低压层析系统
2011-AKTAavant-1103新一代全自动智能蛋白纯化系统
方法编辑器（Method Editor）
Method Editor包含所有用于控制层析运行的操作说明。 在UNICORN 6中，改进的Method Editor 具有一个用户友 好的界面用于促进方法的编辑和运行参数的查看。图5 显示Method Editor 的一个屏幕截图，具有一个自定义的 窗格提供全面的运行概括。
• 可以识别每根层析柱及其运行历史数据，提供可追溯 性，保障凝胶操作的安全性；
• 集成半导体制冷的组分收集器，可以保护纯化的样品 活性；
• BufferPro自动在线缓冲液配制功能减少了用于缓冲液 混合和手动滴定所需要的时间，提高您的工作效率和 产出；
• UNICORN 6采用可视化程序编辑界面用于直观和灵活 的方法编辑，并能够在不同纯化规模的ÄKTA avant上 进行方法转换，直观而轻松完成制备规模的线性放 大。
• 电导检测器：测定缓冲液和样品的电导用于在线监测 真实的梯度。电导检测器具有一个整合的温度传感器 用于监测温度。温度改变能够导致电导改变，但整合 的温度传感器校正并减小了这种偏离。
• pH检测器：连续测定缓冲液和样品的pH。pH电极被 整合到pH阀门内，且内置式校正端口可以方便地在位 校正而无需取出pH电极。
A)
ϓρᐾ㼕ᦧ ᭭ᅾ
̯҂ࡅ⮳ ㏳ܵᩥ䯵
ጔڦム 䒛䨰
B)
⌦ष
ᵦৰ∤
๖⮳㑂ۡ⋡㒝ᩭࡩ Ԍ៓≰䌞⮳ 䬗∤Ԍ៓Ⰵ
≰䌞䓿㵻ὐಆӖ䲑 ᵦৰᩭ㒝
UVᷯ≺ ⩤ᄫᷯ≺ pHᷯ≺
㈪㐎∤
泵
所有ÄKTA avant的系统泵和样品泵都是基于市场上广为 人知的ÄKTAexplorer™技术的升级。它们坚固的结构不 管在低反压或高反压均可提供可重现的稳定流速，允许 快速分离和使用现代化可放大的高流速层析填料。图2B 显示ÄKTA avant流路侧示意图和泵的位置。系统泵和样 品泵上各连接有一个压力传感器连接以监测在线压力。
低压液相层析色谱技术
▪ 超滤或减压薄膜浓缩法将样品浓缩到一定体积后，再 上第二次柱。
十一、凝胶的再生及保存
▪ 1、再生(一般无需做再生处理)
用过的凝胶经0.5M的NaOH(含0.5M的NaCI)混合液 浸泡
当污染严重时用0.5MHCl做短暂处理
▪ 2、防霉 ▪ 0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷
▪ 一般使其与起始缓冲液有相同pH，低的离子强度和尽可 能小的体积。
▪ 预处理可酌情用超滤法、透析法和凝胶过滤法等进行浓 缩和脱盐，样品中的不溶物在上样前用离心法或过滤法 除去。
2．加样方法
▪ 有3种方法可将样品加到已制备好的柱顶： ▪ 1.简单的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心
地用移液管加样；
▪ 层析柱的形状，一般直径 与高度的比为l：15为宜。
▪ 柱形必须根据层析介质和 分离目的而定。
▪ 待分离物质的性质相近， 柱越细长， 则分离效果越 好，但流速较慢。
▪ 在样品组分并不复杂的情 况下，采用“矮胖柱”。
三、平衡
▪ 层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pH和离子强度，一 般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于3-5 倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好的柱必须 均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交换剂沉积表面十分平坦。
层析系统连接示意图
1．密封橡皮塞；2．恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5．可调蜾旋夹；6. 自动收集器； 7.核酸一蛋白质检测仪
2、GE AKTA systems
AKTA prime
AKTA explorer
AKTA FPLC
3、Bio rad systems
二、柱层析法的一般技术
蛋白A亲和层析介质
蛋白A亲和层析介质（征求意见稿）编制说明《蛋白A亲和层析介质》国家标准起草工作小组二〇一九年一月《蛋白A亲和层析介质》国家标准编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会专项《国家质量基础的共性技术研究与应用》项目《生物产业共性技术标准研究》中课题《海洋生物产品质量控制与检测技术标准研究》，项目编号“2016YFF0202304”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2019年完成。
