓ 转移上清液到新管（大概850μL左右），加595μL无水异丙醇
何掌握？ • 2）你的组织材料消化后消化液的颜色、透明度如何？
是否有未消化材料？未消化材料可能是什么？ • 3）在试验的各步骤你看到什么现象？ • 4）叙述高盐法提取动物基因组DNA的步骤。
• 5）生物科学专业作业：DNA的粗提取与鉴定实验是人教版全日制普 通高级中学《生物》必修二中要求学生掌握并完成的一个重要实验。
注意事项
• （1）材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低； • （2）离心分离两相时，应保证一定的转速和时间； • （3）沉淀后应用75％的乙醇洗涤，以除去盐离子等； • （4）室温干燥DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）； • （5）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解（pH值为8.0，可防止
• 7）用中性笔写上标签，编号为“地点编号年月日001”起，如 020120728001，其中0（地点编号）2012（年）07（月）08（日）001 （当天编号）。将标签放入离心管中。
1000mL。 4℃预冷。 TE 缓冲液：1M Tris-HCl (pH=8.0 ) 2mL，0.5M EDTA
(pH=8.0 ) 0.2mL与97.8mL双蒸水混匀。
四、实验步骤
（一）动物组织材料的采集、保存(以鱼类分子材料的采集为例)
✓ 取0.05-0.1g 左右的尾鳍组织，充分剪碎，放入1.5mL离心管中； ✓ 向离心管中加入10～15μL的蛋白酶K 、500μL的HOM buffer，在55℃
消化至少2-3h，每隔0.5-1h摇动一次； ✓ 加500μL氯化钠（4.5M），300μL氯仿，混5-20min，期间剧烈摇动。
13000r/min下离心10min； ✓ 转移上清液到新管（大概850μL左右），加595μL无水异丙醇
何掌握？ • 2）你的组织材料消化后消化液的颜色、透明度如何？
是否有未消化材料？未消化材料可能是什么？ • 3）在试验的各步骤你看到什么现象？ • 4）叙述高盐法提取动物基因组DNA的步骤。
• 5）生物科学专业作业：DNA的粗提取与鉴定实验是人教版全日制普 通高级中学《生物》必修二中要求学生掌握并完成的一个重要实验。
注意事项
• （1）材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低； • （2）离心分离两相时，应保证一定的转速和时间； • （3）沉淀后应用75％的乙醇洗涤，以除去盐离子等； • （4）室温干燥DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）； • （5）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解（pH值为8.0，可防止
• 7）用中性笔写上标签，编号为“地点编号年月日001”起，如 020120728001，其中0（地点编号）2012（年）07（月）08（日）001 （当天编号）。将标签放入离心管中。
哺乳动物组织基因组DNA提取
High speed refrigerated centrifuge（高速冷冻离心机）、 Glass homogenizer （玻璃匀浆器） 、 Electrophoresis System （电泳系统） 、 Ultraviolet transilluminator （紫外 透射仪） 、 Ultra cold storage freezer （超低温冰箱） 、 Autoclave （高压灭菌锅） 、 Pipettes （微量加样器） 、 Electronic balance （电子天平） 、 Acidometer （酸度计）
2019/11/26
9
核酸的分离纯化、测定及 研究方法
一、 分离核酸的一般原则
因为遗传信息全部贮存在核 酸的一级结构中，故完整的一级 结构是保证核酸结构与功能研究 的基础。
2019/11/26
10
（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则 ① 保证核酸一级结构的完整性； ② 排除其它分子的污染。酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度 的金属离子；
② 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到 最低程度；
③ 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA， 反之亦然。
2019/11/26
11
（三）核酸分离纯化的注意事项
为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的
溶解20g氢氧化钠颗粒于约 90 ml 水的烧杯中（磁 力搅拌器搅拌），完全溶解后用水定容至100 ml 。 (6) 1 mol/L盐酸（HCl）： 加 8.6 ml 的浓盐酸至 91.4 ml 的水中。
2019/11/26
20
(7) 20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）：
2019/11/26
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核酸的分离纯化、测定及 研究方法
一、 分离核酸的一般原则
