微生物检验方法[2.0]2006-2-17

目录

一、微生物检验标准

二、总则

三、微生物检验操作指导

1．菌落总数测定

2．大肠菌群测定

3．嗜冷菌/低温菌测定

4．芽孢及耐热芽孢总数测定

5．霉菌和酵母菌计数

6．商业无菌

7．消毒洁净度及膜类微生物检测

8．空气微生物检测

9．大肠杆菌的测定

修订：徐冬梅、张彩霞审核：孙秀芝

审批：李印所日期： 2006年2月17日

一、微生物检验标准S

注：所引用标准未注明年号的执行最新有效版本

二、总则S

执行GB/T 4789.1《食品卫生微生物学检验总则》、GB/T4789.28《食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂》。

（一）样品的采集

1. 样品的采集必须遵循无菌操作程序。抽样工具如整套不锈钢勺子、镊子、剪刀等应当灭菌；容器须灭菌，且清洁、干燥、防漏、广口、大小适合盛放检样。

2. 抽样全过程中，应采取必要的措施防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。

3. 确定检验批，应注意产品的均质性和来源，确保检样的代表性。

4.成品检样，对包装完整的样品进行采集；已开包的坏包样品须及时转移至无菌容器中，再进行微生物检测。

5.常见的抽样方法有

5.1直接食用的小包装食品

尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。

5.2桶装或大容器包装的液体食品

5.2.1抽样前摇动或用灭菌棒搅拌液体，尽量使其达到均质；抽样时应先将抽样用具浸入液体内略加漂洗，然后再取所需量的样品；装入灭菌盛样容器的量，不应超过其容量的四分之三，以便于检验前将样品摇匀。

5.2.2如为非冷藏易腐食品，应迅速将所抽样品冷却至0-4℃。

5.3桶装或大容器包装的固体食品

5.3.1每份样品应用灭菌抽样器由几个不同部位采取，一起放入一个灭菌容器内。

5.3.2注意不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。

5.4生产过程中的抽样

5.5.1划分检验批次，应注意同批产品质量的均一性。

5.5.2如用固定在贮液桶或流水作业线上的抽样龙头抽样时，应事先将龙头消毒。

(二)样品的标记、保存和运送

抽样过程中应对所抽样品进行及时、准确的标记；抽样结束后，应由抽样人写出完整的抽样记录，使样品尽可能保持在原有条件下迅速发送到实验室。

1.样品的标记

1.1所有盛样容器必须有和样品一致的标记。在标记上应标明到货批次、采样日期、品名或编号、采样地点，以及其他需要说明的情况。

标记应牢固，具防水性，字迹不会被擦掉或脱色。

1.2当样品需要托运或由非专职抽样人员运送时，必须标识样品容器。

2.样品的保存和运送

2.1抽样结束后应尽快将样品送往实验室检验。如不能及时运送，需冷却和易腐食品存放在0-4℃冰箱或冷却库内；其他食品可放在常温冷暗处。

2.2运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。必要时可于途中补加冷却剂或冷冻剂。

2.3如不能由专人携带送样时，也可托运。托运前必须将样品包装好，应能防破损，防冻结或防易腐和冷冻样品升温或融化。在包装上应注明“防碎”、“易腐”、“冷藏”等字样。

2.4作好样品运送记录，写明运送条件、日期、到达地点及其他需要说明的情况，并由运送人签字。

(三).检验

微生物检验室接到样品，应立即登记，并按检验要求，立即将样品放在冰箱或适合贮存区域，积极准备条件进行检验。

原料奶、配料或半成品奶，采样后应立即于4℃下冷藏，尽快检测。

三、微生物检验操作指导S

（一）.菌落总数的测定

方法一：平板法

1.其他要求

1.1营养琼脂培养基：按GB/T4789.28 中规定或将购买制好的营养琼脂按说明制备、分装（不超过容积的3/4）于300ml三角瓶中，高压灭菌（121℃、20分钟）。

