小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与特征分析
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[ 1- 2]
。国内外的研究和生产实践证明,
收稿日期 : 2010-01 -06
修回日期 : 2010-04 -04
基金项目 : 国家自然科学基金 ( 30700505 ); 河北省自然科学基金 ( C2008000281) ; 河北省教育厅 ( 2009130 ) 作者简介 : 张楠 , 硕士研究生 , 主要从事分子植物病理学研究。 E-m ai: l zn. 1107 @ 163 com 通讯作者 : 王海燕 , 副教授 , 主要从事分子植物病理学研究。 E-m ai: l haiyangaofe@ i yahoo . com. cn 刘大群 , 教授 , 主要从事分子植物病理学研究。 E-m ai: l ldq@ m ai. l hebau. edu. cn
摘要 : 根据已克隆植物抗病 ( R ) 基因 NBS 保守结构域设计简并引物 , 采用 RT- PCR 和 cDNA 末端快速扩 增技术 ( RACE ), 在小麦抗叶锈病近等 基因系材料 T cL r19 中进行 抗病同 源基因 cDNA 全长的 扩增 。 获得 了 1 个 通读的 NBS 类抗 病同 源基因 S11A11 c DNA 序列 , 该序列全长 2923bp , 编码 878 个氨基酸序 列 。生物 信息学分析结果表明 , 该片段含有 N B- ARC 保守结构域 和多个 LRR 结构域 。 聚类分析表明 , S11A11 编码的 蛋白与小麦抗叶 锈病基 因 Lr1 编码的蛋 白亲缘 关系较 近 , 而 与 Lr10 亲缘 关系较远 。 半定量 RT - PCR 分析表明 , 该基因在 小麦叶片中为低丰度组成型表达 。 本研究在 T cL r19 小麦中成功获 得了抗病 基因同源序列 , 为最终克隆小麦抗叶锈病目的基因奠定了基础 。 关键词 : 小麦 ; 核苷酸结合 位点 ( NBS); 抗病基因 同源序列 ( RGA s); cDNA 末端快速扩增技术 ( RACE ); 半定量 RT- PCR
[ 12] [ 12] [ 6]
、 玉米
[ 7]
、 小麦
[ 8- 10]
百度文库、 水稻
[ 11]
、 蚕
豆 、 鹰嘴豆 等植物中分离到了许多与已知 R 基 因同源的核苷酸序列。到目前为止, 对小麦抗叶锈病 基因遗传和抗病性已进行了多方面研究, 国际上已发 现 90 余个抗叶锈病基因, 现已命名到了 Lr61
Abstract : Resistance gene hom o logy sequence from w heat w as isolated by using hom o lo gy - based m e th od . A pa ir o f degenerated pri m er w as desig ned acco rd ing to th e nucleotide bin ding site conserved dom ains o f the cloned plant d isease resistance ( R) genes. RT- PCR and RACE w ere used to obtain the full leng th sequence o f the d isease resistance hom o lo gy gene in the near isogenic lin es T cL r19 . One open - read ing NBS class of resis tance gene ana logs ( RGA s) na m ed S11A11 w as obta in ed , w hich w as 2923bp in leng th and encoded 878 am ino acids. B ioinfor m atics a nalysis show ed the deduced am ino acids o f S11A11 prote in consis ted of a NB-ARC conserved dom ain and m any leucin e - rich repeats ( LRR) dom ain s. T he phy logenetic tree ana ly sis indicated a considerab le id entity o f the prote in encoded by S11A11 w ith that of wheat leaf rust resistance gene Lr1, but a low er si m ilarity w ith Lr10. T he S11A11 gene appeared no t to be induced by Pucc in ia tr