第三章突变的应用_微生物遗传育种

三、诱变育种的一般步骤
出发菌株 ↓纯化、活化、前培养（同步培养） 培养液 ↓离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤） 单细胞或单孢子悬液 ↓活菌计数，诱变预备试验 诱变处理 ↓活细胞计数，致死率计算 后培养（中间培养） ↓ 平板分离 ↓变异率计算 初筛→复筛→ 保藏及扩大试验
（一）出发菌株的选择
剂作用后所造成的损伤能快速通过复制而形成 突变，可以获得较高的突变率。
➢ 前培养的培养基：嘌呤、嘧啶碱基含量要丰
富
（二）前培养
➢ 丝状真菌的前培养
产孢子真菌一般采用其孢子进行诱变，为提高 其对诱变剂敏感性，可以将其同步培养至孢子 刚萌发的高生理活性状态（芽管的长度相当于 孢子直径的0.5~1倍）；
第三章 突变的应用
第一节 诱变育种 第二节 营养缺陷型突变株的筛选与应用 第三节 抗反馈调节突变型的筛选及应用 第四节 其它类型突变株的筛选及应用 第五节 菌种退化及其防止
第一节 诱变育种
一、概述 二、诱变育种方案的设计 三、诱变育种的一般步骤 四、诱变育种中应注意的一些问题
一、概述
（一）诱变育种技术的产生与发展
➢ 工业与工程需求：发酵工业尤其是抗生素工业生 产菌株选育工作的需要；
➢ 理论与技术基础：Thom和Steinberg（1939）用X 射线在真菌中首次诱发基因突变成功；
➢ 问题探索与技术发展：Davis对各种诱变筛选程序 的统计学比较；Calam对各种诱变剂量下的产量 分步曲线的比较；Dahl等人对筛选工作可能误差 的分析；各种自动化和高通量筛选技术出现
（二）诱变育种技术在育种工作的作用
➢ 提高目标产物的产量； ➢ 改善菌种特性，提高产品质量，简化工艺条件； ➢ 开发新产品； ➢ 给代谢调控育种提供技术手段
（三）高产菌株诱变育种的特点
产量是一种数量性状，数量性状的特性和基因 突变的特点决定了高产菌株的诱变选育一般具 有以下一些特点：
➢ 盲目性大； ➢ 筛选工作繁琐，工作量大； ➢ 工作效率低，周期长； ➢ 难以集合多个优良性状
诱变剂量的控制方法
化学诱变剂：诱变剂的浓度、处理时间和处理条件； 物理诱变剂：照射距离、照射时间和照射条件
形态突变型 负突变型 正突变型
X-射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株39#变 异的关系
紫外线照射剂量与龟裂链霉菌பைடு நூலகம்霉素高产菌株293#变异 的关系
3. 处理方法
➢ 单一诱变剂处理;
二、诱变育种方案的设计
➢ 制定明确的选育目标：一次诱变目标不可太高太 多；
➢ 建立可行的筛选方法：关键问题是确立一种测定 产物的方法；
➢ 确定诱变筛选流程：是诱变育种工作方案设计的 中心内容。对于既往诱变史较少的低产菌株，采 用一次高效法有利于提高育种工作的进度；而对 于已进行多次诱变处理的高产菌株，多步积累法 优于一次高效法。
紫外线的剂量（erg/mm2）： 3, 4-2000；5, 6-4000； 7, 8-6000；9, 10-10000
3. 处理方法
➢ 直接处理：在缓冲液或无菌生理盐水体系中 对出发菌株进行诱变处理，然后涂平板分离 突变株；
➢ 生长过程处理：在摇瓶培养基或固体平板中 加入诱变剂，在菌体生长时进行诱变处理。 （适用？）
➢ 尽量选择既往诱变史少的高产菌株： 由 自然界分离获得的野生型菌株，突变可 能性较大;经自然分离的生产菌株，对生 产环境适应，又具野生型特性，也是良 好的出发菌株;经过诱变改造的菌株，负 突变可能性较大，可结合其它育种方法 改变其遗传保守性
（一）出发菌株的选择
➢ 挑选纯系（遗传纯）菌株：避免使用丝 状真菌菌丝体（异核体）；要尽量选择 单倍体单核细胞（孢子），以减少诱变 菌的分离延迟（结合诱变剂选择）
不产孢子的真菌可以采用年幼的菌丝体进行诱 变处理（对尖端菌丝、单菌落边缘菌丝或小段 菌丝悬浮液进行诱变处理）
（三）菌悬液的制备
➢ 选择合适的介质：物理诱变常采用生理盐水作分
散介质，而化学诱变则需要用缓冲液作介质。
➢ 使细胞或孢子要处于良好的分散状态：利于与 诱变剂解除；便于筛选
玻璃株打散，脱脂棉或擦镜纸（双层）过滤
➢ 调节适当的细胞或孢子密度
酵母细胞、霉菌孢子：106~107个/ml； 细菌细胞、放线菌孢子：108个/ml ✓ 估计：血球计数板计数或OD法 计数：平板菌落计数
（四）诱变处理
1.诱变剂的选择 ➢ 在不影响诱变效果的前提下，尽量选择毒性小、易于
防护、安全性强的诱变剂； ➢ 尽量选择操作简便易行、便宜易得的诱变剂； ➢ 尽量选择不易发生回复突变的诱变剂：碱基置换易回
复，染色体畸变、移码等不易回复 ➢ 对一些既往诱变史少的低产或野生菌株，uv线往往
是首选；对于经多次诱变处理的菌株，常需要能诱发 染色体发生重排等较大损伤的强辐射进行处理。 ➢ 结合细胞的透性和生理状态进行选择 ➢ 经常变换诱变剂或复合处理
2.诱变剂量的选择
➢高产菌株在低剂量时效果较好，而对多核细胞、孢子、 低产菌株或质量性状处理剂量不宜过低。 ➢经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理来 激活；一次较高剂量的强诱变后，通常接着进行2~3次 较低剂量的温和诱变，以利于菌株遗传性状的稳定。 ➢在一次诱变中，可以分别采用不同剂量处理出发菌株， 从中选出最佳剂量
➢ 选择对诱变剂敏感的菌株：选择一些增 变突变株
➢ 采用多出发菌株
➢ 更换出发菌株
➢ 具有特定生产性状的可能性：要确有特 定物的代谢途径
（二）前培养
➢ 前培养的目的：
对数中后期：生长旺盛，细胞浓度较高，对诱 变剂敏感；
同步培养物：诱变剂处理时，群体中变化一致； 细胞内应具有丰富的内源性碱基：DNA被诱变
（五）后培养
➢ 复合处理：两种或两种以上诱变剂同时处理、 不同的诱变剂交替处理、同一诱变剂连续处理 以及紫外线与光复活交替处理等( 注意！)
突变率/ %
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
试验号
乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果
1- 对照； 2-乙烯亚胺（浓度1:7000）； 3, 5, 7, 9-紫外线； 4, 6, 8, 10-乙烯亚胺加紫外线