发育生物学教案-2015年

daf-16 干扰质粒菌作为实验组，每组各准备一个平板（三块平板有何不同？）。 (2) 每只板上挑取 3-5 只含有 GFP 的线虫（TJ356），产卵 3 小时。计做 day0。 (3) day3 观察各个平皿中线虫形态的不同。 (4) 挑取 day3 期各个平皿中的线虫，制成 Pad，在荧光显微镜下观察，拍摄各个
3、挑虫、培养： (1) 将铂金丝做的笔在酒精灯上烧红后，在线虫培养基上轻划几下，即可用于挑
虫； (2) 解剖显微镜下找到合适的成虫，用“笔”将它轻轻挑起，迅速在解剖显微镜下
将之放到新的平板上，共挑取 3-5 只线虫； (3) 将培养皿做好标记，放到 20℃生化培养箱中培养；
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(4) 产卵 3 小时后，显微镜下可以看见培养皿上有椭圆颗粒状的线虫卵（胚胎）， 此时，可以将成虫挑走。产卵当天计作 day0。
C.elegans 为蠕虫状，长度约 1mm，因其个体结构简单、体细胞数目恒定， 特定细胞位置固定，生活史短、遗传背景清楚、基因组测序已经完成等，在遗传 与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病、病原体与生 物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信号传导等领域 得到广泛应用。如细胞凋亡现象及其机理以及 RNA 干扰技术最早都是在线虫中 被揭示的。
实验用的大肠杆菌是 OP50 以及 HT115（DE3）。HT115（DE3）菌株是 RNAse III（dsRNA 特异性降解酶）缺陷型，并且可以通过 IPTG 诱导 T7 RNA 聚合酶的 大量表达。
实验用的质粒有三种：L4440 空载质粒，Chc-1 干扰质粒（多克隆位点插入 Chc-1 基因的 L4440 质粒），Daf-16 干扰质粒（多克隆位点插入 Daf-16 基因的 L4440 质粒）。
图 4：电镜下的雄虫
图 5 雄虫和雌雄同体线虫交配
C.elegans 的生活史包括胚胎期、幼虫期（L1-L4）、成虫期三个阶段（如图 6）。 一个雌雄同体线虫一生约可以产 300 个卵，卵经过 L1、L2、L3、L4 4 个幼虫时 期，进入成虫期，如果外部条件比较恶劣，比如：拥挤、缺乏食物等，线虫会进 入一个特殊的 L3 时期——dauer 时期来抵抗外部的不良环境。C.elegans 在实验 室 20-22℃的条件下，约 3.5 天长成成虫，可存活两到三周。线虫可以自体受精， 当卵母细胞经过贮精囊时受精，也可以接受雄虫的精子进行异体受精（图 5）。
一、 实验目的 1. 学习并掌握实验室饲养斑马鱼的方法。 2. 掌握斑马鱼胚胎发育过程的主要特点。
二、 实验原理 斑马鱼（Denio rerio）属鲤科短担尼鱼属，是一种常见的热带鱼，体形纤
细呈梭形，体侧有水平分布均匀的条纹，成鱼体长 3～4cm，最长可达 6.5cm，寿 命为 2～3 年。雄鱼鱼体较修长，腹部偏黄；雌鱼鱼体较肥大，腹部偏白。上世 纪 70 年代初美国俄勒冈大学著名遗传学家和发育生物学家 George Streisinger 教授首次提出将斑马鱼作为模式生物。目前，斑马鱼已成为重大疾病的分子发生 机制、疾病模型构建及药物筛选等研究领域中重要的研究材料。斑马鱼作为研究 高等脊椎动物的发育过程及其分子发育机制的重要材料主要是由于其具有：①个 体小，养殖花费少，可大规模繁殖；②体外受精，产卵多，体外发育；③胚胎发 育同步（25～31℃发育正常），胚胎透明；④成体长 3～4cm，孵出后约 3 个月可 达性成熟；⑤有丰富的品系资源；⑥染色体数为 50，基因组序列已经全面测出 等优点。
C.elegans 是唯一一个身体中的所有细胞能被逐个盘点并各归其类的生物。 其幼虫含有 556 个体细胞和 2 个原始生殖细胞，而它的成虫则根据性别不同具有 不同的细胞数。最常见的雌雄同体成虫在发育期间，共产生 1090 个细胞，其中 131 个在特定时期凋亡，因此，其成熟后含有 959 个体细胞和 2000 个生殖细胞， 而较少见的雄性成虫则只有 1031 个体细胞和 1000 个生殖细胞。
实验组的照片。
五、实验注意事项
1、挑虫要多加练习，不要急于做实验。 2、有些观察项目需要对同一个虫子进行连续观察，请耐心点。 3、在操作过程中，注意不要将培养基戳破，防止线虫钻进培养基内不方便观察。 4、操作过程中尽量少说话，防止污染线虫培养基。 5、如果在超净台外观察线虫，尽量不要打开培养皿的盖子。 6、线虫容易失水死亡，尽量缩短线虫离开培养基的时间。
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图 6 22℃下秀丽隐杆线虫的生命周期
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（二）线虫 RNAi 技术： RNAi （RNA-mediated interference）技术是指与靶基因同源的双链 RNA 诱
导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链 RNA 被特异的核酸酶降解， 产生干扰小 RNA(siRNA)，这些 siRNA 与同源的靶 RNA 互补结合，特异性酶降 解靶 RNA，从而抑制、下调基因表达（图 7）。RNAi 技术已经发展成为基因治 疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。
