利用HLA抗原肽四聚体和流式细胞分选仪制备CTL细胞克隆

培养液I和抗CD40单抗；第4组中加入DC的培养液II和抗CD40单抗。然后将这4组细胞置于37℃，5%CO2的培养箱中进行培养。在培养4d和7d后，分别收取这4组细胞，进行DC的表型分析和gp130分子表达的分析。
1.3细胞表型分析将细胞调整浓度为5×106m－1，加入eppendorf离心管，每管100μ。离心后吸去上清，加入50μ单抗，单抗的标记浓度为20μg/m，置于4℃，30min，用含1%FCS的PBS洗涤2遍，加入荧光标记二抗，4℃置于暗处30min，洗涤2遍，用流式细胞仪检测表型。
gp130分子是白介素-6的信号传导链，同时也是白介素-11、白血病抑制因子、制瘤素、睫状神经营养因子和心肌神经营养因子-1的共用信号传导链。它表达于机体的大部分组织细胞包括造血干细胞上，有着重要的生理功能［1］。从造血干细胞分化发育而来的树突状细胞具有摄取、加工和递呈抗原，是目前已知机体内功能最强的抗原递呈细胞。它能在体内外激发初始型T细胞，促进细胞毒性细胞和辅助细胞的生成，是免疫应答强有力的启动者和参与者［2］。由于DC在机体内所占比例极少，往往需在体外对其前体细胞扩增培养来研究DC在分化成熟过程中，细胞膜上各种分子表达的情况。本研究
gp30分子在树突状细胞上表达及其意义
摘要目的：探讨单核细胞向树突状细胞分化成熟时，gp130分子在细胞膜上的表达及其意义。方法：人外周血分离得到的单核细胞在含有DC分化成熟所需的各种因子的培养液中分别培养4d和7d，然后用流式细胞术测定DC上gp130分子的表达。结果：gp130分子在单核细胞上低表达，经培养分化成熟成为DC后，DC上的gp130分子表达被上调，非凡是在TNFα和抗CD40刺激型单克隆抗体存在下。结论：gp130分子表达于DC前体细胞并随其分化成熟而增加。
道DC前体细胞在体外培养成为DC时，细胞膜上gp130分子的表达。
1材料与方法
1.1试剂细胞因子rhGM-CSF购自美国的Amagen公司。rhTNFα和rhIL-4购自法国的Diaone公司。抗CD1a、CD14、CD80和HLA-DR以及同亚型对照抗体由法国Immunoteh公司提供。羊抗鼠IgG荧光抗体购自卫生部武汉生物制品研究所。抗CD40刺激型单抗由本室研制，可起着类似于配体的作用，激发CD40分子。抗gp130单克隆抗体B-T2由本室研制［3］。淋巴细胞分层液购自上海试剂二厂。RPMI1640为美国Gibo公司产品。
DC有关的分子，这对成熟的DC发挥其生理功能是必不可少的，但是否还有其他因子对DC在分化成熟过程中也起着重要作用。Larregina曾系统研究了DC上所表达的多种细胞因子的受体，包括gp130分子［8］。本文的结果表明，在DC的前体细胞单核细胞上，gp130分子低表达，但在GM-CSF、IL-4、TNFα和CD40分子作用下，在分化成熟成为DC的过程中，gp130分子的表达逐步增强。尽管本文首次道了gp130分子在DC上的动态表达，但在造血系统中起重要作用的gp130分子本身在DC细胞分化发育和成熟过程中起何种作用，目前在国际上仍属空白，值得进一步探索和研究。由于对DC研究的历史较短，其分化发育和功能成熟方面仍有不少未知问题。假如从新的角度，探索一些新的因子，包括gp130分子的作用，可能会有新的发现和熟悉。