因为遗传信息全部贮存在核 酸的一级结构中，故完整的一级 结构是保证核酸结构与功能研究 的基础。
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（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则 ① 保证核酸一级结构的完整性； ② 排除其它分子的污染。酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度 的金属离子；
② 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到 最低程度；
③ 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA， 反之亦然。
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（三）核酸分离纯化的注意事项
为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的
溶解20g氢氧化钠颗粒于约 90 ml 水的烧杯中（磁 力搅拌器搅拌），完全溶解后用水定容至100 ml 。 (6) 1 mol/L盐酸（HCl）： 加 8.6 ml 的浓盐酸至 91.4 ml 的水中。
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(7) 20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）：
分子生物学实验讲义
《生化与分子生物学》实验讲义天津医科大学生物医学工程系2005年实验一自抗凝血中提取哺乳动物细胞基因组DNA一、实验目的1、了解核酸的基本特性。
2、掌握DNA提取和鉴定的方法。
二、实验原理核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术，核酸样品的质量可能直接关系到后续实验的成败。
核酸包括DNA、RNA两种分子，在真核细胞中都是以与蛋白质相结合的状态存在（DNA与组蛋白形成核小体，再折叠缠绕成染色体），真核生物基因组DNA 为双链线性分子，存在于细胞核内。
基因组DNA的提取需经过DNA的释放（破膜）、DNA与蛋白质的分离，DNA的沉淀等过程。
分离纯化核酸的总原则：1、保证核酸一级结构的（核苷酸序列）的完整性，全部的遗传信息均储存在一级结构中。
2、排除其它分子的污染。
a)对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。
b)生物大分子：蛋白质、多糖和脂质。
c)其它核酸分子：RNA.三、实验试剂1、TKM缓冲液10 mmol/L Tris-HCl pH 7.6 （Tris 三羟甲基氨基甲烷）10 mmol/L KCl2 mmol/L EDTA4 mmol/L MgCl22、TE缓冲液10 mmol/L Tris-HCl1 mmol/L EDTA pH 8.03、10％SDS4、饱和氯化钠四、实验步骤1、取0.5ml EDTA抗凝的全血于清洁的1.5ml Eppendorf离心管中。
2、加入0.5ml TKM缓冲液，13μl Triton X-100（终浓度为1.2％），颠倒混匀。
在台式离心机上离心，5,000rpm×10分钟。
（低渗破红细胞膜）。
3、倾去上清液，在离心管中加入1.0ml TKM缓冲液，混匀后离心，5,000rpm ×10分钟，重复步骤3两次。
（清洗）4、于沉淀中加入200μl TKM缓冲液和15μl 10％SDS（终浓度为0.7％），混匀后于55℃保温20分钟。
（破白细胞膜）注：此步中可加入少量蛋白酶K。
实验九动物组织中DNA的提取与鉴定PPT课件
DNA鉴定
琼脂糖凝胶电泳
将提取的DNA进行琼脂糖 凝胶电泳，观察电泳结果， 判断DNA的纯度和浓度。
紫外吸收法
利用紫外分光光度计测量 DNA溶液在260nm处的吸 光度值，计算DNA的浓度 和纯度。
荧光染料染色法
利用荧光染料染色DNA， 通过荧光分光光度计测量 DNA的荧光强度，判断 DNA的纯度和浓度。
细胞内的DNA。
DNA提取
离心
将匀浆后的样品进行离心，使细胞碎片和 杂质沉淀到底部，上清液中含有DNA。
洗涤
用洗涤液清洗吸附柱，去除未被吸附的杂 质。
吸附
将上清液加入到吸附柱上，DNA被吸附在 吸附柱的硅基质膜上，而蛋白质和其他杂 质被排除。
洗脱
用洗脱液将DNA从吸附柱上洗脱下来，收 集洗脱液中的DNA。
移液器
用于精确移取和量 取实验试剂。
电脑和PPT软件
用于制作和展示实 验课件。
03
实验步骤
样品处理
样品收集
选择新鲜的动物组织样品，确保 无菌条件下收集，避免样品受到
污染。
样品处理
将收集的动物组织切成小块，用 生理盐水或磷酸盐缓冲液冲洗，
去除表面的污物和血液。
样品匀浆
将处理过的组织块放入匀浆器中， 加入适量的匀浆介质（如石英砂、 玻璃珠等），破碎细胞，释放出
电泳技术的局限性
琼脂糖凝胶电泳技术虽然能够较好地分离DNA条带，但对于较长片段和大分子量DNA的 分辨率有限，未来可考虑采用其他电泳技术或优化现有技术。
纯度分析的注意事项
在紫外分光光度计检测过程中，需要注意消除样品中蛋白质、酚类等物质的干扰，以确保 纯度分析的准确性。同时，对于不同来源和性质的DNA样品，可能需要采用不同的纯度 分析方法。
哺乳动物基因组DNA的提取_百替生物
出摇匀，则为 1%琼脂糖凝胶液。 2.取出制胶板,洗净晾干,将制胶板放于水平位置,并放好样品梳子。 3.待胶冷至 60℃左右时加入 EB 5ul，摇匀，缓缓将凝胶倒入制胶板内。 4.待胶凝固后，取出梳子。
