分选型流式细胞仪
流式细胞仪分选原理
流式细胞仪分选原理流式细胞仪是一种高效、快速、准确的细胞分析工具，它能够实现对细胞的快速分类、计数和分选。
其分选原理主要基于光散射和荧光信号的检测与分析。
本文将详细介绍流式细胞仪的分选原理及其应用。
一、光散射的检测与分析流式细胞仪通过激光束照射样品细胞，细胞与光发生相互作用后会发生光散射。
光散射分为前向散射、侧向散射和后向散射三种。
前向散射主要与细胞的大小和形状有关，可用来区分不同类型的细胞。
侧向散射则与细胞的复杂度和颗粒物含量相关，可用来评估细胞的复杂度和颗粒物含量。
后向散射则与细胞的内部结构有关，可用来评估细胞的核质比。
二、荧光信号的检测与分析流式细胞仪通过荧光染料标记的抗体或荧光染料直接标记的细胞，可以检测到细胞表面或内部相关蛋白、DNA或RNA的荧光信号。
这些信号可以用于检测细胞的免疫表型、细胞周期和细胞凋亡等生物学特性。
通过检测细胞的荧光信号，可以实现对不同类型细胞的快速分类和分析。
三、细胞的分选在细胞检测和分析的基础上，流式细胞仪还可以实现对特定类型细胞的分选。
分选是通过细胞仪中的细胞排序系统实现的，通常采用静电分选或压力分选的方式。
静电分选是通过根据细胞的光信号特征将其分为阳性和阴性细胞，然后通过高压电极将细胞引导到相应的收集器中。
压力分选则是通过调整细胞流速和压力差，使目标细胞以一定方式排列并被分选。
四、流式细胞仪在生命科学中的应用流式细胞仪在生命科学研究中具有广泛的应用。
首先，它可以用于免疫表型分析，通过检测细胞表面标记物的荧光信号，可以对细胞的免疫表型进行精确的鉴定。
其次，流式细胞仪可以用于细胞周期分析，通过检测DNA荧光信号的强度，可以确定细胞所处的不同周期阶段。
此外，流式细胞仪还可以用于细胞凋亡分析、细胞功能研究以及肿瘤细胞的分选等。
总结：流式细胞仪的分选原理主要基于光散射和荧光信号的检测与分析。
通过光散射可以评估细胞的大小、形状、复杂度和颗粒物含量等特征，而荧光信号则可以用于检测细胞的免疫表型、细胞周期和细胞凋亡等生物学特性。
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
流式细胞仪细胞分选的操作步骤细胞分选的简要操作步骤一、上样前的准备FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。
1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。
●3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制）●5L 无菌蒸馏水●5L 无菌PBS2、在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。
盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。
安好鞘液筒。
3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。
4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、放上一支装有70 % 乙醇的进样管。
7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
9、从Acquire menu选择SortSetup 。
在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。
按液流控制键RUN。
10、在Setup方框中打叉，点击Acquisition Control菜单中Acquire。
11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
12、再重复上述步骤2次，共需要1h。
13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL 无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。
14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
15、在收集管接口处安装2支新的收集管。
16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
17、点击Acquisition Control菜单中Acquire。
18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
19、再重复上述步骤2次，共需要1h。