本标准起草工作组由中国科学院过程工程研究所等单位共同组成。
二、目的和意义单抗药物对生产制造纯化工艺的效能和成本要求非常高，单抗分离纯化成本占其生产总成本的50-70%，其中蛋白A亲和层析介质是其生产的关键原材料之一，其性质和成本将决定单抗产品的最终生产成本、纯度和收率。
目前，80%以上的抗体纯化使用蛋白A 亲和层析。
蛋白A亲和层析介质的载量、稳定性等是单抗纯化选择介质时的首要考虑。
蛋白A来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体分子Fc段特异性结合的结构域。
将蛋白A偶联至基质上（以琼脂糖基质为主）制成蛋白A亲和层析介质，可以与抗体特异性结合，选择性极高，一步亲和层析可达到95%以上的纯度。
蛋白A 亲和层析因特异性强、操作简单、处理量大等优势，已成为抗体药物研发和生产阶段的核心纯化步骤。
蛋白A亲和层析介质作为单抗药物生产过程的关键分离材料之一，其性质和成本决定单抗产品的最终纯度、收率和生产成本。
我国当前尚未建立相应的国家及行业标准，国内市场上的蛋白A亲和层析介质产品质量良莠不齐，缺乏产品生产、检验和质量规范。
这在一定程度上限制了我国蛋白A亲和层析介质的发展及相关层析技术的应用，更阻碍了国内单抗产业的发展水平。
因此建立蛋白A亲和层析分离介质的国家标准，对于规范蛋白A亲和介质行业，推进层析技术应用，以及促进单抗产业发展，均具有重要的理论和现实意义。
目前，蛋白A亲和层析介质的性能参数测定方法多种多样，以动态载量测定方法为例，一种是将介质装柱并连在层析仪上，平衡，上样抗体，待流出液浓度与上样浓度相等时上样结束，依次经淋洗、洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液体积及洗脱液浓度，计算洗脱载量。
低压液相层析(色谱)技术
1952年，英国科学家阿瑟·迪克 提出了薄层色谱法，利用硅胶 作为固定相，提高了分离效率 和分辨率。
此后，随着技术的不断发展， 液相色谱法逐渐成为一种常用 的分离和纯化技术，广泛应用 于化学、生物、医药等领域。
02
低压液相层析(色谱)技术 应用
在生物制药领域的应用
分离纯化蛋白质、多肽、核酸等生物大分子
营养成分分析
色谱技术可以用于食品中维生素、矿 物质等营养成分的分离和测定，为食 品营养价值评估提供依据。
在环境监测领域的应用
污染物分析
色谱技术可用于环境样品中有机污染物、重金属等的分离和测定，为环境监测 和污染治理提供技术支持。
水质检测
通过色谱技术可以对水体中的有害物质进行检测，确保水质的安全和符合标准。
该技术利用不同物质在两相间的分配系数差异，使不同物质 在两相之间进行反复的吸附和解吸，从而达到分离的目的。
技术原理
低压液相层析（色谱）技术的原理基于不同物质在固定相和流动相之间的分配系数 不同，导致它们在两相之间的迁移速度不同，从而实现分离。
在色谱过程中，固定相通常是一种固体物质，如硅胶或聚合物，而流动相则是一种 液体，如水、有机溶剂等。
适用范围广
该技术适用于各种不同类型的 化合物，如有机物、无机物、 离子、分子等，具有广泛的适 用性。
分离效果好
通过调整流动相和固定相的比 例，可以实现不同组分的分离 ，分离效果良好。
操作简便
低压液相层析(色谱)技术操作简 便，易于自动化和集成化。
技术缺点
01
对样品要求高
该技术要求样品具有良好的溶解 性和稳定性，对于一些难溶或不 稳定的样品分离效果不佳。
在化学分析领域的应用
有机化合物分析
层析系统操作方法
层析系统操作方法
层析系统是一种高效的分离、纯化、分析化合物的方法。
其操作方法如下：
1. 样品的制备：将待分析的化合物或混合物溶解或悬浮于适当的溶剂中，以备注入样品进样口。
2. 进样：将样品注入样品进样口。
通常，进样口位于柱子的顶部或侧面，具体位置根据不同型号的层析柱而定。
3. 选择移动相：选择适当的移动相。
通常有两种移动相，一种是常规液相，另一种是气相。
4. 开始层析：开启泵，让移动相流经层析柱，分离化合物。
移动相会使得不同化合物在柱子内产生不同的扩散速度，从而分离。
5. 收集分离后的化合物：化合物随着移动相流出层析柱，通过检测器进行检测并记录。
对于需要进一步分析的化合物，可以通过收集样品进行后续的调查研究。
6. 停止层析：关闭泵，停止层析操作，清洗设备。
需要注意的是，在进行层析操作之前，需要根据不同的化合物选择不同的适宜移动相，从而实现更好的分离效果。
低压层析系统
4/28/2021
4
层析法
4/28/2021
5