itic in a and w as a constitut iv e gene w ith low abundance in wheat lea f tissue by sem i quan tita tiv e RT- PCR. T he resistance hom o lo gy sequence w as successfully obtained in T cL r19, w hich prov id es the shortcut for clon ing of wheat leaf rust resistance gene . K ey w ord s : W hea; t Nucleotide b ind ing site ( NBS) ; R esistance gene analogs ( RGA s) ; R apid am plif ic ation cDNA end ( RACE ) ; Se mi quantitative RT- PCR 小麦 ( T riticum aestivu m L. )适应性强 , 分布广 , 是 世界上最重要的粮食作物, 由小麦叶锈菌 ( Puccinia triticina ) 引起的小麦叶锈病是影响世界小麦稳产高 产的重要病害之一, 也是影响我国小麦生产的重要因 素, 其分布范围比条锈病和秆锈病更广, 严重时可造 成 40 % 的损失
C loning and Characterization of a NBS R esistance G ene H o m ology cDNA Sequence from W heat
ZHANG N an , WANG H ai yan , L IU Da - qun
( College of P lant P rotection, A gricultural University of H ebei / B iological Contro l Cen ter of P lan tD isease and P lant P ests of H ebei P rovince, Baod ing 071001 )
[ 4- 5]
回交 6 代近等基因系小麦材料 T cL r19 ; 供试小麦叶 锈菌菌株为 07 - 10 - 421 - 3 ( FH JT ) , 该菌株对 T cL r19 表现低毒力。植物材料和病原菌均由河北农业大学 小麦锈病研究室收集保存。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 小麦叶片总 RNA 的提取与 cDNA 第一链 的合成 小麦在温室生长至一叶一心期接菌鉴定, 从抗性植株上剪取叶片提取总 RNA。 RNA 提取采 用天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司的 RNAprep pure 植物总 RNA 提取试剂盒。用紫外分光光度计检测 RNA 浓度, 琼 脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。参 考 M-MLV 酶说明书反转录获得 cDNA 第一链。 1 . 2 . 2 RT-PCR 方法分离小麦抗病基因同源片段 根据已克隆植物抗病基因 NBS 的保守结构域设 计引 物组 合 S11 : A11 ( 表 1 )。 PCR 反 应 体 系 为 25 , l 反 应 体 积 包 含 1 PCR bu ffer , 200 m o l/L dNTP, 200ng 引物 , 3 l cDNA 和 1 . 5UT aqDNA 聚合 酶。反应程 序 为: 94 预变 性 1m in ; 35 个 循环 为 94 变性 1m in , 50 退火 1m in , 72 延伸 2m in ; 最后 72 延伸 10m in ; 10 保存。
, 如核苷酸结合位点
( Nucleot id e b inding site , NBS) 、 富含亮氨酸重复 ( L eu cine - rich repeats , LRR )、 丝氨酸 /苏氨酸激酶 ( Serine th reonin e kinase , STK) 、 亮氨酸拉链 ( L euc in e zipper , LZ) 和 To ll/白细胞介素- 1受体类似结构 ( To ll/ in ter leukin - receptor si m ila rity , TI R ) 等。一系列研究表明, 存在于植物抗病基因中的保守结构域 , 为从植物中克 隆和研究植物抗病基因提供了一条经济、 快捷的途 径。依据这些保守序列设计合成简并引物, 从植物材 料中克隆抗病基因的同源序列, 再结合 cDNA 末端快 速扩增技术 ( RACE ) 获得完整的抗病候选基因。目 前, 已 在马 铃 薯
[ 13]
, 有 58
