蛋白层析仪器系统原理讲座
蛋白质化学中的层析技术PPT课件
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蛋白质化学中的层析技术PPT 课件
目
CONTENCT
录
• 层析技术简介 • 层析技术在蛋白质分离纯化中的应
用 • 层析技术原理 • 层析技术的应用实例 • 层析技术的优缺点及展望
01
层析技术简介
层析技术的定义
层析技术
是一种分离和纯化混合物中各组分的方法，基于各 组分在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
05
层析技术的优缺点及展望
层析技术的优点
分离效果好
层析技术能够根据分子间的吸附、分配等作用力 的差异，将混合物中的组分进行有效的分离，得 到高纯度的产物。
适用范围广
层析技术可以应用于不同性质的混合物分离，如 有机物、无机物、离子、蛋白质等，具有广泛的 适用范围。
分离过程可重复
层析技术是一种物理分离方法，不涉及化学反应 ，因此分离过程可以重复进行，适用于大规模分 离和制备。
凝胶过滤层析原理
原理概述
凝胶过滤层析是一种基于分子 大小差异的分离技术。通过不 同孔径的凝胶介质，不同大小 的分子会以不同的速度通过凝 胶，从而实现分离。
应用范围
凝胶过滤层析常用于蛋白质、 多糖等大分子物质的分离和纯 化。
技术特点
操作简便、分离效果好、分辨 率高。
离子交换层析原理
01 02
原理概述
1950年代
随着凝胶技术的发展，凝胶层 析、电泳等新型层析技术逐渐 兴起。
1970年代至今
层析技术不断改进和创新，应 用范围越来越广泛，成为生物 化学领域中重要的分离分析方 法。
层析技术的分类
根据固定相和流动相的物理状态
可分为液相层析和气相层析。液相层析又可分为液-固层析和液液层析，是生物分子分离纯化中最常用的技术。
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理一、凝胶过滤层析的概念和原理凝胶过滤层析是一种常用的生物化学分离技术，主要用于蛋白质的精细纯化和分离。
其原理是利用凝胶颗粒的孔隙结构，根据蛋白质的大小和形状差异，使不同分子量和形状的蛋白质在凝胶颗粒的孔隙中发生不同程度的阻滞和流动，从而实现蛋白质的分离和纯化。
二、凝胶过滤层析的操作步骤1. 样品加载：将待纯化的蛋白样品均匀地加载到预先平衡的凝胶柱或凝胶板上。
2. 洗脱：用缓冲液通过凝胶柱，洗去未结合的蛋白和其他杂质。
3. 洗脱物收集：收集洗脱液中的目标蛋白。
4. 分析和检测：对收集的蛋白样品进行分析和检测。
三、凝胶过滤层析的优点和适用范围1. 分辨率高：凝胶过滤层析能够分离不同分子量的蛋白，分辨率较高。
2. 操作简单：操作过程不需要高昂的设备和特殊技能，相对容易进行。
3. 适用范围广：适用于各种不同分子量和性质的蛋白质的纯化和分离。
四、对凝胶过滤层析的个人理解和观点凝胶过滤层析作为一种生物化学分离技术，在蛋白质纯化领域有着广泛的应用。
它的原理简单易懂，操作相对容易，且适用范围广，因此备受科研人员的青睐。
在生物制药和基因工程等领域，凝胶过滤层析也发挥着重要的作用，为蛋白质的纯化和分离提供了有效的技术手段。
总结：凝胶过滤层析作为一种重要的蛋白质纯化技术，具有分辨率高、操作简单、适用范围广等优点。
通过对凝胶过滤层析的深入理解和掌握，能够为生物化学研究和生物制药领域的发展提供有力支持。
通过本文的深度探讨，相信您对凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理有了更深入的了解。
希望本文能够帮助您更全面、深刻和灵活地理解这一主题。
凝胶过滤层析属于分子量分馏技术，是一种物理性质分离方法。
它基于蛋白质在凝胶柱内孔隙中的迁移速度的差异，可以将混合物中的不同分子量的蛋白质分离开来。
对于高分子量的蛋白质来说，凝胶柱内的孔隙会成为一个障碍，从而使它们在柱内停留的时间更长，而低分子量的蛋白质会更容易通过孔隙，因此在经过相同时间的洗脱后，不同分子量的蛋白质就可以被有效地分离开来。
ARRAY360全自动特种蛋白分析仪原理
ARRAY360全自动特种蛋白分析仪原理来源:时间:2007-10-06 字体:[大中小] 收藏我要投稿文章出处：朱敏转载请注明出处韦哲陈澎随着医学科学的发展，现在已知的血浆蛋白质约1013多种，这些蛋白质来源于组织细胞，执行着许多功能，其中有载体蛋白、抗体、酶抑制剂和凝血因子等。
很多疾病的发生可引起血浆蛋白质的改变，因此测定这些变化在临床上有重要的价值。
传统的比色法、电泳法和免疫扩散法等血浆蛋白质测定方法均存在灵敏度低、特异性差、样品温育时间长等缺点，已不能满足临床上对多类特种蛋白质的快速检测的要求。
ARRAY360全自动特种蛋白分析仪是美国Beckmltrl-Coulter公司近年推出的用速度散射比浊法测定血浆蛋白质的免疫化学分析系统，使得血浆蛋白质项目的检查变得敏感、简便、准确、快速。