层析法
吸附层析 是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同 而达到分离目的的一种层析技术。
e) 单击工具栏
按钮，可计算所选收集峰的相
关数据。方法如下：
用纵向两根棕色线确定收集范围：
点击左边一根棕色线，移至收集起始点，点击；
点击右边一根棕色线，移至收集结束点，点击。
用纵向两根绿色线确定收集峰峰宽：
点击左边一根绿色线，移至收集峰的起始点，点击；
点击右边一根绿色线，移至收集峰的结束点，点击。
用横坐标上一根紫色线确定收集峰的基线：
4/28/2021
14
HHDD-5-电5电脑脑紫紫外外检监测测仪仪-5
使用方法：
一、 校对仪器工作状态 1. 选定检测波长： 从有机玻璃盒中取出干涉滤光片（250nm或 280nm），插入仪器正面“滤光片”下方小长方孔内，并使其插入到 底部位置（插入时应注意使干涉滤光片侧面有一直径为3mm的半球形 凹槽朝上）。 2．按下“电源开关”（在仪器后背板上），仪器预热20分钟，以便 得到较好的稳定性。 3. 校对T﹪～A a）. 按下按键开关“Ｔ”键，“透过率T”指示灯亮。调节“调T” 旋钮（顺时针调节透过率增大），使数字显示100，此时 透过率T为100% 。 b). 按下按键开关“1A”键，“吸光度A”指示灯亮，调节 “A调零”旋钮，使数字显示000，此时吸光度A为零。
4/28/2021
MPLC 中低压制备
紫外检测器-高吸光度的优势
示差折光检测器 RI-31
示差折光检测器 偏转型示差折光计 通用型检测器 基线稳定速度快 在高流速下，基线亦不受流 速影响
馏分收集器
多种收集模式，包括时间模式、峰模式、峰&斜率模式、手动模式，可根据实验需 要选择，并可在实验过程中随时更改 灵活的X-Y型收集手臂，可从任意位置开始收集 清洗功能，方便每次实验后针口的清洗，避免样品结晶造成堵塞 多种规格试管架可选，满足不同用户需要
MPLC的发展历史
有机化学杂志（The Journal of Organic Chemistry）于1978年首先刊载了哥 伦比亚大学化学系克拉克.斯蒂尔博士，迈克尔.卡恩博士和阿比希特.米特 拉博士的《中度分离度的快速色谱技术在制备纯化中的应用》一文，详细 介绍了当时刚诞生不久的快速加压色谱技术对比于传统依靠重力作用柱色 谱的巨大优势。 罗马尼亚化学家米切亚.乔吉乌等随后以斯蒂尔博士的研究成果为蓝本，根 据大量实验数据分步骤归纳了快速色谱实施的整个实验过程及各个注意事 项，精细到填料和溶剂选用，洗脱时间表等。
样品点在距展开剂液面 10 mm 处, 展开 30 mm 。建议使用 28 x 73 x 80 mm规格的层 析缸。
30 mm
10 mm
智能化软件的使用步骤
最佳流速 平衡时间
选择色谱柱
输入Rf值和TLC条件，帮 助建立方法
智能化软件-实验结果预测
洗脱程序
根据洗脱程序的 变化，标示目标 化合物出峰位置 的黄色箭头也会 随之变化。用户 可清楚预见目标 化合物的出峰位 置，更好的帮助 分离方法建立。
溶剂输送泵
•陶瓷柱塞旋转输液，不依赖单向阀，防止溶剂 交叉污染，方便维护 •安全耐用。不止是普通的有机溶剂，即使是用 于反相系统的氨水、四氢呋喃、酸性、碱性溶 剂等不会影响仪器的性能及安全使用 •电磁阀控制比例，流量精度高 •耐磨损，高硬度 •优于钢材的强度和耐冲击性 •耐高温、低温
离子交换层析
子构成的!!基质与电荷基因以共价键连 接!!电荷基因与反离
子以离子键结合？？
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以
离子交换方式进行!!假设以RA+代表阳离子交换剂!!其中A+为
反离子!!A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应!!反
应式为：RA++B+
RB++A+
离子交换色谱中所进行的离子交换过程【以阳离子交换树脂为例】
㈡ 交联度和网孔结构
交联度的大小影响着离子交换剂的很多特 性!!包括机械强度、膨胀度、网孔大小、 交换容量等？？
一般交联度越高!!网孔的孔径越小!!交联度 越低!!网孔孔径越大？？仅琼脂糖交换剂 是例外.
㈡ 交联度和网孔结构
分离介质的孔有三种结构？？第一种通过交联 使大分子链间形成孔!!这叫凝胶孔？？
离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机 离子或生物大分子物质分开!!其主要依据是离子交换剂对 各种离子或离子化合物有不同的结合力？？
氨基酸的离子交换分离原理
8
What happens in ion exchange?