二、电泳加样 用移液器吸取 10 ul 已加入上样缓冲液的 DNA 样品加入加样孔。
三、电泳 接通电泳槽和电泳仪的电源，最高电源不超过 5V/。 当溴酚蓝染料移动至加样孔 3 cm 处时，停止电泳，将凝胶放在紫外灯下观察。DNA 存在处应显示
实验仪器和材料
低温冷冻离心机、烤箱、制冰机、移液器、冰箱，水平电泳槽、电泳仪、匀浆器、TRIzol、氯仿、 异丙醇、75％乙醇（DEPC H2O）配制、DEPC H2O
实验步骤
1. 取 50－100mg（新鲜或－70℃及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 匀浆器中，加入 1ml TRIzol 充分匀浆，室温静置 5min。
实验原理
DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负 电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等 量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度 取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不 一样，可进行分离。DNA 分子的迁移速度于相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离 相对分子质量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。
实验仪器和材料
0.8%琼脂糖凝胶（含 EB），1×TBE 电泳缓冲液，凝胶成像仪，DNA 标准带（DL-2000），水平电泳 槽，电泳仪，小鼠基因组 DNA
二、电泳加样 用移液器吸取 10 ul 已加入上样缓冲液的 DNA 样品加入加样孔。
三、电泳 接通电泳槽和电泳仪的电源，最高电源不超过 5V/。 当溴酚蓝染料移动至加样孔 3 cm 处时，停止电泳，将凝胶放在紫外灯下观察。DNA 存在处应显示
实验仪器和材料
低温冷冻离心机、烤箱、制冰机、移液器、冰箱，水平电泳槽、电泳仪、匀浆器、TRIzol、氯仿、 异丙醇、75％乙醇（DEPC H2O）配制、DEPC H2O
实验步骤
1. 取 50－100mg（新鲜或－70℃及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 匀浆器中，加入 1ml TRIzol 充分匀浆，室温静置 5min。
实验原理
DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负 电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等 量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度 取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不 一样，可进行分离。DNA 分子的迁移速度于相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离 相对分子质量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。
实验仪器和材料
0.8%琼脂糖凝胶（含 EB），1×TBE 电泳缓冲液，凝胶成像仪，DNA 标准带（DL-2000），水平电泳 槽，电泳仪，小鼠基因组 DNA
DNA的提取(34张)ppt课件
柠檬酸钠溶液
①
提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1蒸馏水
②
2. 溶解细胞核内的 DNA
2 m1／L的 NaCI溶液40 mL
③
3. 析出含DNA 的黏稠物
蒸馏水
④
4. 滤取含DNA物再溶解 2 mol／L的 NaCl溶液 20 mL
⑥
6. 过滤含DNA的 NaCl溶液
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5．在DNA粗提取实验中，向在溶解DNA的NaCl
溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（ C ）
A．有利于溶解DNA B．有利于溶解杂质 C．减少DNA的溶解度 D．减少杂质的溶解度
ppt课件完整
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方案一：在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度 为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl 溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤去除溶 液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶解DNA。
ppt课件完整
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方案二：直接在滤液中加入嫩肉 粉，反应10-15min，嫩肉粉中木 瓜蛋白酶能够分解蛋白质。
DNA
DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同
DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂耐受性不同
的
DNA与二苯胺呈现蓝色反应
粗
提
DNA粗提取
选择适宜材料
破碎细胞
取
与
DNA的纯化
DNA的溶解和析出
鉴
定
鉴定DNA
与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应
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1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加
入蒸馏水的作用是( B )。
动物组织DNA提取最终ppt课件
实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全
③
对 策
④ ⑤ ⑥
④
洗涤时DNA丢失
LOGO
二、实验方法及一般步骤
2）破碎抽提核酸除去杂质
首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它 成分分离 使核酸与蛋白质分离 除去脂类 多糖的除去
二、实验方法及一般步骤
3）核酸的纯化
根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染, 并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等） 杂质，最后得到均一的核酸样品。
二、实验方法及一般步骤
核酸制备中常用的蛋白质变性剂
作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造 成蛋白污染。
2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。
3.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
二、实验方法及一般步骤
核酸制备中常用的酶 DNase:降解DNA RNase：降解RNA 蛋白酶K：降解蛋白质 溶菌酶：破碎细胞
二、实验方法及一般步骤
4）核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质
温度： 4℃ 样品经常使用 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存,避免反复冻融
保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度
增加70％乙醇洗涤 的次数（2-3次）
③
③
五、 DNA提取常见 问题
问题二：DNA降解
原 因
① ②
①
③
④ ⑤
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 酶的活性 提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 DNA样品反复冻融
实验二 哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增
二,实验原理
1,哺乳动物组织DNA的提取:在EDTA(鳌合二价阳离子以抑制 哺乳动物组织DNA的提取: EDTA( DNA的提取 DNase)存在的情况下,用蛋白酶K消化真核细胞或组织, DNase)存在的情况下,用蛋白酶K消化真核细胞或组织,用去 垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性. SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性 垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性.核酸通过有机溶剂进行 抽提纯化.污染的RNA通过RNase消化去除. RNA通过RNase消化去除 抽提纯化.污染的RNA通过RNase消化去除.根据本方法制备的 哺乳动物DNA 20～ DNA约 kb,适于作PCR反应的模板.DNA产量在 PCR反应的模板 哺乳动物DNA约20～50 kb,适于作PCR反应的模板.DNA产量在 0.5～3.0μg/mg组织之间 组织之间. 0.5～3.0μg/mg组织之间. 2,多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR 多聚酶链式反应(polymerase reaction)简称 简称PCR 技术:PCR技术实际上是在模板DNA, 引物和4 :PCR技术实际上是在模板 技术:PCR技术实际上是在模板DNA, 引物和4种脱氧核 苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合反应,PCR DNA聚合酶的酶促合反应,PCR技 苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合反应,PCR技 术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性. DNA结合的特异性 术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性. 反应分三 变性(denaturation); 退火(annealing); );② );③ 步:①变性(denaturation);②退火(annealing);③延伸 tension),反应过程见图. ),反应过程见图 (ex tension),反应过程见图.