20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L 无菌PBS，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
21、在收集管接口处安装2支新的收集管。
22、放上一支装有无菌PBS的进样管。
优选Aria III技术说明
BD Aria III高端分选型流式细胞仪碧迪医疗器械（上海）有限公司生物科学部第一部分高端分选型流式细胞仪产品及市场概述流式细胞仪（Flow Cytometer ,FCM）一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。
概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。
随着各项相关技术的迅速发展，流式细胞技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的重要工具。
我们可以看到，目前全球商业化流式细胞仪产品的研究开发主要遵循两个方向：一类以分析功能为主的，应用于临床检测及常规的科研系统；另一类是具备高速分选功能的高端科研型，研发趋势是越来越多的荧光检测参数，同时越来越快的分选速度，以适应越来越高的科学研究的需求。
在分选型的高端产品来说，BD公司、Dako-Cytomation与Beckman-Coulter公司都相继推出了几代产品。
1999年BD公司在原FACSVantage的基础上，推出了FACSVantage SE（分选升级型，将细胞分选功能推到一个新的高度，25,000个细胞/秒，同时增配Accudrop等选件，使得分选调试变得简单），2000年又在其基础上推出Diva系统，这是一个全数字化的系统，分析速度大大提高，同时做到四路分选。
同期的Beckman-Coulter公司的同类产品是Altra，该产品雷同于BD的FACSVantage SE，但在性能参数方面比FACSVantage SE都要差，竞争力相对较弱，于2003年停产。
同期，在高端分选型流式细胞仪市场上Dako-Cytomation公司于1996年推出了Moflo，这款产品可进行高速分析和分选，但因为操作复杂，性能不稳定而未得到广泛使用，2007年Beckman-Coulter公司在自己无法研发出新一代的流式细胞分选仪的情况下，从DAKO公司收购了Moflo，并更名为Moflo XDP，但并未改变Moflo的硬件结构。
分选型流式细胞仪
650 Short Pass (600SP)
<650 nm
>650 nm
LONG (700nm)
Long Pass
550 Long Pass (650LP) >550 nm <550 nm
Band Pass
600/100 Band Pass (600/100)
550 - 650 nm (600?0)
传统透射光路 ? 采用长通/短通滤光片 ? 光信号经过一次透射，信号损失15-20% ? 多色分析时，荧光检测灵敏度降低
八角形/三角形接收装置-BD专利 ? 采用全反射双色光镜 ? 光信号经过一次反射，信号损失仅5% ? 保证多色分析时的荧光检测灵敏度
光电倍增管
长通双色反光镜 带通滤光片
石英杯流动池
? 直方图：显示单一参数（横坐标）与通道细胞个数（纵坐标） 。一条竖线代表一个细胞信号，多竖线累加形成峰图，一个峰 即一类细胞。
? 二维点图：一个点代表一个细胞信号。
? 等高线图：可显示数据信号的疏密程度。
? 密度图：可显示信号分布的疏密程度。 ? 三维图（3D Plot）等
分选系统
Aria II的喷嘴位于检测点 的下方，因此更换喷嘴后 无需重新调整激光光路
<550 nm & >650 nm
Dichroic Filters
SHORT (500nm)
Transmitted Diflected 90?
650 Short Pass (600SP)
<650 nm >650 nm
550 Long Pass (650LP)
&chromes Overview
FITC/PE 双染样本
分选型流式细胞仪样品标准
分选型流式细胞仪样品标准
分选型流式细胞仪样品标准如下：
1. 样品类型：分选型流式细胞仪的样品应为单细胞悬浮液。
2. 样品浓度：样品浓度应调至1\~10×10^6cells/ml，浓度过高或过低都会对检测结果造成一定的影响。
3. 样品体积：一般实验只需\~ ml的样品即可。
4. 样品容器：细胞样品应放置在BD FALCON352052试管中，否则无法上机。
5. 样品过滤：上机前务必去除样品中的细胞团块，防止管路堵塞，样品必需预先使用300目的尼龙筛网将细胞过滤。
若未过滤样品即上机而引起机器堵塞及损坏，需负赔偿责任。