Equilibration
anion exchange
bead
+-- ++--+++---
两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离 子交换剂的结合力!!主要取决于它们的物理化学性质和在 特定pH条件下呈现的离子状态？？当pH低于等电点【pI】 时!!它们带正电荷能与阳离子交换剂结合!!反之!!pH高于 pI时!!它们带负电荷能与阴离子交换剂结合 ？？pH与pI 的差值越大!!带电量越大!!与交换剂的结合力越强？？
生物大分子分离纯化-原理与技术
35精品课件
2020/8/16
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的特点：
1. 层析柱规模很大，实验室1.0-2.5×30-100cm，工艺10－20×200cm，从 而设备成本很高；
2. 上样体积少，必须少于柱床体积的3％才能达到较好的分离效果，如果 大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；
2020/8/16
凝胶过滤层析
凝胶的选择
Bio-Gel P4(800-4,000) for separation digested products from IgG
27精品课件
2020/8/16
凝胶的选择
Bio-Gel P6(1000-6000)
凝胶过滤层析
28精品课件
2020/8/16
凝胶的选择
largemoleculesleavethecolumnfirstfollowedbysmallermoleculesinorderofsizemoleculeslargerthanthematrixporespassstraightthroughdiffusionbufferdiffusionintotheporesdiffusionoutoftheporesbuffer凝胶过滤2320171128凝胶过滤层析分离纯化原理2420171128agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95water凝胶结构2520171128stericexclusionleadstoearlyelution?按照分子量大小洗脱?大分子首先洗脱最小的分子在最后面洗脱2620171128100100010000100000biogelp2biogelp4biogelp6biogelp10biogelp30biogelp60biogelp1001800800400010006000用于脱盐1500200002500400003000600005000100000100凝胶过滤层析凝胶的选择2720171128biogelp48004000forseparationdigestedproductsfromigg凝胶过滤层析凝胶的选择2820171128凝胶过滤层析biogelp610006000凝胶的选择2920171128凝胶过滤层析biogelp10150020000凝胶的选择3020171128凝胶过滤层析bioscaleminibiogelp6脱盐预装柱?操作方便可连接在duoflowlpprofinia和econo泵上3120171128biobeadssx介质多孔的聚苯乙烯二乙烯微球体biobeadssx1biobeadssx3600biobeadssx81000biobeadssx12400高分辨率亲脂性分子排阻色谱200014000中草药和天然产物活性成分分离纯化高分辨率快速纯化酯类芳香族多环杂环化合物高分辨率快速纯化酯类芳香族多环杂环化合物介质可兼容苯甲苯二甲苯四氯化碳二甲基甲酰胺酮二氯甲烷二氯代苯全氯乙烯等有机溶剂介质可兼容苯甲苯二甲苯四氯化碳二甲基甲酰胺酮二氯甲烷二氯代苯全氯乙烯等有机溶剂凝胶过滤层析32201711281三硬脂酸甘油酯8912三肉豆蔻酸甘油酯7293三月桂酸甘油酯
蛋白层析系统
蛋白层析系统
蛋白层析系统是一种常用的蛋白质分离和纯化技术。
它基于蛋白质在化学或物理条件下的差异而实现分离纯化的目的。
蛋白质层析系统通常包含以下几个主要组成部分：
1. 高效层析柱：蛋白质样品通过柱状填料进行分离。
填料通常是多孔性固体材料，如海洛因、DEAE、Octyl-Sepharose等。
填料的选择和操作条件是根据目标蛋白质的性质和纯化要求来确定的。
2. 缓冲液系统：用于保持适宜的pH值和离子强度，以确保蛋白质在层析柱中具有最佳的亲和性和分离度。
缓冲液系统通常包括运行缓冲液、平衡缓冲液和洗脱缓冲液，其配方也需要根据具体需要进行调整。
3. 层析设备：用于控制流速、压力和温度等操作参数。
常见的层析设备包括高压液相层析仪（HPLC）、低压液相层析系统（FPLC）和手动操作的层析设备。
4. 蛋白检测系统：用于检测和监测层析柱流出液中的蛋白质含量。
常见的检测方法包括紫外光谱、荧光标记和蛋白质浓度测定等。
蛋白层析系统的操作步骤通常包括样品预处理、层析柱平衡、样品加载、洗脱和回收等。
不同的层析技术还可以结合其他分离方法，如亲和层析、离子交换层析、尺寸排除层析等，来实现更精确的纯化目标。
蛋白层析系统广泛应用于生物医药研究和生产中，可以从复杂的混合物中高效地纯化目标蛋白质，满足药物研发、蛋白质结构分析和生物学功能研究等领域的需求。
层析系统的工作原理
层析系统的工作原理