2 检测原理及系统结构2.1 检测原理ARRAY360系统的测定原理是通过检测悬浮于缓冲液中的抗原与相应抗体发生反应，在抗体过量的前提下，形成免疫复合物颗粒。
光源采用双光源碘化硅晶灯泡(400-620mm)。
有光束通过时，悬浮颗粒所产生的散射光速率变化强弱与抗原浓度成正比，在反应达到最高峰时测定产物形成的量，速率峰值的高低与抗原含量成比例。
此测定法称为速率散射比浊法。
然后速率峰值经微机处理转换成被测抗原浓度。
因此获取正确的速率信号是系统测定技术的关键。
在检测标本时，散射光信号的变化分3个阶段：第一阶段的散射光信号是由缓冲液产生的。
第二阶段的散射光信号是由加入稀释的抗原后出现略微增强的信号。
最后加人抗体，形成免疫复合物颗粒，出现第三阶段明显逐渐增强的信号变化，直到反应达到终点。
仪器将反应初期之前的本底信号调成速率值等于0，然后随着抗原--抗体结合反应的进行，速率信号的增强逐渐加快，最后达到峰值。
一旦所需的速率峰值测到以后，仪器还通过峰值鉴定程序再对峰值进行确证，以排除因污染颗粒、气泡及非特异性沉淀物引起的于扰性散射光信号。
全国各类蛋白仪分解课件
❖ 贝克曼 Array 360 ❖ 贝克曼 ICS-II ❖ 西门子（原德灵）BNP/BN
❖ 法国赛诺菲QM300 特定(tèdìng)蛋白 ❖ 雅培AXSYM 免疫分析仪
❖ 雅培IMX 免疫分析仪
第二页，共二十四页。
贝克曼ARRAY360特定(tèdìng)蛋白分析仪
原理：采用红色激光，散色比浊原理全定量
快速：最快的15秒出结果 经济：仪器试剂(shìjì)成本低 简便：操作简单5步完成 独特项目：可检测lgG亚类
（lgG1、lgG2、 lgG3、lgG4）和 lgGA 亚类（lgA1、lgA2）等 检测项目：可检测26个项目
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全定量特种蛋白(dànbái)金标检测仪[小旋风]
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西门子DCA Vantage 糖化(tánghuà)血红蛋白仪
❖ 仪器概述:POCT免疫测定仪
❖ 测试原理:单克隆抗体凝集反应,Benedict Behre化学反 应
❖ 检测项目:定量检测糖化血红蛋白(xuèhóng dànbái),尿微量 蛋白,肌酐,尿白蛋白/肌酐比值
❖ 报告时间:6-7分钟
第十三页，共二十四页。
韩国(hán ɡuó)i-CHROMA Reader免疫荧光分析仪
检测(jiǎn cè)CRP（含超敏CRP、常规CRP）、HbA1c、MAU、PSA、 AFP、CEA、cTnI
检测项目均在3～15分钟内完成，检测速度13秒/测试
第十四页，共二十四页。
Delta四通道特定(tèdìng)蛋白仪
用血量：只需滴加10ul末梢血或静脉血， 方法：按照仪器的鸣叫提示，旋转试剂筒一周(yī zhōu)，
LP 层析系统简明使用教程
BioLogic LP层析系统简明使用教程BioLogic LP 层析系统一、 仪器名称：BioLogic LP 层析系统 二、 规格型号：BioLogic LP 三、 生产厂家：Bio-Rad Laboratories, Inc 四、 产品简介 随着生命科学研究进入后基因组时代，以蛋白质为主要对象的研究成为各实验室研究的主 题，其中，对单个蛋白质的分离纯化是蛋白质研究的基础工作，也是非常重要的工作。
对纯度均 一蛋白质的研究是揭示生命规律的重要手段，也是新药研发的必要途径，因为只有获得一定量的 蛋白质纯品，才能满足结构和功能的分析、物理化学参数测定、生物活性、毒理和药理实验等等， 乃至大量制备用于诊断和治疗。
蛋白质分离纯化的重要问题是如何在纯化过程中保持温和的条件，从而保证在此过程中蛋白 质的结构和活性不受影响。
层析技术（Chromatography）为蛋白质纯化提供了这样的条件，大都 在室温或低温下操作，所用的流动相可以是与生理液相似的具有一定 pH 值、离子强度的缓冲水 溶液，所用的填料表面修饰各种基团，可与蛋白质分子温和接触，从而保持了蛋白质分子的原有 构象和生物活性。
层析系统以及各种分离纯化所需的填料和层析柱是保证该纯化过程的稳定性、 重现性和自动化进行所必需的设备。
五、 技术原理 将一种混合物分成单个组份是一个熵减的过程，故外界必须要给此过程提供能量。
如下图所 示，完整的层析系统主要包含泵、各种阀门、层析柱、各种在位检测器和收集器。
其主要过程是：由蠕动泵推动溶液；各种阀门控制溶液流向，或者进样，或者洗脱层析柱； 样品经过层析柱并洗脱后，以样品各组分在流动相和固定相（层析介质）中的分配系数不同而 保留不同，从而分开；不同组分经过各种在位检测器，如紫外检测器、电导检测器、pH 检测器 等确定各组分的位置和浓度；最后各组分由收集器自动收集。