6. 对照样品设置：流式细胞术的结果分析主要以对照为参考值，因此，每次实验必须设置对照样品。
对照样品的好坏、是否齐全，决定了实验结果的可信度。
关于对照样品的设定可以咨询仪器管理人员。
请注意，以上标准仅供参考，具体标准可能因不同仪器和实验需求而有所不同，建议咨询相关领域的专家或查阅相关文献资料，获取更准确的信息。
分选型流式细胞仪技术规格_百替生物
service@ 分选型流式细胞仪技术规格
一． 主要技术参数：
1. 固定光路、无需激光调节
2. 全自动校准，开机预热既可使用，仪器设置、示踪控制、仪器自检自动化程序
3. 分析速度≥10万细胞/秒，分选速度≥7万细胞/秒，分选纯度＞98%，回收率＞80%
4. 荧光灵敏度：FITC ，PE ≤125MESF
5. 四路分选，成分分选、单克隆细胞分选（玻片分选，6-384孔板分选）
6. 自动精确计算液滴延迟时间
7. 实时全自动监测和稳定液流
8. 检测十个以上荧光参数
9. 无菌分选、液流自动清洗和消毒模式
二． 配置
1. 四根激光及以上（可同时使用），可同时进行9色及以上标记；
标配：488nm 固态激光；633nm 氦氖激光；405nm 紫外激光；375nm （UV ）近紫外激光 选配：561nm 等
2. 温控设备：循环水冷却装置控制细胞收集管温度，可在软件上调整温度
3. 软件系统：全数字化获取/分析软件；自动进行仪器质控；自动补偿和脱机补偿功能；
具有自动设门功能；所有的图像结果以及统计数值可直接输出；最好软件安装和使用没有版权限制，软件可以安装在其他计算机上。
4. 数据存储：双硬盘驱动，配备移动硬盘，保证移动数据备份
5. 液流管道/备用喷嘴：大容量液流车提供空气压力，支持长时间分析分选；内置鞘液缓
冲器，保持鞘液压力恒定无气泡；配合仪器自动软件，自动完成开机、关机、排气泡以及多种仪器清洗和维护程序；喷嘴易于安装，位置固定，无需经验，保证仪器设置的可重复性，节省液流调节时间；需提供备用喷嘴。
分选型流式细胞仪的工作原理
分选型流式细胞仪的工作原理分选型流式细胞仪（sorting flow cytometer）是一种用于细胞分选和分析的高级仪器。
它基于流式细胞仪原理，通过将细胞悬浮液以单个细胞为单位通过检测点，实现对细胞的分选和分析。
本文将详细介绍分选型流式细胞仪的工作原理。
分选型流式细胞仪主要由光学系统、流体系统、信号采集系统和控制系统四个部分组成。
光学系统包括激光器、衍射光学系统和荧光光学系统，用于激发和检测细胞中的荧光标记物。
流体系统包括进样系统和分选系统，用于将细胞引入仪器并进行分选。
信号采集系统包括光敏元件和信号处理电路，用于检测和采集光学信号。
控制系统包括仪器控制软件和数据处理软件，用于控制仪器运行和处理采集到的数据。
在分选型流式细胞仪中，细胞悬浮液首先通过进样系统引入仪器。
进样系统通常采用压力驱动的方式，将细胞悬浮液注入进样装置，然后通过微细管道将细胞单个引入检测点。
进样时，仪器会根据预设的参数对细胞进行分类，将目标细胞和非目标细胞分开。
当细胞通过检测点时，激光器会对细胞进行激发，激发光线经过衍射光学系统和荧光光学系统后，被光敏元件接收。
衍射光学系统通过多个透镜和光栅，将光线聚焦到细胞上，使细胞中的荧光标记物发射出的光线进入荧光光学系统。
荧光光学系统通过滤光片和光学透镜，将目标波长的荧光信号聚焦到光敏元件上。
光敏元件通常是一种高灵敏度的光电二极管或光电倍增管，用于将光信号转换为电信号。
信号处理电路对电信号进行放大、滤波和数字化处理，然后传输到控制系统进行进一步处理。
控制系统根据预设的参数，对采集到的数据进行分析和判断，判断细胞的类型和特征。
根据判断结果，控制系统可以对细胞进行分选。
分选系统通过电磁阀和压力控制装置，将目标细胞和非目标细胞分开。
当控制系统判断某个细胞为目标细胞时，会通过信号控制电磁阀，开启对应的通道，使目标细胞通过分选系统，进入收集装置。
而非目标细胞则会被排除到废液中。
分选型流式细胞仪的工作原理基于光学原理和电子技术，通过对细胞的荧光标记物进行激发和检测，实现对细胞的快速分选和分析。
高速分选型流式细胞仪
功能用途
1.细胞周期测定，DNA 含量分析； 2.细胞凋亡检测； 3.淋巴细胞及其亚群分析分选； 4.细胞活性检Байду номын сангаас； 5.细胞内细胞因子测定； 6.淋巴造血系统及白血病免疫分型分析分选； 7.自身免疫病相关 HLA 抗原分析分选； 8.抑制免疫中的应用； 9.免疫细胞等标记细胞的分析分选。
收费标准
技术参数
高速分选型流式细胞仪 BD FACS AriaIII
1.流式细胞仪主机系统：含 405 紫色激光器，488nm 氩离子蓝色激光 器，561 橙色激光器，633nm 红色激光器，共 4 个激光器；