动物医学-动物生物化学实验《动物DNA提取》课件
4
氯仿 ➢ 强蛋白质变性剂，使液相与有机相分开 ➢ 抑制DNA酶的活性
异戊醇 ➢ 消除抽提过程中出现的泡沫
95%乙醇 ➢ 沉淀DNA
5
三、实验步骤
取材
取出冻肝,待溶化后,称取3g,剪成碎块.
匀浆
➢ 加入5 mL 0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA-Na溶液充分匀 浆;
3
主要试剂及其作用
EDTA ➢ 螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子 ➢ DNase作用时需要一定的金属离子作辅基 ➢ 抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用
SDS ➢ 抑制核糖核酸酶的作用 ➢ 溶解细胞膜上的脂质与蛋白，溶解膜蛋白而破坏细胞膜 ➢ 与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白 质变性而沉淀下来
➢ 再快速加入1mL 25% SDS,轻轻混匀10min； ➢ 加入3mL 5mol/L NaCl溶液(终浓度为1.07mol/L),继续轻轻混匀10min; ➢ 加入(14mL)一倍体积的氯仿-异戊醇混合液.于带磨口塞的锥形瓶中震摆
10min; ➢ 分别引流入三支小试管，3000rpm离心20min,分为三层:
8
上层-----水相 中间层---蛋白质 下层-----有机相
➢ 小心用皮头滴管吸取上层水相于小烧杯中,加入 2 倍体积的95%的乙醇,静 置；将DNA丝状物缠绕在玻棒上.
7
四、思考题
① 用95%酒精提抽DNA时为什么要轻轻搅动; ② 结合本人操作的体会，试述在提取过程中应如何避免大分子
DNA的降解.
实验六 动物肝脏DNA的提取 动物医学院动物生化教研室
一、实验目的
① 了解从动物组织中提取DNA的一般原理； ② 掌握DNA提取的方法和步骤。
氯仿 ➢ 强蛋白质变性剂，使液相与有机相分开 ➢ 抑制DNA酶的活性
异戊醇 ➢ 消除抽提过程中出现的泡沫
95%乙醇 ➢ 沉淀DNA
5
三、实验步骤
取材
取出冻肝,待溶化后,称取3g,剪成碎块.
匀浆
➢ 加入5 mL 0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA-Na溶液充分匀 浆;
3
主要试剂及其作用
EDTA ➢ 螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子 ➢ DNase作用时需要一定的金属离子作辅基 ➢ 抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用
SDS ➢ 抑制核糖核酸酶的作用 ➢ 溶解细胞膜上的脂质与蛋白，溶解膜蛋白而破坏细胞膜 ➢ 与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白 质变性而沉淀下来
➢ 再快速加入1mL 25% SDS,轻轻混匀10min； ➢ 加入3mL 5mol/L NaCl溶液(终浓度为1.07mol/L),继续轻轻混匀10min; ➢ 加入(14mL)一倍体积的氯仿-异戊醇混合液.于带磨口塞的锥形瓶中震摆
10min; ➢ 分别引流入三支小试管，3000rpm离心20min,分为三层:
8
上层-----水相 中间层---蛋白质 下层-----有机相
➢ 小心用皮头滴管吸取上层水相于小烧杯中,加入 2 倍体积的95%的乙醇,静 置；将DNA丝状物缠绕在玻棒上.
7
四、思考题
① 用95%酒精提抽DNA时为什么要轻轻搅动; ② 结合本人操作的体会，试述在提取过程中应如何避免大分子
DNA的降解.