1.2微生物实验用的各种加塞容器，如试管、稀释液瓶、培养基瓶、培养液管等，在高压灭菌前需加塞后再用双层报纸或牛皮纸包扎封口处，以防二次污染。

1.3实验过程打开过灭菌桶盖或包扎纸的剩余接种器材（如吸管、试管、平皿），不得留做下次使用，需重新灭菌后再使用。

1.4实验过程打开过包扎纸的剩余培养基（如琼脂培养基等），不得重新灭菌或留做下次再使用（建议将剩余营养琼脂倾倒成平板，备用）。

1.5稀释使用的9ml稀释液，用灭菌后三角瓶中的稀释液，使用时分装于试管中。1.6制备225ml稀释液时，建议使用300ml的锥形瓶进行盛放，以便稀释后混匀充分。

1.7培养基准备：使用接受检查预先灭菌过的营养琼脂培养基是否处于正常、可用状态。

1.8环境监测

1.8.1超净台内环境的监测：每批实验时需要对照监测

方法：在无菌操作的条件下，取一个灭菌平皿倾入15mL营养琼脂培养基，待凝固后，在超净台中打开盖，暴露从操作开始至操作结束的整个过程（皿盖斜搭在皿底侧边上，以不遮盖皿底琼脂为宜），结束后合上盖，做好标记后进行同条件培养，作为超净台环境对照样。

1.8.2接种室和培养室或缓冲间环境的监测：每周至少监测1次。

方法：见《空气微生物检测》，其采样点数为2个/区域/次。

2、操作注意事项

2.1紫外线灭菌前，用新洁尔灭消毒液擦拭超净台台面、无菌室桌面等；无菌室须设专用盆、抹布（纱布）。

2.2操作前，先使用新洁尔灭消毒液清洗操作员手部、抹布,再用酒精棉球手局部消

毒。

2.3超净台风机需打开，前挡风玻璃需拉下；鼓风水平风向，无前挡风玻璃时，建议戴口罩。

2.4取检样要具有代表性，固体样品要多取几个部位，液体样品要充分混匀。

2.5在酒精灯火焰周围4-5cm区域内操作。建议吸管接样前转动通过火焰灭菌，接样后不过火焰；吸头接吸管前要在火焰周围挤捏排气

2.6样品、容器打开前需使用酒精棉从开口端向周围方向擦拭消毒。

2.7打开或加完样后塞上容器时，瓶口（或管口）、瓶塞（或管塞）建议通过火焰灭菌。

2.8液体样品加入时要沿壁流入，吸管尖端不得触及稀释液或培养液。

2.9使用后的样品、器材要及时撤出超净台。

2.10同时持两支试管时，管口、塞子互相不得接触。

2.11选择的稀释度要适当（使菌落数在30-300之间）。

2.12检样稀释后，应尽快接种，倾倒培养基。一般从检样稀释开始到倾到培养基，应在15min内操作完毕。

2.13为了排除实验试剂的干扰，操作同时，用1ml灭菌吸管吸取1ml生理盐水于一个灭菌平皿中，然后将营养琼脂分别注入上述加有1ml灭菌生理盐水的平皿和另一个灭菌的空平皿内，做好标记后进行同条件培养，作为稀释液和培养基的空白对照。

2.14注意抑菌现象，如检样中含有一定量的抑菌剂，可产生低稀释度的平板上菌落少、高稀释度的平板上菌落反而增多的现象。

3、培养注意事项

3.1培养箱应保持一定的湿度，培养基平板培养48h后，培养基失重不应超过15%。

3.2定期用消毒剂擦拭培养箱箱内金属孔架及内壁（须切断电源后擦拭）。

3.3必要时需延长培养时间（72小时或更长些），以利于微生物生长、观察。

4.菌落计数及报告注意事项

4.1 如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，有两种可能性：一是检验工作中发生差错；二是受抑菌剂影响。这二种情况均不可用作检样计数报告的依据。