2.滤光片：405nm 激光的荧光通道包括：450/40,530/30；488nm 激光 的荧光通道包括：488/10,530/30,695/40；561nm 激光的荧光通道包 括：582/15,610/20,670/14,780/60；633nm 激光的荧光通道：660/20， 780/60； 3.光路：双激光立体空间激发方式实现多荧光分析； 4.检测速度：>100000 细胞/秒； 5.荧光检测灵敏度：<125MESF； 6.全峰宽变异系数：CV<2%； 7.可选用荧光：FITC、PE、PI、Percp-cy5.5、PE-Texas Red、PE-cy7、 APC、APC-cy7 等； 8.具备全自动液滴延迟校准系统：配备专用的红色二极管激光，用于 实时精确设定液滴延迟时间，不需要借助荧光显微镜等其它外部设备 或人工读取荧光微球数等方式来进行辅助校准； 9.采用电荷式分选系统，软件自动仪器控制和计算分选设置，液滴监 控；配有 2 路、4 路试管、微孔板（ACDU）等多种收集装置，样本和 分选细胞冷却系统，气溶胶防护系统；配备 70um、85um、100um 喷嘴； 10.分选速度>50，000 个细胞/秒，分选纯度>98%,回收率大于>80%。
简述流式细胞仪细胞分选原理。
简述流式细胞仪细胞分选原理。
流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学领域的实验仪器，主要用于对细胞进行分析、计数和分选。
其原理是通过激光束照射细胞，测量细胞在光学系统中的散射和荧光信号，从而获得有关细胞的信息，并根据设定的参数将细胞进行分选。
流式细胞仪主要由光学系统、流动系统和信号处理系统三个部分组成。
光学系统包括激光器、光学镜头和探测器，用于照射细胞和收集细胞发出的散射和荧光信号。
流动系统包括样本注射器、流动池和流速控制系统，用于将样本中的细胞以单个细胞为单位依次通过光学系统进行测量。
信号处理系统包括放大器、模数转换器和计算机，用于处理和分析收集到的信号，并根据设定的参数进行细胞分选。
在流式细胞仪中，细胞首先通过样本注射器被引入到流动池中，然后通过流速控制系统以恒定的速度流动。
激光器产生的激光束经过光学镜头聚焦后照射到细胞上，细胞与光发生相互作用，产生散射和荧光信号。
光学系统中的探测器收集到的信号经过放大器放大后，转换为模拟电信号，然后通过模数转换器转换为数字信号，最后由计算机进行处理和分析。
细胞在流式细胞仪中的散射信号主要由前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）组成。
前向散射信号与细胞的大小和形状有关，侧向散射信号与细胞的复杂度和内部结构有关。
通过测量前向散射和侧向散射信号的强度，可以初步判断细胞的大小、形态和复杂度。
除了散射信号外，流式细胞仪还可以测量细胞的荧光信号。
在实验前，可以将细胞标记上特定的荧光标记物，如荧光染料或荧光标记的抗体。
这些荧光标记物可以与细胞的特定分子或结构结合，从而在流式细胞仪中产生荧光信号。
通过选择适当的激光器和探测器，可以同时测量多种不同波长的荧光信号，实现多参数的分析。
根据测量到的散射和荧光信号，流式细胞仪可以将细胞分为不同的亚群。
这种分选可以根据细胞的大小、形状、复杂度和荧光信号的强度来进行。
通过设定合适的参数和阈值，可以选择性地收集和分选出感兴趣的细胞亚群。
分选过程可以通过电荷击打、压力击打或光束偏转等方式实现。
流式细胞仪的三大应用范围
2，白血病的免疫分型：
白血病免疫学分型是利用单克隆抗体 (McAb)检测白血病细胞的细胞膜和细 胞浆抗原（CD）,分析其表现型,以了解被 测白血病细胞所属细胞系列（如髓系、 红系、淋巴系等白血病亚型）及其分化 程度。对白血病细胞抗原的分析研究有 助于对白血病分型，为诊断和治疗提供 依据。
举例：T系急性淋巴细胞白血病免疫表 型特点（T-ALL）： 根据T淋巴细胞在胸腺内的成熟顺序， 将T-ALL分为早期、中期和晚期三类。 早期T-ALL：表达CD7和CD1a，CD4、 CD8膜CD3均为阴性；中期T-ALL：除 表达CD7和CD1a外，还表达CD2、 CD5，CD4/CD8同时表达，膜CD3仍为 阴性；晚期T-ALL：膜CD3为阳性，但 丢掉CD1a，其他标志同中期。通过检测 CD抗原来确定白血病分期。
流式细胞仪的主要应用范围
• 1，流式细胞仪的免疫荧光检测； • 2，流式细胞仪的细胞周期检测； • 3，流式细胞仪的细胞分选；
（一）在免疫学中的应用 ----重要的免疫学实验技术
• 抗原(antigen，Ag)是指能刺激机体 免疫系统诱导免疫应答并能与应答 产生如抗体或致敏淋巴细胞发生特 异反应的物质。 • 抗原多为相对分子质量在10,000以上 的蛋白质和多糖大分子.