Chc-1 参与卵黄的内吞作用，当 RNAi 使其表达量下降后可导致线虫的胚胎 死亡，线虫发育阻滞在幼虫期。在做 RNAi 干扰实验时，通常用这个基因作为阳 性对照。
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Daf-16 是 FOXO 家族的成员，该基因主要是通过其转录因子的功能调控一 些基因的表达来参与细胞功能。研究表明，DAF-16 基因同寿命、免疫力密切相 关，是一种寿命调控因子。
培养。
2、线虫的观察： 每个小组在解剖显微镜下，对观察用线虫（主要是 N2）按照下列提纲进行
观察： 认识线虫的各主要组织器官：头部、尾部、咽、肠、子宫； 区别雌雄同体以及雄虫； 观察线虫的运动方式； 观察线虫的进食、产卵（线虫约 20 分钟产一次卵，每次可连续产 5-10 个卵）等行为； 区分各个发育时期的线虫。
实验一 秀丽隐杆线虫的培养及其发育过程的观察
一、 实验目的
1. 理解线虫作为模式生物的优势以及在相关研究领域的应用； 2. 掌握线虫的基本培养技术，观察并且区分两种线虫个体发育过程的异同； 3. 理解线虫 RNA 干扰技术的基本原理，并学会使用该方法对目的基因进行 干扰。
二、 实验原理
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegan）属于线虫动物门（Nematoda）隐杆线 虫属（Caenorhabditis）秀丽隐杆线虫种（C.elegans），根据命名法则中的二名法 命名为 Caenorhabditis elegans。上世纪六七十年代分子遗传学的奠基人之一 Sydney Brenner 将线虫作为分子生物学和发育生物学研究的模式生物。
三、 实验器材 （一） 实验用品
恒温生化培养箱、解剖显微镜、超净工作台、6cm 培养皿、挑针、摇床、10ml 离心管以及管架、1.5ml 离心管以及管架、250ml 锥形瓶、酒精灯、75%酒精棉球
（二） 实验材料
野生型 N2 线虫、TJ356 线虫、E. coli OP50 以及 HT115、LB 固体培养基、LB 液
六、思考题
1、本实验是哪种线虫的什么基因被什么干扰之后不表达了？为什么被干扰基因 会不表达？这种干扰效果可以遗传吗？可以持续很长时间吗？ 2、HT115（DE3）大肠杆菌和 L4440 质粒是线虫 RNA 干扰实验中最常用到的实验 材料，请问它们的配合对线虫 RNA 干扰实验有何好处？
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实验二 斑马鱼的饲养及胚胎发育过程的观察
图 7 RNAi 原理示意图 1、长的双链 RNA（Long double-stranded RNAs， dsRNAs; typically >200 nt）被引 入细胞； 2、宿主细胞对这些 dsRNAs 产生反应，核 酸内切酶 Dicer 将 dsRNA 切割成多个具有 特定长度和结构的小片段 RNA（大约 21～ 23 bp），即 siRNA； 3、siRNA 在细胞内 RNA 解旋酶的作用下 解链成正义链和反义链，反义 siRNA 再与 体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶 等 ) 结 合 形 成 RNA 诱 导 的 沉 默 复 合 物 (RNA-induced silencing complex，RISC)； 4、RISC 与外源性基因表达的 mRNA 的同 源区进行特异性结合，RISC 具有核酸酶的 功能，在结合部位的两端切割 mRNA，使 目标 mRNA 降解；
1998 年，Fire 建立了线虫 RNA 干扰技术，由于线虫 RNAi 操作简单、特异 性高、干扰效果持久，并且也是一种最简单有效的抑制特定基因表达的方法，已 经成为反向遗传学研究的一个有力的工具。 线虫 RNAi 干扰的方法主要有三种：一、直接显微注射 dsRNA；二、将线虫培 养在含有 dsRNA 的液体培养基中；三、喂食能够表达 dsRNA 的大肠杆菌。其中 第三种方法由于适用于大规模的操作，简单经济等原因，使用比较普遍。 本实验采用喂食能够表达 dsRNA 大肠杆菌的方法，来干扰线虫 Chc-1 以及 DAF-16 两个基因的表达。
图 8 L4440 质粒结构图
实验用的 C.elegans 有两种，野生型 N2 以及突变型 TJ356。TJ356 线虫的基 因组中整合了 DAF-16::GFP 以及 roller 基因。DAF-16::GFP 主要定位在肌肉细胞， 肠道细胞和神经细胞，这些部位有绿色荧光产生，而 roller 基因可以导致线虫不 能顺利呈 S 型游动，而是在原地转圈，所以在培养基上可看见一个一个圆圈。
C.elegans 的基本结构以及生活史 C.elegans 有雌雄同体（XX）和雄虫(XO)两种性别，在自然条件下， 成虫
大多为雌雄同体，雄虫的个体数只占大约千分之一。其基本的结构包括口、咽、 肠、性腺以及胶原蛋白角质层，雌雄同体有两个卵巢、输卵管、储精囊，及单一 一个子宫（图 1，2），雄性有个单叶的性腺、输精管及一个特化为交配用的尾部 （图 3，4）。
C. elegans 有五对常染色体和一对性染色体，是一个染色体数很少的二倍体。
图 1 雌雄同体线虫解剖示意图