哎呀呀，说起层析系统，这可真是个神奇又复杂的东西呢！
就好像我们在学校里分小组一样，层析系统也是在给各种东西“分小组”。
比如说，它能把混合在一起的不同成分分开，就像老师把调皮的同学和乖巧的同学分开一样。
想象一下，有一堆五颜六色的糖果混在一起，有红色的、绿色的、黄色的。
我们想要把它们按照颜色分开，是不是得有个办法？层析系统就像是我们的神奇小帮手。
它是怎么做到的呢？其实啊，它就像一个超级聪明的裁判。
在一个长长的管道或者板子上，各种成分开始了它们的“比赛”。
这些成分就像参加跑步比赛的运动员，它们跑的速度可不一样！有的跑得快，有的跑得慢。
为什么会这样呢？这是因为它们和层析系统这个“赛道”的关系不一样。
比如说，有的成分和“赛道”关系好，就像好朋友手拉手，走得就慢；有的成分和“赛道”关系不太好，就像陌生人，一下子就跑远啦。
然后呢，随着时间的推移，这些成分就一个一个地被分开了。
这难道不神奇吗？
再打个比方，就像一群小朋友去游乐场玩不同的项目。
有的喜欢坐旋转木马，慢悠悠地转；有的喜欢坐过山车，风驰电掣地跑。
最后，大家就自然地分开在不同的地方啦。
在实验室里，科学家们经常用层析系统来搞清楚各种复杂的混合物。
比如说，研究药物成分的时候，看看里面到底都有啥。
你说，如果没有层析系统，那得多麻烦呀？是不是根本搞不清楚那些复杂的东西到底是由啥组成的？
所以说呀，层析系统可真是个超级厉害的工具，帮助我们解决了好多难题呢！
我的观点就是：层析系统真的太重要啦，它就像一个神奇的魔法，让复杂的混合物变得清晰明了！。
AKTAbasic层析系统操作入门
AKTAbasic层析系统操作入门为使用户在较短时间内尽快了解AKTA系列层析系统的功能和基本操作，特编写此操作入门。
若需进一步了解详细内容，可参阅相应的组件、系统和软件说明书。
一系统组件及系统功能介绍1 系统组件(1) 泵 Pump系统泵：(system pump)双泵（A、B泵），缓冲液及大体积样品输送。
上样泵：(sample pump)样品输送。
(2) 阀 Valve七通阀：(INV-907)两个。
1. 上样阀(sample valve)，用于上样环切换 (load/inject) 和系统泵清洗时废液管 (waste) 切换；2. 流向切换阀(flow direction valve)，用于层析柱流向切换(downflow/upflow)。
(4) 其它组件梯度混合器(mixer)、紫外检测仪(UV-900) 。
2 系统功能系统功能由上述各组件相互配合，协同工作。
(1) 缓冲液pH及梯度配制(a)梯度制备 (Gradient)A、B泵分别放置A、B液，由A、B泵的流速变化产生梯度。
(2) 层析柱柱顶连接进样（七通）阀1号口，柱后连接紫外流通池。
(3) 上样上样阀上样：将样品储存在样品环(Sample loop)，再由阀门切换将样品带入层析柱；系统泵上样：由系统泵将样品泵入层析柱。
(4) 收集 (选购)收集器收集：设置收集体积(Frac size)，可自动按条件收集。
二开机程序1 开启电脑；2打开AKTAbasic电源；3启动UNICORN软件，输入用户名( User name) 和密码(Password)，默认用户(default) 密码为 default，待AKTA自检结束后，在system control窗口中显示系统准备就绪（Instruments are ready) 。
三 UUNICORN 软件简介Unicorn软件启动后共有四个窗口，其主要功能分别如下：Main: 1. 系统关闭(Quit Program)和退出、登陆(Log on/off)；2. 系统管理的设定，如用户名、密码、文件和使用权限等设定，系统日志等；3. 文件管理，如文件拷贝、移动、删除及压缩拷贝到磁盘等；4. 方法组编辑(MethodQueues)，将几个方法组合在一起，依次运行。
溶菌酶的提取,分离纯化,产物纯度鉴定及活性测定
溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。
离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。
由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。
该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。
《低压层析系统》课件
低压层析系统是一种用于分离和分析样品混合物的重要工具。本课件将介绍 低压层析系统的定义、特点和优点。
什么是低压层析系统
低压层析系统定义
低压层析系统是一种用于分离和鉴定复杂混合物中化合物的技术。
低压层析系统的特点
低压层析系统具有操作简单、分离来自果好、分析速度快等特点。低压层析系统的优点
数据处理方法
2
测器输出的信号。
数据采集系统可以进行峰识别、峰面积计算
等数据处理操作。
3
数据分析
通过分析数据可以得到样品中化合物的结构
数据结果的输出
4
和含量等信息。
数据采集系统可以将分析结果输出为图表、 报告等形式。
检测器
检测器的种类
常见的检测器包括紫外 检测器、荧光检测器等。
检测器的选择
选择检测器要考虑检测 灵敏度、选择性和稳定 性等因素。
检测器的原理
不同的检测器基于不同 的物理原理来进行检测。
检测器的灵敏度
灵敏度是评价检测器性 能的重要指标。
数据采集系统
1
数据采集方式