File: 2006/9/20 Yang.002 Acquisition Date: 19-Sep-06 Quad Events % Gated % Total X UL 2 0.03 0.02 UR 121 1.57 1.21 LL 5939 77.05 59.39 1646 21.35 16.46 LR
File: 2005/2/28 319 Zho Acquisition Date: 28-Fe R1 Quad% Gate % Tota UL 23.30 9.77 UR 1.86 0.78 LL 16.24 6.81 LR 58.60 24.57
MoFloXDP高速分选型流式细胞仪
MoFlo XDP高速分选型流式细胞仪
使用方法：
1.开启稳压器和服务器（一般为开启状态）。
2.开启触摸屏边框右侧开关。
3.添加鞘液，清空废液。
4.开启空气压缩机和负压泵。
5.开启压力表（垂直方向为开启状态）。
6.开启激光器（蓝光和紫外，先开开关后开锁；红光开启钥匙后需要软件开启），
并在触摸屏上开启相应激光开关）。
7.校准液流。
8.开启软件（Summit 5.2）。
9.荧光素调节光斑。
10.荧光微球校准光路。
11.建立合适实验方案并上样检测。
12.测样结束后，触摸屏上关闭激光器 shutter 。
13.关闭激光器（先关钥匙，再关开关；红光只关钥匙）。
14.清洗机器（高压力差下用清洗液洗 5-10 分钟，后用水洗 15 分钟）。
15.关液流（触摸屏上红色按钮）。
16.依次关闭压力表，负压泵和空气压缩机。
17.释放鞘液桶压力。
18.关闭触摸屏（右侧边框开关）。
注意事项：
1.稳压器和服务器只有很长的假期才关掉（关服务器时，要先关触摸屏上的电
源按钮，然后再关服务器上的按钮，稳压器关前后开关）。
2.注意开关机顺序：先关软件后关机，先开机后开软件。
3.加入新的鞘液时，需静置 10 分钟左右，以免液流中产生大量气泡影响使用。
4.压力表开启后，鞘液、废液、清洗液的压力显示分别为 25%，25%，-15%- -
30% 为正常，若不正常请重新打开盖，再次盖好。
5.紫外激光器不用要及时关掉。
流式细胞仪结果分析
CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例
六、自身免疫病相关HLA抗原分析
HLA-B27可出现在58%～97%的强直 性脊椎炎 As 患者
七、移植免疫中的应用
FCM作为一个强大的技术平台,已应用于多个领 域,其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛， 目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞 术的交叉配型 Flow cytometry cross-matching, FCXM 和群体反应性抗体 Panel reactive antibody, PRA 检测，
样本来源：各种细胞 如外（ZHOU）血,骨 髓,实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞 ,微生 物,人工合成微球等， 检测大小：一般是0.5um～40um
流式细胞仪的组成
液流系统 光学系统 数据处理系统
分选系统
分析型流式细胞仪
分选型流式细胞仪
液1 液流流系统
流动室
流动室 Flow cell 是液流系统的核心部件,流动室是由石英 玻璃制成,单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕通过流动 室内一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光 垂直相交，
荧光染料的特性
•激发波长 EXCITING •发射波长 EMISSION
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选主 要是在对具有某种特征的细胞需进 一步培养和研究时进行的，
一 分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
微小的乳胶微球分别染成上百 种不同的荧光色 固相芯片是用 探针在芯片上的坐标位置给基 因的特异性编码；而液相芯片 则是用颜色来编码
流式细胞仪分类
流式细胞仪分类1. 简介流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种常用的生物学实验仪器，用于对细胞进行分类和分析。
它通过将细胞悬浮液注入仪器中，利用激光束照射细胞，测量细胞在不同参数上的散射和荧光信号，从而对细胞进行分类和计数。
流式细胞仪广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