个被标记在特定的染色体上。其中, 抗叶锈病基因 [ 14] 、 [ 15] [ 16] [ 17] Lr10 Lr21 、 Lr1 和 L r 34 已被成功克隆。小麦 抗叶锈病基因 Lr19 来源于长穗偃麦草 ( Agropyron elongatum ), 定位在 7DL染色体上, 该基因是在苗期即开始 表达的全生育期抗叶锈病基因, 且抗性很强, 至今在南 非、 中国等地只有少数几个菌株对之表现毒力, 是一个 极具 应用 价 值的 主 效抗 病 基因。 2009 年, Gennaro 等 采用 NBS - profiling 的方法, 从一套含有 Lr19 的硬 粒小麦和长穗偃麦草的重组系中获得了与 Lr 19 抗病 相关基因的全长, 但并未对该基因进行定位和功能验 证, 只是从结构上推断出为 Lr19 的候选基因。 本研究拟根据已克隆植物抗病基因的 NBS 保守 结构域设计简并引物, 利用 RT-PCR 方法从抗叶锈病 小麦近等基因系材料 T cL r19中扩增抗病基因同源片 段, 通过 RACE 技术获得该基因 cDNA 全长 , 对其结 构、 表达情况进行分析, 以期为小麦抗叶锈病机制的 深入研究及最终克隆抗叶锈病基因奠定基础。
606
植
物
遗
传
资
源
学
报
11 卷
培育抗叶锈病小麦品种是防治该病最经济、 有效和安 全的途径, 而掌握优良的抗病基因资源则是实现抗病 育种突破的重要物质基础, 因此 , 加强小麦抗叶锈病 基因的研究和利用显得尤为重要。 迄今为止, 已有 60多个抗病基因分别从玉米、 拟 南芥、 番茄、 水稻、 小麦、 大麦等多种植物中获得成功 [ 3] 克隆 , 氨基酸水平比对结果表明, 这些 R 基因序列 之间具有类似的保守结构域
表 1 试验 用引物 T ab le l Sequen ce s of the pr i m ers used in th e isolation
保守氨基酸序列 C onserved dom ain s GGVGK TT( P- loop ) GLPLAL R = A /G; I= A /T /C /G 引物 Pri m er S11 A 11 引物序列 ( 5 - 3 ) Sequen ce GG IGG I G TI GG I AA I AC I AC AR I GCTAR I GG I AR ICC
植物遗传资源学报 2010, 11( 5): 605 -610 Journa l o f P lant G enetic R esources
小麦 NBS类抗病基因同源 cDNA 序列的克隆与特征分析
张 楠, 王海燕, 刘大群
( 河北农业大学植物保护学院 /河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心 , 保定 071001)
。国内外的研究和生产实践证明,
收稿日期 : 2010-01 -06
修回日期 : 2010-04 -04
基金项目 : 国家自然科学基金 ( 30700505 ); 河北省自然科学基金 ( C2008000281) ; 河北省教育厅 ( 2009130 ) 作者简介 : 张楠 , 硕士研究生 , 主要从事分子植物病理学研究。 E-m ai: l zn. 1107 @ 163 com 通讯作者 : 王海燕 , 副教授 , 主要从事分子植物病理学研究。 E-m ai: l haiyangaofe@ i yahoo . com. cn 刘大群 , 教授 , 主要从事分子植物病理学研究。 E-m ai: l ldq@ m ai. l hebau. edu. cn
摘要 : 根据已克隆植物抗病 ( R ) 基因 NBS 保守结构域设计简并引物 , 采用 RT- PCR 和 cDNA 末端快速扩 增技术 ( RACE ), 在小麦抗叶锈病近等 基因系材料 T cL r19 中进行 抗病同 源基因 cDNA 全长的 扩增 。 获得 了 1 个 通读的 NBS 类抗 病同 源基因 S11A11 c DNA 序列 , 该序列全长 2923bp , 编码 878 个氨基酸序 列 。生物 信息学分析结果表明 , 该片段含有 N B- ARC 保守结构域 和多个 LRR 结构域 。 聚类分析表明 , S11A11 编码的 蛋白与小麦抗叶 锈病基 因 Lr1 编码的蛋 白亲缘 关系较 近 , 而 与 Lr10 亲缘 关系较远 。 半定量 RT - PCR 分析表明 , 该基因在 小麦叶片中为低丰度组成型表达 。 本研究在 T cL r19 小麦中成功获 得了抗病 基因同源序列 , 为最终克隆小麦抗叶锈病目的基因奠定了基础 。 关键词 : 小麦 ; 核苷酸结合 位点 ( NBS); 抗病基因 同源序列 ( RGA s); cDNA 末端快速扩增技术 ( RACE ); 半定量 RT- PCR
[ 12] [ 12] [ 6]
、 玉米
[ 7]
、 小麦
[ 8- 10]
百度文库、 水稻
[ 11]
、 蚕
豆 、 鹰嘴豆 等植物中分离到了许多与已知 R 基 因同源的核苷酸序列。到目前为止, 对小麦抗叶锈病 基因遗传和抗病性已进行了多方面研究, 国际上已发 现 90 余个抗叶锈病基因, 现已命名到了 Lr61