数据采集系统可以通过计算机连接和记录检
3
进样精度
进样系统的精度影响色谱分离的准确性。
进样方法
4
可以采用静态进样、动态进样等不同的进样 方法。
色谱柱
色谱柱的组成
色谱柱由填料和柱壁组成。
色谱柱的选择
色谱柱的选择要考虑需要分离的化合物特性和分离 效果。
柱效的评价
通过评价分离效果和分离能力来判断色谱柱的好坏。
色谱柱的保养
定期保养色谱柱可以延长其使用寿命并保持良好的 分离效果。
低压层析系统具有易于操作、成本低廉、分析结果准确等优点。
GE中低压层析柱 柱效测定方法 详解
GE中低压层析柱柱效测定方法柱效测定是一项经常使用的操作，对于定量表征层析柱的工作状态是否良好，工艺的验证具有重要的意义。
但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者测出来注销过低的状况，不知道如何解决。
所以今天我就给大家详细介绍一下柱效的正确测定方法，以及经常遇到的问题如何解决。
本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。
介绍分为5个部分，测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常发生的问题。
1. 测前准备：⑴ÄKTA层析设备。
要求设备的型号与层析柱大小匹配，从上样阀门到紫外和电导检测器之间的体积要做到最小（管路内径尽量细，管路尽量短），这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。
⑵测试平衡溶液及样品。
这个部分在试剂选择中单独细说。
⑶装填好的层析柱。
使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV（柱体积），平衡方向与测柱效方向必须一致⑷样品环。
容积大于1%柱体积。
2. 试剂选择测柱效主要有两种测试系统：1 NaCl 测试系统；2 丙酮测试系统。
只要操作正确，两个系统测出来的结果是基本一致的。
但是要注意：各试剂的浓度不能随意改变，否则影响测试结果。
⑴NaCl测试系统对于所有种类的柱子和填料，都可以使用氯化钠系统测柱效平衡液： 0.4 M NaCl水溶液样品： 0.8 M NaCl水溶液3. 测柱效操作测柱效全程使用30 cm/h线性流速。
平衡层析柱至少1.5 CV，将1% CV的样品（NaCl或丙酮）注射进入层析柱，使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出现响应峰。
4. 测试结果积分以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作（各UNICORN版本操作基本一致）。
以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线，以丙酮系统测柱效的所有操作针对UV 280曲线（手头没有测柱效结果，所以随便找了一个图，里面有两个峰。
大家测柱效的结果只有一个峰）1) 在Evaluation窗口中打开测柱效结果文件，在Curve窗格中点击右键，选择Customize2) 勾选复选框去掉不需要显示的曲线3)在工具栏中点击峰积分按钮，进行积分处理或者在Integrate下拉菜单中点击Peak Intergrate进行积分处理4) 选择需要积分的曲线以及积分表存储位置，基线类型默认为Calculatebaseline5) 在积分窗口中点击Peak Window，出现以下窗口，通过拖动左右两条直线可以选择需要进行积分的范围，点击OK确认6) 在积分窗口点击Reject Peaks对需要分析的色谱峰可进行高级定义，包括最小峰高、峰宽、峰面积、峰个数等，在这里最常用的是在Peakarea is less than输入需要显示的最大峰的个数，点击OK确定7) 在Column height (bed height)一栏中输入柱床高度，在柱效测定中此项必须填写8) 点击积分窗口中Save and Edit Peak Table按钮，可以对峰进行高级操作9) 点击积分窗口中的OK，查看积分结果10) 在Peak data区域点击右键，选择Customize 在Select peak table columns对话框中找到需要显示的数据， plate height（HETP）、Asymmetry 等，点击OK执行。
低压正相层析柱
低压正相层析柱（low pressure normal phase chromatography column）是一种常用的色谱技术，适用于分离和纯化有机化合物。
它采用正相色谱模式，其中静相是极性的，与待分离的化合物具有亲和力。
低压正相层析柱通常由玻璃或不锈钢制成，内部填充有吸附剂，例如硅胶或氨基硅胶。
这些吸附剂具有较高的极性，在与待分离化合物发生相互作用时能够实现有效的分离。
使用低压正相层析柱进行实验时，样品会通过柱床，根据其与静相的相互作用而被分离。
在柱床中，非极性化合物会快速流过，而具有极性的化合物则会慢慢通过，实现了它们之间的分离。
为了实现更好的分离效果，可以调整试验条件，如改变溶剂系统、流速和温度等。
此外，还可以根据目标化合物的特性选择合适的吸附剂和柱型。
总之，低压正相层析柱是一种常用的色谱技术，通常用于有机化合物的分离和纯化。