2. 流式细胞仪的分类方式根据不同的参数和功能，流式细胞仪可以分为以下几种类型：2.1. 基础型流式细胞仪基础型流式细胞仪是最常见的类型，它可以测量细胞在不同波长的激光照射下的散射和荧光信号。
基础型流式细胞仪通常具有多个激光器和多个探测器，可以同时测量多个参数。
常见的参数包括细胞大小、形态、颜色、荧光标记物等。
2.2. 高通量流式细胞仪高通量流式细胞仪是一种能够快速处理大量样本的流式细胞仪。
它通常具有多个样本载体和多个样本接口，可以同时处理多个样本，提高实验效率。
高通量流式细胞仪广泛应用于大规模细胞筛选、细胞库构建和高通量药物筛选等领域。
2.3. 分选型流式细胞仪分选型流式细胞仪是一种能够根据细胞的特定特征进行分选的流式细胞仪。
它通常具有一个或多个分选器，可以根据预设的分选条件将特定类型的细胞分选出来。
分选型流式细胞仪广泛应用于细胞克隆、单细胞测序和细胞治疗等领域。
2.4. 成像型流式细胞仪成像型流式细胞仪是一种能够对细胞进行高分辨率成像的流式细胞仪。
它通常具有高倍率物镜和高灵敏度的相机，可以对细胞进行三维成像和时间序列成像。
成像型流式细胞仪广泛应用于细胞动力学研究、细胞迁移和细胞内信号传导等领域。
3. 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理包括激光照射、散射信号检测和荧光信号检测三个步骤。
3.1. 激光照射流式细胞仪通过激光器产生高能量的激光束，将激光束聚焦到细胞悬浮液中的单个细胞上。
激光束的波长和功率可以根据需要进行选择，常用的波长包括488nm、532nm和633nm等。
3.2. 散射信号检测当激光束照射到细胞上时，细胞会发生散射现象。
流式细胞仪分选细胞原理
流式细胞仪分选细胞原理
流式细胞仪是一种高精度、高效率的细胞分选技术，该技术在医学、生物学、药物研发、食品检测等领域有着广泛的应用。
流式细胞仪分选细胞的原理是通过激光束的照射使
待分选的细胞产生荧光信号，然后将荧光信号接收并转化为数字信号，最后根据设定的参
数进行细胞分选。
流式细胞仪分选细胞的过程包括以下几个步骤：
1.样品制备：待分选的细胞需要首先被采集并经过简单的前处理才能够被流式细胞仪
处理。
在样品的制备过程中，需要防止细胞的死亡、凝聚和损伤等现象的发生，以保证细
胞处理的准确性。
2.细胞计数：在样品制备完成后，需要使用特定的设备对待分选的细胞进行计数，并
将计数结果转化为一个数字信号。
这个数字信号是后续对细胞进行分选的依据之一。
3.细胞样品的荧光染色：待分选的细胞需要进行荧光染色，以便在流式细胞仪中能够
产生荧光信号。
荧光染色的目的是使待分选的细胞在流式细胞仪中产生荧光信号，从而增
加细胞的识别和选取的准确性和灵敏度。
5.收集、保存和分析细胞：在细胞分选完成后，需要将被选取的细胞进行保存和分析。
在这一过程中，需要注意保障细胞的完整性和稳定性，同时需要对细胞进行进一步的分析
和处理。
总的来说，流式细胞仪分选细胞的原理是通过激光束的照射和荧光信号的转化，在保
证细胞完整性和稳定性的前提下，对细胞进行高精度、高效率的分选。
这种技术已经成为
了生命科学和医学领域中极其重要的技术手段之一，为科学研究、临床诊断和治疗等方面
提供了强有力的支持。
流式细胞仪分选原理
流式细胞仪分选原理
流式细胞仪分选是一种利用流式细胞仪对细胞进行快速分选的技术，其原理如下：
1. 细胞样品进样：将待分选的细胞样品通过一根细管引入流式细胞仪中。
为了确保样品中的细胞以单细胞悬浮状态进入流式细胞仪，通常需要对样品进行预处理，如细胞颗粒过滤、细胞悬浮液制备等。
2. 细胞激发：细胞进入流式细胞仪后，可通过激光束对细胞进行激发。
不同类型的流式细胞仪激光束的波长和强度可以根据不同的应用需要进行调节。
3. 光散射和荧光信号检测：细胞被激发后，会发出散射光和荧光信号。
流式细胞仪通过一组透镜和光电倍增管（PMT）对
这些信号进行检测。
在散射光信号检测中，主要有前向散射光信号（FSC）和侧向散射光信号（SSC）。
荧光信号检测则是
根据不同的细胞标记物使用不同的激光和荧光色素，通过检测荧光信号来确定不同类型的细胞。
4. 制定分选策略：根据细胞的特定参数，如大小、形状和荧光表达，可以通过设置特定的门限值和筛选条件来制定分选策略。
5. 细胞分选：根据制定的分选策略，流式细胞仪将符合条件的细胞通过电荷静电作用或压力差分选到不同的集合管中。
通常，可以通过开启或关闭电荷静电作用板上的电场或调节气泡的位置来控制细胞的分选方向。
6. 分选结果分析：将分选好的细胞进行培养、鉴定或其他实验，对细胞分选的结果进行进一步的分析和应用。
总结起来，流式细胞仪分选原理主要包括细胞样品进样、细胞激发、光散射和荧光信号检测、制定分选策略、细胞分选和分选结果分析等步骤。
