变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验

一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

配制溶液：

1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存）

2、10% 过硫酸铵（0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月）

3、10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml）

4、TEMED

5、20-200 DNA marker

6、尿素

实验步骤：

1、配置10%的胶10ml：8M*10ml*60g/mol=4.8g 尿素

6.1ml water

3.3ml 30% Acrylamide

1ml 10 ×TBE

0.11ml APS

0.01mlTEMED

2、立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。

3、向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合

的丙烯酰胺。

4、将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部

的三分之一处，大约需要60-90分钟。

二银染实验

银染溶液的配置：实验之前准备4℃水

1、固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行）

2、染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加1.5ml37%甲醛溶液，必须

储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行）

3、显影液：将30gNa2CO3溶解于ddH2O中，冷却至4℃，使用前加1.5ml37%甲醛溶液

（通风厨中进行），0.1M五水硫代硫酸钠150μl；（0.1M Na2S2O3。5H2O：将2.48g Na2S2O3。5H2O溶于100mlddH2O）。

注意事项：

1、染色液和显影液要现用现配；

2、显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃；

3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作；

4、实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色；

5、显色不能在透光的盒子中进行；

6、溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方

一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘；

7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没；

8、显色过程中盘中须轻轻摇动。

实验步骤：

1、固定：用刀子轻轻分开玻璃板，将带有凝胶的一块玻璃板放入盛有200ml固定液的盘

子中，放在水平摇床上摇动20min或直至染料带完全消失

2、洗涤：把固定液倒回大烧杯中，然后用ddH2O清洗三次，每次2min

3、染色：把玻璃板放在盛有100ml染色液的盘子里，在水平摇床上摇动30min

4、显影：把玻璃板在预冷ddH2O中快速过一下（不超过10s），迅速放入预冷（4℃）的

显影液中，显色3-5min或直至所有的带都出现

5、停止：当出现清晰的条带时，加入先前用过的500ml固定液轻轻摇动，停止显影

6、用ddH2O将凝胶洗2次，每次2min

7、晾干，扫描

8、拍照观察