其中，泵是层析系统的心脏，用以推动溶液流动，LP 的泵是双通道蠕动泵，可提供精确稳 定，双向变速可调的液流，可配不同直径蠕动管，流速范围为 0.01-40mL/min。
层析原理与技术课件
++
Equilibration
Sample Application
+ + +- +++
+
-
+ + +- + ++
++ + ++
+
+++
- + ++
++ +
++
Sample Adsorption
+
+ +
+
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+ ++ + ++
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+ +
+
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+ +
+
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++
-
-
--
-
Elution
+
+ +
+
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高 疏水作用
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的应用
• 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的
蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的 蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30 • 2.脱盐
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1 34 2.00 1.75
1.50 pH 6.0
凝胶层析法分离蛋白质专家讲座
•
东西都是凝胶）。
凝胶层析法分离蛋白质专家讲座
第11页
三、加样与洗脱
先打开下口开关，放出凝胶柱面上溶液（或吸收， 但溶液面不能低于凝胶表面），然后加样，控制 流速，使样品渗透凝胶内。
本试验样品为：血红蛋白和溴酚蓝混合样品 0.75mL(血红蛋白：溴酚蓝=2:1），用移液管滴加 在液面下（不能冲起凝胶柱，也不能沿管壁流 下），样品下渗至凝胶面时，关闭下口，完成上 样，再加一层洗脱液（3～5cm）。
【目标】
掌握凝胶层析基本原理 学习利用凝胶层析法分离生物大分子和小分 子试验技能
凝胶层析法分离蛋白质专家讲座
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【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。 是利用含有网状结构凝胶分子筛作用，依 据被分离物质分子大小不一样来进行分离 技术。
凝胶层析法分离蛋白质专家讲座
第2页
凝胶层析
凝胶层析是按照蛋 白质分子量大小进行分 离技术，又称之凝胶过 滤、分子筛层析或排阻 层析。
待分离样品：1。鸡血红蛋白：取新鲜抗凝全血5ml，于 r/min离心10min，弃血浆，用三倍于血球体积 0.9﹪Nacl溶液洗血球（颠倒混匀）。离心弃去上清液， 重复1～2次，至上清液清亮为止。于血球中加入10倍体 积蒸馏水，混匀，使血球破碎，过滤，即得血红蛋白溶 液。2。 1mg/ml溴酚蓝溶液 (待分离样品老师已准备好) 葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 洗脱液：0.2mol/L NaCl缓冲液
凝胶层析法分离蛋白质专家讲座
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思索题
一、为何溴酚蓝能与血红蛋白在层析柱中能 够很好分开？
二、生化试验中惯用凝胶有哪些？各有何特 征？
凝胶层析法分离蛋白质专家讲座
第15页
凝胶层析法分离蛋白质专家讲座
蛋白质层析技术PPT课件
蛋白质结构组计划
• 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三 维结构。
• 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 • 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重
组蛋白能够被纯化出来。 • 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成
功的建立。
3
蛋白质层析分离纯化机制