它可以根据待分离化合物与静相之间的极性相互作用来实现有效的分离，并且具有较低的操作压力要求。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
19/06/2020
6
层析柱分类
层析柱 是柱色谱中的主体之一，一般用玻璃管或有机玻 璃管。 层析柱产品品种: 1、普通层析柱（柱内压增加1-2巴） 2、中压特制玻璃层析柱(带转换接头)（柱内压增加5-7巴） 3、高压水冷夹套层析柱(带转换接头)（柱内压增加5巴左右） 4、大型有机玻璃柱（带分布系统）（柱内压小于0.5巴） 5、有机玻璃层析柱(带转换接头) （柱内压小于0.5巴） 6、有机玻璃层析柱(带转换接头) （柱内压增加2-3巴）
5. 用键盘“Home（放大）”和“End（缩小）”键调节洗 脱谱图在电脑屏幕上的大小。
6. 确定基线： 调节“调T”旋钮，确定基线位置。为防 止系统出现负漂移，基线通常调节在大于零的位置上，如满 量程的十分之一。读取A值时注意扣除此数值。
7. 确定好基线位置后，即可上样（特别注意上样后切勿 再改变基线位置）。当洗脱样品流过检测仪时，电脑ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ可绘 制出样品吸光度A随时间h变化的图谱。
19/06/2020
7
层析柱
19/06/2020
8
层析柱规格（上海沪西）
19/06/2020
9
BT-100恒流泵
产品名称
型号
外形尺寸 长×宽×高
主要技术参数
窗体顶端
恒流泵（易装 型）
窗体底端
BT-100
160×270×1 80
输出通道：单通道 输出流量：1-6800 ml/h 输出压力：≥2.5 kg/cm2
19/06/2020
20
分布收集器
19/06/2020
21
分布收集器
19/06/2020
22
分布收集器
型号
外形尺寸
长×宽× 高
主要技术参数
重 量
（Kg）
产品名称
收集试管：100支，每 支最大容量：12ml
BSZ- 335×255 定时收集范围：1秒—
100
×340 24小时，任意选择
8.5
断电数据保存功能，保 存时间：十年
蛋白检测系统”界面后，按以下步骤操作： 选择“直接运行或本机安装”/ 检测操作 / 采集COM1 / 保
存（默认文件名为当前日期）/ 洗脱谱图选择 / 吸光度 （默认状态为1A） / 记录速度（默认状态为10个小时）。
19/06/2020
17
HHDD-5-电5电脑脑紫紫外外检监测测仪仪-8
三、 直接与电脑连接检测、绘制、打印、保存样品分离图谱及计算有关数据。
e) 单击工具栏 按钮，可计算所选收集峰的相 关数据。方法如下：
用纵向两根棕色线确定收集范围： 点击左边一根棕色线，移至收集起始点，点击； 点击右边一根棕色线，移至收集结束点，点击。 用纵向两根绿色线确定收集峰峰宽： 点击左边一根绿色线，移至收集峰的起始点，点击； 点击右边一根绿色线，移至收集峰的结束点，点击。 用横坐标上一根紫色线确定收集峰的基线： 点击紫色线，移至收集峰基线，点击。 完成上述选择后，界面右上方将显示收集峰的相关数据。 10. 双击谱图上任意一点，可显示该点A值或T% 值。 11. 在菜单“设置”中，可选择实验日期是否打印。 12. 在菜单“窗口”中，可选择二个层析谱图的排列方式。
19/06/2020
2
❖ 恒流泵 ❖ 层析柱 ❖ 紫外监测仪 ❖ 分布收集器 ❖ 核酸蛋白检测系统
中低压层析系统
19/06/2020
3
层析法
层析法 是目前广泛应用的一种分离技术，是生物化学 、分子生物学其
它学科领域有效的分离分析工具之一。
层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层 析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固 体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。 当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性 质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同， 在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地 在两相中进行再分配。
19/06/2020
13
HHDD-5-电5电脑脑紫紫外外检监测测仪仪-4
主要技术指标：
1. 检测波长：220 nm 254 nm 280 nm 340 nm 2. 流动式样品池：容积100 ul 3. 最大流量：10 ml / min（特殊需要可另配） 4. 配接记录仪信号：0 - 10mV 5 .可直接连接电脑检测绘制样品分离图谱 6 使用环境温度：0 - 30ºC 7. 工作时间：连续 8. 电源：220 AC 20 W 9. 保险丝：BGXP-1 1 A
19/06/2020
16
HHDD-5-电5电脑脑紫紫外外检监测测仪仪-7
三、 直接与电脑连接检测、绘制、打印、保存样品分离图谱及计算有关数据。
1． 将仪器后背板“接电脑”插口与电脑COM1串行口用随机配置 的连接线相接。
2. 按使用方法“一、”校对仪器工作状态。 3. 将吸光度量程2A～0.05A置任意档（勿置于T档）。 4. 层析系统准备就绪后开启电脑,插入光盘，待自动出现“核酸