实验六 动物肝脏DNA的提取 动物医学院动物生化教研室
一、实验目的
① 了解从动物组织中提取DNA的一般原理； ② 掌握DNA提取的方法和步骤。
哺乳动物细胞分离纯化21页PPT
纯化的方法
原则：利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染 ，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出 来。
常用方法： 1. 色谱层析 2. 沉淀 3. 透析 4. 电泳 5. 差速离心
色谱层析
常用的色谱层析： 1. 免疫亲和色谱：蛋白质与特异性配基配对到色谱基质上，
且蛋白质与配基间具有可逆的相互作用。 2. 离子交换色谱：利用不同的蛋白质表面净电荷的差异进行
物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm波长检测）。 5. 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱液立即用中和缓冲液（
0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。 6. 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。
蛋白质A层析色谱
纯化示例பைடு நூலகம்
结合缓冲液：PBS,pH7.4 洗脱缓冲液：0.1M Glycine,pH3.0 样品：ANTPD-A/ANTPD-B 层析柱：Protein A Sepharose Fast Flow
*蛋白A的分子结构
*典型的IgG结构
蛋白质A层析色谱
分离操作
结合缓冲液：20mM磷酸纳，pH7.0 洗脱缓冲液：100mM甘氨酸/100mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3.0 中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.0 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 3. 上样，流速为0.5ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 4. 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合
细胞培养液 MK 流穿样品 洗脱样品 120KD 90KD 60KD
40KD
30KD
20KD
14KD
DNA的提取与鉴定讲解ppt课件
4D不 溶、N解同AD，，和NA而利蛋的当m大D一液在m随逐时ND使用N白o中，氯Na原o溶N，N渐lAC杂这lA／溶浓化质/aa理l的D降L的溶解CC质L解度钠一时N等，ll溶时低溶液溶溶A或为性的沉特，可其解，；解浓溶液液析物淀D以点0D度他在度度解浓浓出质．NN，使最，0又继成度度度A的1A.或D14的低续逐选的最的低量分4N者m。溶增渐溶小浓增于择A在mo相利 在加度增解解；加0ol适不／.l1为用 盐度时大反当而度/4当LL同时最这 溶， 。2的浓，盐度浓的度Na就C能l溶使液D中N溶A解充度分
4.DNA的再溶解。 用高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。
5.DNA的沉淀和浓缩。
对于除去了蛋白质的DNA的氯化钠溶液，必须再进 一步沉淀和浓缩，常用酒精沉淀法。即往含有Na＋的 DNA溶液，加入体积分数为95%的冷却酒精，混匀后可 以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物， 悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰 箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNA丝状物可以用玻棒 （玻棒有吸附DNA的作用）缓缓旋转的方法卷起。
3.DNA的鉴定： 加入二苯胺试剂4mL，用玻棒搅拌使DNA溶解，沸水 浴5min，观察溶液是否出现浅蓝色。
三、实验小结
1.共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌”
2.加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精”
四、实验原理拓展介绍。
1.DNA的释放。 DNA主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释 放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以 大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌 的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但释 放出来的大量DNA与RNA、蛋白质结合在一起，即释放 的不是纯净的DNA，常称为DNA核蛋白。 2.DNA与蛋白质分离。 在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解， 析出DNA并溶解在高浓度的氯化钠溶液中 3.DNA的析出与获取。 因为DNA在低浓度（ 0.14mol/L ）的氯化钠溶液中溶解 度小，而蛋白质的在其中的溶解度大。所以在向含DNA 的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶 液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解度增高。
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天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形 式存在于细胞核中。环绕着8个组蛋白构成核小体
从细胞中提取DNA 时，要先把DNP抽提出来，再把P除去， 再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA 。
DNA提取的几种方法
（1）水抽提法