• 电荷不同：离子交换层析 • 大小、形状：凝胶过滤层析 • 疏水区域：疏水层析 • 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀
• FDA规定: 一个生产程序,每次必须产出相同 数量和品质的产品, 否则不会被认可;
• FDA规定: 必须进行蛋白质产品的生物活性 测定 ,测定方法必须证明是规范和有效的,并 且要确保每次生产的产品最后的活性和效 用是一致的;
• FDA规定: 产品必须有确切的可以耐受运输 时间和货架时间;
54
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
的）
4
层析介质
• 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生
物大分子失活，没有生物化学毒性—过强 吸附、泄露。
• 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条
件下是稳定的。
• 必要的机械性能：流体中的耐压性、弹
性。
5
化学组成：亲水多孔高聚物等
亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析 溶液中加一定浓度的盐。
6
聚合物机体孔的结构
27
平台的操作（软件：知识结构）
• 实验室规模的层析应采用不大于50 µm的离 子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则 不少于 600个理论塔板。
• 精制：高效预装柱1 - 5 ml，10 µm左右粒 度，如Mono系列等。
• 通常条件下，采用15 µm的 Resource精制 也可以达到较好效果。
蛋白质分离技术层析
在不同条件下，吸附剂 与被吸附物之间的作用
对不同物质的吸附力而 物理作用的范德华吸附：无
使混合物分离的方法。 选择性，吸附速度快，吸
附的过程是可逆的
化学吸附：由原子价力的作 用引起。有选择性，吸附 速度较慢，不易解吸
在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和 同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡， 吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。
断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键 （3）专一性洗脱
.
56
4、亲和柱的再生：
已使用过和柱，经过再生处理，去除非特 异吸附的杂质后，可重复使用。
再生步骤： 起始缓冲液重复平衡一次 用高离子强度和低离子强度溶液处 用弱酸或弱碱溶液处理
.
57
三、特点
1、只需一步纯化步骤 2、产物非常纯 3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质 4、还可去除已变性或部分降解物质
Albumin
NaCl
Elution volume (ml)
.
32
测分子量
Ve
log Mr
.
33
实验： 凝胶层析法分离蛋白质
.
34
一、原理：
血红蛋白
64,480
二硝基苯-鱼精蛋白
2,000-12,000
Sephadex G-50 孔径 1,500-30,000
Kd=0 Kd=1
.
35
二、操作注意点：
吸水性
G类的型号 表示每克干凝胶吸
水量（ml）x10 如G-50
每克干凝胶吸 水量为5ml。
.
28
2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)
大孔凝胶 工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限 可分离MW40万以上的物质 可用来分离核酸及病毒。
蛋白纯化系统学习资料
亲和层析谱柱一、定义亲和层析：利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质或其他分子的层析技术二、原理分析将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。
那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。
步骤：1、固定吸附剂放置在层析柱2、与吸附剂具有亲和能力的蛋白质滞留在层析柱3、用洗脱液将结合的蛋白质洗脱下来亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。
所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。