重量 （Kg）
5
19/06/2020
10
HD-5电脑紫外监测仪-1
产品名称
型 号
外形尺寸 长×宽×高
主要技术参数
重量 （Kg）
波 长：220、254、280、340nm
（数显）
电脑紫外检测
光 程：4mm； 样品池：80ul
仪 （电脑数据采
HD-5
298×210×13 0
量 程：0-100%T、0-2A 自配电脑：可实现绘图、保存、
中低压层析系统
主讲人：彭元鸿
19/06/2020
1
中低压层析系统
• 流量
输出流量：1-6800 ml/h
• 波长
220、254、280、340nm
• 定时范围 • 收集容量 • 温度范围
1s-24h 12ml×100 0-30℃
• 配置
蠕动泵、三支层析柱、（仪器车）层 析柜、紫外检测仪、自动部分收集器、 电脑采集器。（电脑自配）
7
集）
数据分析和计算
系统要求：
WIN2000/XP/VISTA/WIN7操作系统
19/06/2020
11
HHDD-5-电5电脑脑紫紫外外检监测测仪仪-2
19/06/2020
12
HHDD-5-电5电脑脑紫紫外外检监测测仪仪-3
HD-5电脑紫外检测仪是应用于液相色谱中具有紫外 吸收物质（蛋白、核酸、多肽、酶）的检出仪器。该仪 器与层析柱、恒流泵、部分收集器及电脑或记录仪配套， 可组成一个完整的液相色谱分离分析装置。在柱层析分 离分析过程中，洗脱液流过该仪器样品池，电脑或记录 仪即可自动绘制出样品分离的图谱（吸受峰或透过峰）， 同时可检测出所需样品在部分收集器试管中的分布情况， 并随时监测柱层析过程，特别是在摸索实验过程中，及 时改变洗脱条件，以便迅速取得最佳实验方案。
19/06/2020
15
HHDD-5-电5电脑脑紫紫外外检监测测仪仪-6
二、 配接记录仪检测绘制样品分离图谱
1. 连接检测仪和记录仪： 连接线有金属插头的一端接在检测仪 后4背.确板定“好接基记线录位仪置”后插，口即上可，上（样此（插特口别输注出意信上号样可后同切时勿输再出改给变部基分 收线集位器置作）为。控当制洗信脱号样）品另流一过端检“测黑仪”时“，红记”录两仪个即接可线绘叉制分出别样接品在吸记 录光仪度“AL随”时“间H”h变两化个的输图入谱插。座上。
19/06/2020
23
中低压层析系统
• The End !
19/06/2020
24
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小， 向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度 越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含 的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
19/06/2020
4
层析法
19/06/2020
5
层析法
吸附层析 是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同 而达到分离目的的一种层析技术。
分配层析 是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配 系数不同而达到分离目的的一种层析技术。
凝胶过滤层析 是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分 子大小进行分离的一种层析技术。
离子交换层析 是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进 行分离的一种层析技术。
亲和层析 是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力(如酶和抑制剂、 抗体和抗原、激素和受体等)，将某种配体连接在载体上作为固定相， 而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。 亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。
8. 实验结束： 点击检测操作 / 停止COM1采集 / 确定。
19/06/2020
18
HHDD-5-电5电脑脑紫紫外外检监测测仪仪-9
三、 直接与电脑连接检测、绘制、打印、保存样品分离图谱及计算有关数据。
19/06/2020
19
HDH-D5电-5电脑脑紫紫外外检监测测仪仪-10
三、 直接与电脑连接检测、绘制、打印、保存样品分离图谱及计算有关数据。
19/06/2020
14
HHDD-5-电5电脑脑紫紫外外检监测测仪仪-5
使用方法：
一、 校对仪器工作状态 1. 选定检测波长： 从有机玻璃盒中取出干涉滤光片（250nm或 280nm），插入仪器正面“滤光片”下方小长方孔内，并使其插入到 底部位置（插入时应注意使干涉滤光片侧面有一直径为3mm的半球形 凹槽朝上）。 2．按下“电源开关”（在仪器后背板上），仪器预热20分钟，以便 得到较好的稳定性。 3. 校对T﹪～A a）. 按下按键开关“Ｔ”键，“透过率T”指示灯亮。调节“调T” 旋钮（顺时针调节透过率增大），使数字显示100，此时 透过率T为100% 。 b). 按下按键开关“1A”键，“吸光度A”指示灯亮，调节 “A调零”旋钮，使数字显示000，此时吸光度A为零。