利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低 盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分 溶解于水中，离心后收集上清液。在上清中加入固体 氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇，立即用 搅拌法搅出。然后分别用66%、80%和95%乙醇以及 丙铜洗涤，最后在空气中干燥，既得DNA样品。此法 提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不用。为除蛋 白可将此法加以改良，在提取过程中加入SDS。
此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。
三、主要仪器及试材
实验器材：高速冷冻离心机，高压灭菌锅，离 心管，枪头，移液器，恒温水浴摇 床，冰箱等
试剂及作用
SDS（十二烷基硫酸钠）：溶解细胞膜上的脂类与 蛋白质，使细胞膜裂解，并解离细胞中的核蛋白， 使与DNA双链紧密结合的组蛋白分开和变性，破 坏蛋白质的二级和三级结构，使其容易被蛋白酶水 解。另外，还能与蛋白质结合而沉淀。
六、实验结果处理
提交“哺乳动物白细胞DNA分离”实验报 告（统一格式、纸张）
七、思考题
哺乳动物白细胞DNA分离的原理 及各种试剂的作用。
30μl左右至终浓度100μg/ml，10％SDS
150μl至终浓度0.5%，55℃水浴消化过夜
加入等体积的Tris.Cl饱和酚，轻轻 摇匀10-20min，10000g离心10min
转移上层水相至另一离心管中（重复此步骤一次）
加入等体积苯酚/ 氯仿/ 异戊醇（25: 24: 1），轻轻摇动10-20min以混匀
10000g离心10min，吸取上层水相于另一离心管
加入等体积的氯仿/ 异戊醇（24: 1） 轻轻摇动10min以混匀，10000g离心 10min，吸取上层水相于另一离心管
加入两倍体积冰预冷无水乙醇，轻 轻转动离心管，DNA呈絮状析出
10000g离心5min沉淀DNA或用玻棒或去头吸 管小心挑出DNA沉淀，放入1.5ml离心管中
苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。用 苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分 子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶 于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重 复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性 质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可 用玻璃棒漫漫绕成一团，取出。
实验二 哺乳动物白细胞 DNA分离
华中农业大学动物科技学院
一、实验目的
掌握利用苯酚抽提法提取DNA的技术； 明确影响提取畜禽血液DNA质量的因素。
二、实验原理
核酸的理化性质
（1）DNA是极性化合物，溶于水，不溶于乙 醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游 离酸易溶于水。
（2）在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或 弱碱性溶液中较稳定。
EDTA（乙二胺四乙酸）：可以螯合Mg离子，从而 有助于阻止核酸分子间的聚集及核酸与蛋白质间的 聚集，与SDS一样还可抑制核酸酶的活性。
蛋白酶K：能水解消化蛋白质，特别是与DNA 结合的组蛋白，在SDS存在下活性增强，不受 EDTA的抑制，在较高温度下仍有活性。
苯酚/氯仿：除去变性的蛋白质及多糖、脂类等 杂质，氯仿还可除去水相中残留的酚。
B. 以稀盐酸溶液提取DNA时，加入适量去污剂， 如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取 过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作 用，在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离 子的烙合剂。通常用0.15M NaCl，0.015M柠檬 钠，并称SSC溶液，提取DNA。
（4）苯酚抽提法
（2）阴离子去污剂法
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性， 可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞 中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键 结合，因为阴离子去污剂能够破坏这种价键， 所以常用阴离子去污剂提取DNA。
（3）浓盐法
A. 利用DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者 分离，常用的方法是用1M 氯化纳抽提，得 到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇 荡，使乳化，再离心除去蛋白质，此时蛋白 质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位 于上层水相中，氯仿位于下层，用2倍体积 95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来。
异戊醇：防止水相和有机相之间的蛋白质起泡。
酚：市售的酚需要重新蒸馏，在酚中加入0.1%的抗 氧化剂8－羟基喹啉，可减缓酚的氧化，还可使试 剂变成黄色。酚试剂PH值应调到8.0（PH5-6， DNA可以部分地溶解在有机相或界面中，在更酸的 条件下DNA发生脱嘌呤而产生缺口）。
四、实验方法பைடு நூலகம்步骤
白细胞沉淀加入1×SET 1~2ml，蛋白酶K
再用预冷无水乙醇漂洗一次， 10000g离心 5min沉淀DNA，弃乙醇，自然干燥DNA沉淀
加入200μl 去离子水溶解DNA，分装保存
五、实验注意事项
混匀时力度不应过大； 吸取上层水相时，应小心吸取，不应
吸取蛋白质层； 洗涤DNA沉淀时应用预冷的无水乙醇； 实验过程中应防止苯酚、氯仿烧伤。