在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。
生物分子间的这种结合能力称为亲和力。
亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。
此法具有高效、快速、简便等优点。
种类：（1）抗原和相应的抗体发生特异性结合（2）酶与底物的识别结合（3）受体与配体的识别结合三、载体要求理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。
可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。
在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。
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缺点：
× 精度差 × 脉动大 × 压力低
蠕动泵类型
单通道泵
多通道泵
柱塞往复泵特点
耐高压 脉冲小 流量宽、无极可调 重复性好、准确度高
柱塞泵工作原理
单向阀结构
宝石球
工作原理
吸液冲程
出口单向阀
排液冲程
抛光面
泵头 球座 流动相 进口单向阀
柱塞泵分类
按柱塞个数
单柱塞 双柱塞 三柱塞
1996年－2000年，北京化工大学，化学工程系生物化工专业，本科 2000年-2005年，北京化工大学，生命科学与技术学院，生物化工专业，博士，2006年至今，中国科学院过程工程研究所，生化工程国家重点实验室
成果 发表论文26篇，其中，SCI收录论文21篇，申请专利9项，授权2项。 “多柱组合色谱高通量蛋白质分离设备及层析柱”获得2011中国仪器仪表协会科 技创新奖（第三获奖人）； “以保护活性为目标的生物技术药物层析分离纯化技术”获得2013中国分析测试 协会科学技术奖“CAIA奖”一等奖（第三获奖人）。
简单整合型
BioLogic LP (Bio Rad)
AKTA Prime (GE)
复杂整合型
AKTA Explorer (GE)
BioLogic LP (Bio Rad)
按规模分
实验室规模 AKTA pure 流速<150mL/min
中试规模 AKTA pilot 流速4-400mL/min
生产规模 AKTA process 流速0.75-30L/min
AKTA梯度性能考察
A：水 B：0.5-1.0%(v/v)丙酮
蛋白质的梯度洗脱注意事项
层析过程优化采取梯度洗脱或者阶越式洗脱方式； 反相层析探索条件时，梯度应尽可能长（>20个柱 体积）；
当发现进错样时，不可以为了节约时间，而直接用 100%流动相B（有机相）洗脱，否则会不可逆地损 坏层析柱。
针对料液中目标产物浓度极低，料液体积较大的 情况（如用离子交换捕捉发酵液中表达量非常低 的基因工程蛋白质）；
料液前处理非常重要，进料前必须用0.45 μm或 更小孔径滤膜严格过滤； 进料过程必须密切注意压力变化； 推荐使用蠕动泵进料。
柱切换进料
解决下列问题
人工换柱带来的泄漏和污染 周期长导致蛋白质失活 通量低和收率低
在位清洗
根据样品的脏/干净的程度，可按软件中CIP程序定期清洗 系统，防止系统管道被堵，压力增高。11
维护——每半年
压力检测器
零点校正（pressure offset)。
紫外可见检测器
◇用注射器推10%的表面活性剂SDS注入紫外流动池
停留20分钟，用水冲洗。 ◇用用注射器推甲醇或1M NaOH注入紫外流动池，停留20分钟，用水冲洗。
4 进样系统
手动进样
直接倒入柱子顶部 进样阀进样
自动进样 泵进样 柱切换进样
进样阀
手动进样阀 自动进样阀
定子（Stator）
转子（Rotor）
AKTA进样阀操作
手动进样注意事项
进样动作：Load状态时平缓推针，切换到Inject后再拔针以防倒 吸 清洗：在Inject状态清洗进样口 对于Rheodyne进样器
目测法
色谱名称的由来 最古老原始的方法 在玻璃柱中观察带颜 色物质形成的条带
石油醚
色谱
色素 碳酸钙颗粒
组分
显色反应
没有在线检测器 针对一些没有紫外吸收的物质，如多糖，PEG等 设备要求低 工作量大
紫外-可见检测器
主要组成部分
光源 分光系统 样品池 光强探测器 固定波长检测器 可变波长检测器
实验完成后用纯水在load和inject状态下清洗，20%乙醇保 存
使用完高盐溶液后用纯水冲洗
至少半个小时
定子（Stator）
转子（Rotor）
自动进样
进样动态范围广 样品残留少(连续洗针系统) 延迟体积少 进样重复性高(< 0.5% RSD) 主要应用于分析型色谱
泵进料
高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效 分离分析方法
层析分类
特性
层析分类
介质粒度 (μ m) 40 ~ 200 25 ~ 40 3 ~ 10