流式细胞分选仪使用说明
流式细胞分选仪使用说明1. 依次打开稳压电源、主机电源并启动计算机。
2. 运行软件并联机。
3. 确认Sort、Configuration与仪器硬件一致（喷嘴口径）。
4. CST校正Laser Delay、各接收通道是否工作正常。
5. 观察液流是否稳定，调Ampl找维持分选支稳定的平台期（Drop1、Gap）。
6. 分选支彼此分离、稳定，在观测窗口中亮点清晰可见，调千分目确保左支最亮。
7. 用AccuDrop微球确定当前液流条件的Drop Delay值。
8. 用与实际收集管一样的管子，与实际收集液相同的体积做分选支位置调节。
9. 调节各分选支位置，使其落在收集管的液面上（液流打管壁严重影响分选活性）。
10. 尽量使用规则的、边数少、逻辑关系简化的分选门，并严格设定阴阳性界限。
11. 用3ml FACSClean洗液外管清洗1min ，内管清洗5-10分钟。
12. 用3ml去离子水洗液外管清洗1min ，内管清洗10分钟。
13. 执行仪器关闭Shutdown程序。
14. 关闭仪器、退出软件。
15. 依次关闭计算机、仪器电源、稳压电源。
流式细胞分选仪使用注意事项1. 重点实验室流式中心流式细胞仪使用者需完成流式中心及本课题组培训，考核合格，方可独立操作使用流式细胞仪。
不具有独立使用资格的，需在有资格的使用者指导下使用仪器。
2. 使用流式分选检测的样本浓度应控制为1x107/ml左右。
3. 使用流式分选的，样本需保证绝对无菌，有菌样本禁止使用流式分选。
4. 流式分选样本上机前应使用300目滤网过滤，避免细胞团块堵塞上样针。
5. 如需使用流式紫外激光器的，需提前通知流式中心管理员，开启紫外激光器，使用后主动关闭激光器。
6. 仪器使用者应于当天将使用流式细胞仪获得的数据通过数据上传系统上传或拷贝到自己的存储器中，并从电脑上删除文件。
7. 仪器使用过程遇到故障时，使用者应立刻停止实验，通知流式中心管理员，由管理员进行处理。
BDFACSAriaⅢ分选型流式细胞仪使用知情同意书
BD FACSAria Ⅲ分选型流式细胞仪使用知情同意书BD FACSAria Ⅲ分选型流式细胞仪包含三根激光器：488nm蓝色激光器、633nm红色激光器、375近紫外激光器。
检测参数：9色荧光和前、侧向散射光，共检测11个流式参数。
现将有关使用注意事项告知如下：1、专人使用：该仪器必须由已培训合格的人员严格按照操作规程操作。
2、预约：请与仪器管理人员沟通后至少提前一天预约，但不接受提前超过2周以上的预约；预约前请提前联系仪器管理人员，确定实验细节及具体上机时间，再进行网上预约（未行预约者无法进行实验）；不能按预约时间使用流式时，至少提前一天取消预约，否则将正常收费。
3、使用登记：仪器使用完毕后，切记如实进行仪器使用记录登记，管理人员会核对是否与预约记录的一致性。
4、随时保持清洁：禁止随手乱放杂物（如一次性手套、塑胶手套，用完的样品等）。
走前请带走制造的垃圾（包括细胞垃圾、耗材垃圾和生理盐水瓶等）。
5、样本要求：分选实验要求样本细胞总数约1×107，送样前必须经300目筛网过滤，以防堵塞喷嘴。
6、安全使用：对有毒或有污染的样品需提前说明，严禁随处乱放。
7、收费方法：分析：30元/管，实验所需所有试剂耗材自备（价格参考价目表）；分选：从预约时间开始计时，开机费200元，检测费400元/小时；如机器调试失败，则只收取开机费；实验所需所有试剂耗材自备（价格参考价目表）；在正确的实验操作过程中，属于正常损耗或因仪器质量原因发生的失准，检测费用概不退还；如因送样者细胞处理不当堵塞喷嘴，导致实验结果失准，检测费用概不退还并追究责任。
8、处罚措施：由于样本处理违反操作规程而造成仪器设备损坏，应追究当事人责任，并视情节轻重按原价的10%-80%赔偿。
请遵守上述规则，对违规者将交由学校有关部门处理进行登记通报。
价目表本人已阅读上述使用注意事项，并同意。
实验者签字：联系电话：时间：年月日。
多参数分选型流式细胞仪(FCM)论证报告(精)
多参数分选型流式细胞仪(FCM)论证报告实验室名称：江苏大学医学技术实验教学中心一、仪器设备名称：多参数分选型流式细胞仪二、仪器设备规格、型号、技术指标及功能1、设备规格、型号BD FACS Aria II2、技术指标及功能石英杯流动检测池荧光检测灵敏度度及佳，〈125 MESF可以使用达三根激光：激光波长为488nm、633nm和407nm获取速度达70,000细胞/秒，分析速度达50,000细胞/秒多色分析，分析参数可达15色之多完全数字化电子处理系统，分辨率达262,144道，分选精度达1/32液滴液流系统车装载鞘液、废液和洗液，液流自动控制系统，软件自动清洗程序进样仓自动加压，自动混匀样本，自动冲洗进样管路喷嘴选择70mm或100mm，满足绝大多数细胞分选的要求，喷嘴拆换简便、精确两管或四管分选，可以使用多种规格的收集管配件BD ACDU装置，可以在微孔板或载波片上定量分选细胞软件自动仪器控制和计算分选设置，液滴监控，自动检查堵塞样本和分选细胞冷却系统配件BD AMO，工作时控制浮质，避免污染工作无特殊环境要求，不需要额外辅助设备流式细胞仪（Flow Cytometer, FCM ）流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是基于流式细胞仪的一种在形态和功能水平上对微粒(包括真核、原核细胞，细胞器以及其他颗粒)进行定量分析和分选的新型技术。
