不同来源药品支原体检查用培养基的促生长能力研究_赵宏大_谢文_范文平_肖新月_孟

BD 公司） ； 支原体肉汤基础（ mycoplasma broth base， 批号： 1187350，英国 OXOID 公司） ； 酵母粉 （ 批号： 1098129，英 国 OXOID 公 司 ） ； 纯 化 琼 脂 （ 批 号： 2326162，美国 BD 公司） ； 胎牛血清（ 批号： 1618863， GIBCO 公司） ； L-精氨酸盐酸盐（ 批号： 20121030，国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 ） 和 酚 红 （ 批 号： 20130426，国药集团化学试剂有限公司） 。
通讯作者： 范文平 Tel： （ 010） 67095939 E-mail： fanwenping02015 年第 18 卷第 12 期 China Pharmacist 2015，Vol． 18 No． 12
1． 2 培养基与试剂 PPLO 肉 汤 （ PPLO broth，批 号： 3266437，美 国
4 家国内 生 产 培 养 基： 支 原 体 肉 汤 培 养 基 A1 （ 批号： 20130926） 、B1 （ 批号： 20131210） 、C1 （ 批号： 130424） 、D1（ 批号： 2014012002） ； 精氨酸支原体肉 汤 培 养 基 A2 （ 批 号： 20130926 ） 、B2 （ 批 号： 20131030 ） 、C2 （ 批 号： 131010 ） 、D2 （ 批 号： 2014012003） 。以 BD （ 美 国） 公 司 的 PPLO 肉 汤 和 OXOID（ 英国） 公司的支原体肉汤基础为基础加入 适当添加成分作为参比培养基，支原体肉汤的参比 培养基编号分别为 BD1、OX1，精氨酸支原体肉汤参 比培养基编号分别为 BD2、OX2。 1． 3 支原体标准菌株
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研究论文
不同来源药品支原体检查用培养基的促生长能力研究
赵宏大 谢文 范文平 肖新月 孟淑芳 （ 中国食品药品检定研究院 北京 100050）
摘 要 目的： 调查《中国药典》载明的支原体检查用培养基的促生长能力及其适用性，为规范药品支原体检查试验方法提 供参考依据。方法： 分别使用灵敏度、变色程度、菌落计数和菌落直径四个定量检验方法，以国际上广泛使用的支原体培养基 作为参比，调查国内市售的 4 家不同生产商的 4 批支原体肉汤培养基和 4 批精氨酸支原体肉汤培养基的促生长能力。结果： 灵敏度法和吸光度法检验结果均显示，接种小于 100 CFU 支原体测试菌株培养后培养基颜色均发生肉眼可见的变化； 进一步 测定培养基颜色变化程度和菌落直径大小时发现，不同生产商的培养基产品之间存在显著差异（ P ＜ 0． 01） 。结论： 支原体肉 汤培养基和精氨酸支原体肉汤培养基均能支持小于 100 CFU 支原体测试菌株的生长； 不同生产商的培养基产品的促生长能 力存在显著差异，药品支原体检验工作者应使用敏感性强的方法对培养基进行适用性检查。 关键词 支原体检查； 培养基； 《中国药典》； 促生长能力 中图分类号： R375 文献标识码： A 文章编号： 1008-049X（ 2015） 12-2062-05
由于《中 国 药 典 》支 原 体 检 查 法 使 用 与 欧 美 药 典不同的特有的支原体培养基配方［1］，在培养基性 能方面难以借鉴欧美国家积累的基础研究数据。长 期以来，关于《中国药典》载明的支原体检查用培养 基质量状况及其适用性，一直缺乏能与国际通用支 原体培养基横向比较的基础数据。另外，测试菌株 的接种量和培养基的使用量是评价培养基灵敏度的 关键要素。 《中 国 药 典 》收 载 的 部 分 微 生 物 检 查 法 ［无菌检查法、微生物限度检查法和抑菌剂 （ 防 腐 剂） 效力检查法指导原则等］以及欧美国家相关标 准的支原体检查法中对培养基质量的检查方法，均 采用确定 测 试 菌 株 接 种 量 的 方 法。 而《中 国 药 典 》 支原体检查法培养基灵敏度检查对测试菌株接种量 无明确规定，这直接妨碍了对培养基质量评价结果 的客观性和准确性。
口腔 支 原 体 （ ATCC23714 ） 和 肺 炎 支 原 体 （ ATCC15531） 均购自 ATCC（ American Type Culture Collection） 。 1． 4 培养基配制 1． 4． 1 支原体肉汤参比培养基 按产品说明书提 供的配制方法加入 BD 公司的 PPLO 肉汤或 OXOID 公司的支原体肉汤基础，再按0． 5% 、1% 的比例分别 添加 酵 母 粉 和 0． 2% 的 酚 红，调 整 pH 为 （ 7． 8 ± 0． 1） ，灭菌备用。使用前按总体积的 20% 加入胎牛 血清。 1． 4． 2 精氨酸支原体肉汤参比培养基 按产品说 明书提供的配制方法加入 BD 公司的 PPLO 肉汤或 OXOID 公司的支原体肉汤基础，再按0． 5% 、0． 2% 和 1% 的比例分别添加酵母粉、L-精氨酸盐酸盐和 0． 2% 的酚红，调 整 pH 为 （ 7． 5 ± 0． 1 ） ，灭 菌 备 用。 使用前按总体积的 20% 加入胎牛血清。 1． 4． 3 CFU 计数培养基 按 PPLO 培养基2． 1% 、 酵母粉0． 5% 、L-精氨酸盐酸盐0． 2% 、琼脂1． 5% 的 比例配制，调整 pH 为（ 7． 8 ± 0． 2） ，灭菌后倒平皿。 倒平皿前按总体积的 20% 加入胎牛血清。 1． 4． 4 待检支原体肉汤培养基和精氨酸支原体肉 汤培养基 根 据 产 品 说 明 书 和 药 典［2］ 方 法 配 制。 按1． 5% 的比例加入琼脂将液体培养基转化为固体 培养基进行菌落计数和菌落直径比较试验。