低压 中压 高压
操作压力 (MPa) 不明显高于 1atm 0.5 ~ 4 4 ~ 20
2. 蛋白层析系统的构造
输液系统：
(1)提供连续、稳定而精确的流量； (2)进行梯度洗脱；
因此，如无特殊需要，最好使用单波长检测 隔一段时间运行一下多波长检测
6.维护——每天
系统
◇ ◇ ◇ ◇
清洁擦拭外表，防止试剂或结晶的盐腐蚀设备 溶液和样品必须过滤 检查系统管路和接头有无破损，系统是否渗漏。 使用完毕，须用水将系统冲洗干净，之后用20%乙醇清洗系并保存所有的流路。
pH计
◇ 使用前校正pH计。 ◇ 用后将pH计拆下放入保护液（1:1 pH 4 buffer和 2
主要内容
1.概述 2.蛋白层析系统的组成 3.输液系统 4.进样系统 5.检测系统 6.日常维护 7.选型购买
1 概述
液相色Leabharlann （层析）的发展古罗马时期人们用布或纸分析染料与色素； 1903年，Tsweet发表首篇有关层析的论文； 1960s, HPLC商用仪器出现
P-903 (10 ml/min) Low Flow LC Filter
缓冲液筛网
检查入口溶液的筛网是否很脏，如有必要须更换。
P-901(100ml/min) High Flow LC Filter
Polymer Support
泵冲洗系统
◇ 更换泵后冲洗液（20%乙醇）。 ◇ 如果冲洗液瓶中液体量增加，说明泵头密
3 输液系统
流动相输送方式
梯度混合方式
高位槽 气体压力 出口抽真空 泵送系统
梯度混合器 电磁阀（低压梯度） 高压梯度
蠕动泵 最常用 柱塞往复泵 其他类型的泵，如隔膜泵
最简单的方式
压力
高位槽
蠕动泵
真空
蠕动泵（软管泵）工作原理
优点：
结构简单，无密封件，无阀门 维护方便，易于清洗和清洁 可输送含颗粒液体以及高粘流体 很好的自吸功能，可干转 剪切力小，适合输送对剪切力敏感的 物料
M KNO3，或pH4.0的饱和KCl溶液）。
Open
泵
◇检查泵头周围是否渗漏，如果泵头有渗漏,或是流量不准确，则需更换泵
头密封圈。
◇更换缓冲液时，需排尽泵头里的残存气泡，否则会影响流速的准确性。
维护——每周
ON-LINE FILTER change
在线滤器
清洗过滤片，如有必要须更换过滤片，否 则会形成很高的在线压力，流速降低。
一定要使用合规格的进样器，规格为外径0.028英寸，长2英寸的平 头针。一定不能使用尖针，它会严重刮坏转子垫圈。 废液口：出口末端应与进针口水平以防倒吸或虹吸
进样阀操作注意事项
进样阀靠转子和定子的面密封，无法保证100%不泄露 缓冲液泄露会导致盐析出，损伤密封面和导流槽，严重时造 成漏液和两个导流槽之间短路
pH/电导检测器
◇清洗流动池：拆下pH电极，用1M NaOH清洗pH和电导流动池
30分钟，用 水冲洗。 ◇清洗pH电极（响应慢或校正斜率小于80%时）： 1. 盐沉积：0.1M HCl/ 0.1M NaOH/ 0.1M HCl 交替洗数次，间隔5分钟。 2 . 油脂沉积：1%SDS清洗后水洗。 3. 蛋白沉积：1% 蛋白酶于0.1M HCl 溶液中清洗后水洗。
多柱组合层析
多柱组合层析纯化蛋白质实例
白蛋白、AT-Ⅲ、运铁蛋白均达到了电泳纯（纯度≥99%） α1-AT和结合珠蛋白（两个条带）的纯度也在95%以上 整个过程用时140分钟 采用收集洗脱峰，人工换柱层析，则至少需要3天
5 检测系统
古老的方法：目测、离线显色反应
光学检测器（如紫外-可见、荧光、示差折 光、蒸发光散射、多角度激光散射等） 热学检测器（如吸附热等） 电化学检测器（如pH、极谱、库仑、安培 等） 电学检测器（如电导等）
Signal Dark A log10 reference Dark
纵坐标为吸光度A，横坐标为时间作 出的曲线即为层析图谱
分类
单波长检测器 多波长检测器
二极管阵列检测器
固定波长紫外检测器
汞灯光谱图 滤光片原理示意图
固定波长紫外检测器
Pharmacia UV Monitor UV-1 AKTA PRIME和UPC所配检测器 汞灯为光源，荧光片和滤光片来选择波长，通常为 254和280nm，分别用于核酸和蛋白的监测 结构简单，价格较便宜 可配套国产色谱工作站（如N2000）进行数据采集 国产8823B
蛋白层析系统
李秀男 Email:xnli@ 中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室
个人简介
研究方向
李秀男，博士，副研，硕导
生物分离工程：重点开展生化分离设备研制与产业化，生物技术药物分离分析新技 术、新方法的研究，蛋白质组合层析快速分离纯化平台，以及新型层析介质的应用 评价工作。 教育背景和工作经历
可变波长紫外-可见检测器
氘灯光谱图
氘钨双光源光谱图 钨灯光谱图
AKTA检测器
氙灯作为光源 优点：全波长、光强高 缺点：脉冲灯，每次闪耀光强不一样