3讨论gp130分子是一个重要的分子。它已被发现在机体的大部分组织细胞上都有表达，提示它可能参与机体的许多重要功能［1］。在造血功能方面，gp130分子在胚胎发育的早期，就已在胚胎造血干细胞上有所表达［5］。在已敲除gp130基因的小鼠体内，胚肝中多能造血干细胞池受到严重破坏，定向造血干细胞的数量急剧减少，严重影响各个造血系列和淋巴系列的细胞生成［5］。在体外，gp130分子与干细胞因子和Ft3配体参与造血干细胞的扩增［6，7］。对于从造血干细胞分化发育而来的DC，对其在分化发育和功能成熟的过程中，已知有些因子如GM-CSF、IL-4、TNFα和CD40分子等在其中起着重要作用，而且在这过程中，DC上表达出一些
利用HLA/抗原肽四聚体和流式细胞分选仪制备CTL细胞克隆
免疫反应的最显著特点是其特异性，是由于免疫分子与相应的抗原表位结合具有高度特异性。利用免疫反应的特异性，能够分离出抗原特异性的淋巴细胞克隆。B细胞上BCR（或抗体）能够直接识别抗原表位，利用某种抗原表位就可以鉴定和分离相应的B细胞克隆（或抗体），过程相对简单。与B细胞不同，T细胞上TCR识别的配体是抗原肽/MHC分子复合物，而不是天然的抗原表位，因此分离T细胞克隆的过程相对复杂。 随着对T细胞识别机制的不断深入和分子生物学技术的不断发展，目前已经能够在体外人工合成TCR结合的配体—HLA抗原肽四聚体（HLA-peptide tetramer）。利用HLA-抗原肽四聚体和流式细胞分选仪能够从淋巴细胞中分离出抗原特异性的T细胞克隆，结合T 细胞培养，能够扩增相应的T细胞克隆。该分离特异性T细胞克隆的方法与传统的细胞培养-有限稀释法比较，具有操作简单，克隆效率高等优点。不足之处是需要制备HLA-抗原肽四聚体，并且需要流式细胞分选仪。【材料和试剂】（1）外周血淋巴细胞，健康人外周血10-20ml，肝素抗凝，注意供者的HLA型别，可根据研究目的选择HLA-A2阳性或HLA-A2阴性个体的外周血。（2）T2细胞株，为TAP缺陷的细胞株，HLA-I类型别为HLA-A*0201，-B*05，-Cw1。因其TAP缺陷，其表达HLA-I类分子的抗原肽结合槽未结合抗原肽，能够与加入的外源性抗原肽结合，形成HLA-I-抗原肽复合物，能够被相应的T细胞克隆所识别。（3）抗原肽，8-10氨基酸残基长度的短肽，通常采用人工合成的方法制备。其氨基酸的组成与顺序是由研究目的（即T细胞克隆的特异性）决定 抗原肽致敏T2细胞：用无血清培养液调T2细胞浓度至1X106个细胞/ml，取上述浓度T2细胞悬液1ml，加入10uM抗原肽，混匀后置室温作用4小时后，用RPMI1640洗涤。（4）HLA-抗原肽四聚体，制备和使用详见本章第二节。（5）伺养细胞，取供者自身PBL，经30Gy射线灭活。含10%AB血型人血清的RPMI1640培养基（6）IL-2以及细胞培养所需的试剂和设备（7）流式细胞分选仪【操作步骤】（1）取抗凝外周血10-20ml，用Ficoll-Hypaque密度剃度离心法分离出淋巴细胞，用RPMI洗涤2次。（2）取1X106个经抗原肽致敏的T2细胞，用200Gy射线灭活，与步骤（1）分离的淋巴细胞混合，培养液为含10%AB血型人血清的RPMI1640培养基，置37℃，5％CO2培养5天。（3）培养5天后，半量更换培养液，并加入IL-2，终浓度为20U/ml。（4）培养10天后，取1X106个经抗原肽致敏并经射线灭活的T2细胞，用上述含IL-2的培养液重悬，继续培养5天，并注意观察细胞的生长和增殖情况。（5）当细胞明显增殖时，可以用流式细胞分选仪和HLA-抗原肽四聚体进行特异性T细胞克隆分选，分选出HLA-抗原肽四聚体特异性的T细胞，用上述含IL-2的培养液重悬，并以1个细胞/孔的浓度加入96孔培养板中。