将稀释度为 10 － 4 至 10 － 9 的菌悬液接种于待测 液体培养基，每稀释度接种相同培养基 3 管，接种量 为 1 ml / 管。紧闭管口，（ 36 ± 1） ℃ 培养 7 ～ 14 d，观 察培养基变色结果。将 2 /3 以上管数呈现变色的最 高稀释度的接种量称为该培养基的灵敏度，比较不 同生产商培养基产品灵敏度的差异。同时，两种支 原体 分 别 取 10 － 4 ～ 10 － 7 四 个 稀 释 度 菌 悬 液 各 0． 1 ml，接种于固体培养基上，培养 7 ～ 14 d 后，计 数。 1． 8 培养基颜色变化程度比较试验
METTLER TOLEDO S20K pH 计（ 瑞士梅特勒公 司） ； MCO-15AC CO2 培养箱（ 日本三洋公司） ； Incucell 707L 恒温培养箱（ 德国 MMM 公司） ； T6 型紫 外可见分光光度计 （ 北京普析通用公司） ； DG250 厌氧培养系统（ 英国 DWS 公司） 。
Investigation of Growth-Promoting Properties of the Culture Media from Different Sources for Drug Mycoplasma Test
Zhao Hongda，Xie Wen，Fan Wenping，Xiao Xinyue，Meng Shufang （ National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050， China） ABSTRACT Objective： To investigate the growth-promoting properties and applicability of the mycoplasma test culture media prescribed in Chinese pharmacopoeia，and provide reference for the standardization of the drug mycoplasma test method． Methods： Respectively using four quantitative detection methods including sensitivity，degree of color change，colony counts and colony diameter， and mycoplasma media widely used in the world as the reference media，the growth-promoting properties of 4 batches of mycoplasma broth and 4 batches of arginine mycoplasma broth from four domestic manufacturers were investigated． Results： The results of sensitivity assay and absorbance detection showed that all the media inoculated with below 100 CFU test microorganisms exhibited visible color change． Furthermore，the results of color change degree and colony diameter showed that there were significant differences among the media products from different manufacturers（ P ＜ 0． 01） ． Conclusion： Mycoplasma broth and arginine mycoplasma broth both can support the growth of below 100 CFU test microorganisms． Due to the difference in the growth-promoting properties among the media products from different manufacturers，the drug mycoplasma test workers should use more sensitive methods to examine the applicability of the media． KEY WORDS Mycoplasma test； Media； Chinese pharmacopoeia； Growth-promoting properties