Abstract : Resistance gene hom o logy sequence from w heat w as isolated by using hom o lo gy - based m e th od . A pa ir o f degenerated pri m er w as desig ned acco rd ing to th e nucleotide bin ding site conserved dom ains o f the cloned plant d isease resistance ( R) genes. RT- PCR and RACE w ere used to obtain the full leng th sequence o f the d isease resistance hom o lo gy gene in the near isogenic lin es T cL r19 . One open - read ing NBS class of resis tance gene ana logs ( RGA s) na m ed S11A11 w as obta in ed , w hich w as 2923bp in leng th and encoded 878 am ino acids. B ioinfor m atics a nalysis show ed the deduced am ino acids o f S11A11 prote in consis ted of a NB-ARC conserved dom ain and m any leucin e - rich repeats ( LRR) dom ain s. T he phy logenetic tree ana ly sis indicated a considerab le id entity o f the prote in encoded by S11A11 w ith that of wheat leaf rust resistance gene Lr1, but a low er si m ilarity w ith Lr10. T he S11A11 gene appeared no t to be induced by Pucc in ia tr itic in a and w as a constitut iv e gene w ith low abundance in wheat lea f tissue by sem i quan tita tiv e RT- PCR. T he resistance hom o lo gy sequence w as successfully obtained in T cL r19, w hich prov id es the shortcut for clon ing of wheat leaf rust resistance gene . K ey w ord s : W hea; t Nucleotide b ind ing site ( NBS) ; R esistance gene analogs ( RGA s) ; R apid am plif ic ation cDNA end ( RACE ) ; Se mi quantitative RT- PCR 小麦 ( T riticum aestivu m L. )适应性强 , 分布广 , 是 世界上最重要的粮食作物, 由小麦叶锈菌 ( Puccinia triticina ) 引起的小麦叶锈病是影响世界小麦稳产高 产的重要病害之一, 也是影响我国小麦生产的重要因 素, 其分布范围比条锈病和秆锈病更广, 严重时可造 成 40 % 的损失
C loning and Characterization of a NBS R esistance G ene H o m ology cDNA Sequence from W heat
ZHANG N an , WANG H ai yan , L IU Da - qun
( College of P lant P rotection, A gricultural University of H ebei / B iological Contro l Cen ter of P lan tD isease and P lant P ests of H ebei P rovince, Baod ing 071001 )
[ 4- 5]