培养板中每孔含2X104个抗原肽致敏并经射线灭活的T2细胞作为刺激细胞，以及4X104个经射线（30Gy）灭活的自身PBL作为伺养细胞。（6）按照上述的培养条件继续培养，每周半量更换培养液，换液时加入用上述含IL-2培养液重悬的抗原肽致敏并经射线灭活的T2细胞（2X104/孔）。（7）如果培养孔中的T细胞（即CTL）能够特异性识别HLA-抗原肽复合物（例如T2细胞的HLA-A2与加入的抗原肽形成的HLA-抗原肽复合物），该孔的CTL克隆将会发生扩增。（8）用抗原肽致敏的T2细胞（或者根据研究目的，采用表达相同HLA-I分子以及相同抗原肽的其他细胞）作为靶细胞，用标准的细胞毒实验（例如51Cr释放试验）对扩增的CTL克隆进行功能鉴定。（9）对于功能良好的CTL克隆，可以用于T细胞的功能研究或置液氮中保存。【注意事项】（1）在静止T细胞中，抗原特异性T细胞的数量极低，约占静止T细胞数量的10-4~10-6。在抗原致敏的个体中，抗原特异性T细胞的数量将会增高。因此，在抗原致敏个体的外周血中克隆相应抗原特异性T细胞效率较高。（2）TCR识别的配体是HLA-抗原肽复合物，在用HLA-抗原肽四聚体分离特异性T细胞克隆时，特别注意HLA型别，要求HLA-抗原肽四聚体与刺激细胞（抗原提呈细胞）的HLA型别相同。（3）在使用细胞分选仪分选T细胞之前，IL-2的量不宜过高，以免发生非特异性增殖。（4）上述实验方法利用T2细胞作为抗原提呈细胞，根据研究目的也可以选用其他细胞作为抗原提呈细胞，此时应注意根据该细胞的HLA型别和所提呈的抗原肽设计和制备HLA-抗原肽四聚体。
2结果
2.1gp130分子在单贴壁细胞，获得贴壁的单核细胞。部分单核细胞经胰酶处理，悬浮后，立即用FCS中和胰酶活性，离心洗涤后，测定其细胞膜上的gp130分子，gp130分子在单核细胞上呈弱表达，仅为15.9%。
2.2gp130分子在DC上的表达以GM-CSF和IL-4培养单核细胞使其分化成为DC。培养7d后，DC上的gp130分子表达增加。目前已知GM-CSF和IL-4是DC的主要增殖分化因子，TNFα是DC的成熟因子之一。近有文献道，通过CD40配体激发DC前体细胞上的CD40分子也可促
1.2树突状细胞的体外培养正常健康人外周血经肝素抗凝，用淋巴细胞分层液进行常规密度梯度离心取单个核细胞，洗涤后，以含10%FCS的RPMI1640调整细胞浓度至3.5×106m－1，加6孔板中，5%CO2、37℃培养3h，吸去非粘附细胞，获得贴壁单核细胞，然后将贴壁单核细胞分成4个组，分别加入培养液。第1组中加入DC的培养液I；第2组中加入DC的培养液II；第3组中加入DC的
使其向DC分化、增殖和成熟［4］。本室制备的刺激型抗CD40单抗，可取代CD40L，起着激发CD40分子的作用。根据上述这些因子的作用特点，我们进一步将单核细胞置于上述因子的不同组合之下，分别经过4d和7d的培养，动态观察在诱导DC过程中，DC上CD1a、CD14、CD80和HLA-DR表达的情况，同时也观察gp130分子表达的变化，其结果见表1和表2。在GM-CSF和IL-4的作用下，随着培养时间的延长，DC上的gp130分子的表达在增加，在成熟因子TNFα作用下，gp130分子的表达可进一步增加。在刺激型抗CD40单抗的作用下，DC的数量有了明显的增加，约增加28.9%，而gp130分子的表达也显著增加，但抗CD40单抗和TNFα合用后，gp130分子的表达未见比单用时有明显的增加。