回交 6 代近等基因系小麦材料 T cL r19 ; 供试小麦叶 锈菌菌株为 07 - 10 - 421 - 3 ( FH JT ) , 该菌株对 T cL r19 表现低毒力。植物材料和病原菌均由河北农业大学 小麦锈病研究室收集保存。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 小麦叶片总 RNA 的提取与 cDNA 第一链 的合成 小麦在温室生长至一叶一心期接菌鉴定, 从抗性植株上剪取叶片提取总 RNA。 RNA 提取采 用天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司的 RNAprep pure 植物总 RNA 提取试剂盒。用紫外分光光度计检测 RNA 浓度, 琼 脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。参 考 M-MLV 酶说明书反转录获得 cDNA 第一链。 1 . 2 . 2 RT-PCR 方法分离小麦抗病基因同源片段 根据已克隆植物抗病基因 NBS 的保守结构域设 计引 物组 合 S11 : A11 ( 表 1 )。 PCR 反 应 体 系 为 25 , l 反 应 体 积 包 含 1 PCR bu ffer , 200 m o l/L dNTP, 200ng 引物 , 3 l cDNA 和 1 . 5UT aqDNA 聚合 酶。反应程 序 为: 94 预变 性 1m in ; 35 个 循环 为 94 变性 1m in , 50 退火 1m in , 72 延伸 2m in ; 最后 72 延伸 10m in ; 10 保存。
, 如核苷酸结合位点
( Nucleot id e b inding site , NBS) 、 富含亮氨酸重复 ( L eu cine - rich repeats , LRR )、 丝氨酸 /苏氨酸激酶 ( Serine th reonin e kinase , STK) 、 亮氨酸拉链 ( L euc in e zipper , LZ) 和 To ll/白细胞介素- 1受体类似结构 ( To ll/ in ter leukin - receptor si m ila rity , TI R ) 等。一系列研究表明, 存在于植物抗病基因中的保守结构域 , 为从植物中克 隆和研究植物抗病基因提供了一条经济、 快捷的途 径。依据这些保守序列设计合成简并引物, 从植物材 料中克隆抗病基因的同源序列, 再结合 cDNA 末端快 速扩增技术 ( RACE ) 获得完整的抗病候选基因。目 前, 已 在马 铃 薯
[ 13]
, 有 58
个被标记在特定的染色体上。其中, 抗叶锈病基因 [ 14] 、 [ 15] [ 16] [ 17] Lr10 Lr21 、 Lr1 和 L r 34 已被成功克隆。小麦 抗叶锈病基因 Lr19 来源于长穗偃麦草 ( Agropyron elongatum ), 定位在 7DL染色体上, 该基因是在苗期即开始 表达的全生育期抗叶锈病基因, 且抗性很强, 至今在南 非、 中国等地只有少数几个菌株对之表现毒力, 是一个 极具 应用 价 值的 主 效抗 病 基因。 2009 年, Gennaro 等 采用 NBS - profiling 的方法, 从一套含有 Lr19 的硬 粒小麦和长穗偃麦草的重组系中获得了与 Lr 19 抗病 相关基因的全长, 但并未对该基因进行定位和功能验 证, 只是从结构上推断出为 Lr19 的候选基因。 本研究拟根据已克隆植物抗病基因的 NBS 保守 结构域设计简并引物, 利用 RT-PCR 方法从抗叶锈病 小麦近等基因系材料 T cL r19中扩增抗病基因同源片 段, 通过 RACE 技术获得该基因 cDNA 全长 , 对其结 构、 表达情况进行分析, 以期为小麦抗叶锈病机制的 深入研究及最终克隆抗叶锈病基因奠定基础。
606
植
物
遗
传
资
源
学
报
11 卷
培育抗叶锈病小麦品种是防治该病最经济、 有效和安 全的途径, 而掌握优良的抗病基因资源则是实现抗病 育种突破的重要物质基础, 因此 , 加强小麦抗叶锈病 基因的研究和利用显得尤为重要。 迄今为止, 已有 60多个抗病基因分别从玉米、 拟 南芥、 番茄、 水稻、 小麦、 大麦等多种植物中获得成功 [ 3] 克隆 , 氨基酸水平比对结果表明, 这些 R 基因序列 之间具有类似的保守结构域
表 1 试验 用引物 T ab le l Sequen ce s of the pr i m ers used in th e isolation
保守氨基酸序列 C onserved dom ain s GGVGK TT( P- loop ) GLPLAL R = A /G; I= A /T /C /G 引物 Pri m er S11 A 11 引物序列 ( 5 - 3 ) Sequen ce GG IGG I G TI GG I AA I AC I AC AR I GCTAR I GG I AR ICC
植物遗传资源学报 2010, 11( 5): 605 -610 Journa l o f P lant G enetic R esources
小麦 NBS类抗病基因同源 cDNA 序列的克隆与特征分析
张 楠, 王海燕, 刘大群
( 河北农业大学植物保护学院 /河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心 , 保定 071001)