流式细胞仪作为一种最先进的细胞定性和定量分析仪器，具有以下特点：①速度快，每秒可测量数万个细胞；②精度高；③准确性好；④多参数测量，可以同时对同一个微粒做有关物理、化学和生物特性的多参数测量；⑤是学科交叉的结晶，它综合了激光、计算机、流体力学、细胞生物学、生物化学、图像分析等领域的知识和成果。
1.在白血病临床诊断、疗效和预后观察中的应用：白血病等肿瘤细胞个体差异很大，目前除了病理形态学分析和临床症状分析外，流式细胞对白血病的分型是临床诊断白血病重要依据，是国际公认定基本手段之一。
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• 直方图：显示单一参数（横坐标）与通道细胞个数（纵坐标） 。一条竖线代表一个细胞信号，多竖线累加形成峰图，一个峰 即一类细胞。 • 二维点图：一个点代表一个细胞信号。 • 等高线图：可显示数据信号的疏密程度。 • 密度图：可显示信号分布的疏密程度。 • 三维图（3D Plot）等
分选系统
1检测 Aria II的喷嘴位于检测点 的下方，因此更换喷嘴后 无需重新调整激光光路 2充电
3偏转
4收集
流式细胞仪分选要素
• 分析结果精准：需要高灵敏度和分辨率-石英杯流动池 • 分选细胞纯度：需要对目标细胞的准确定位-Accudrop和Sweetspot技 术 • 分选速度：保证纯度前提下高度分选-分选速度70 ,000个细胞/秒
• 分选后活性：需要整个系统各环节对细胞的保护-石英杯流动池，自动 无菌管路清洗，温控
Band Pass
650 Short Pass (600SP) <650 nm >650 nm
550 Long Pass (650LP) >550 nm <550 nm
600/100 Band Pass (600/100) 550 - 650 nm (600?0) <550 nm & >650 nm
• • • • 细胞本身 激光功率 液路系统（喷嘴） 分选系统的洁净程度及温度控制
石英杯激发保证了用小功率激 光的效率远远大于大功率空气 激发的效率，光毒性小，很好 的保证细胞活性。
稳定而零剪切力液流系统设计最大程度的保 证了细胞的活性，同时专利的喷嘴设计，进 一步保证了细胞活性。
Aria Ⅱ自动无菌消毒清洗 • 软件向导清洗自动执行 • 无菌分选结果保证，文献支持
•
预先分选Accudrop荧光微球
•
• •
自动准确设置最佳液滴延迟时间
无需手动调节，减少人为误差 保证实验的分选纯度和得率
Sweet Spot自动监控功能
• 液滴断点监测窗口 • 自动调节振幅，维持断点稳定 • 维持最佳液滴延迟状态 • 仪器阻塞报警，保护分选样本不受污染 ，实现分选时无人看管
影响分选细胞的活性的因素：
传统透射光路 • 采用长通/短通滤光片 • 光信号经过一次透射，信号损失15-20% • 多色分析时，荧光检测灵敏度降低
八角形/三角形接收装置-BD专利 • 采用全反射双色光镜 • 光信号经过一次反射，信号损失仅5% • 保证多色分析时的荧光检测灵敏度
光电倍增管
长通双色反光镜
带通滤光片
• 细胞通过激光束的流速变慢，激光 照射时间更长，提高了激光激发效 率
既有样本温控系统也有收集仓温控
全自动标准化的无菌清洗流程，密闭式的上 样和分选收集仓，执行一次可以保证整个管 路系统在以后连续4天内菌量为0的最佳效果。
Cytometer Setup & Tracking System
• • • • • • 采用一管CS&T微球，方便检测 微球染料可以被任意激光激发，涵盖常 用染料荧光波谱 自动调整PMT 报告仪器性能参数：Qr，Br，CV，跟 踪仪器状态 自动调整激光延迟和面积因子 BD公司专利技术
• 流动池被光胶耦合在荧光接收物镜 上，提高了荧光收集效率，保证多 色应用中最佳的灵敏度和分辨率 • 固定光路，无需每日调节，机器随 开随用，减少人为可变性，提高实 验重复性
石英杯流动池
Cells injected
Laser
Nozzle
• 定义：Drop delay即液滴延迟时 间，指细胞通过检测区到液滴分离 的间隔时间
• 仪器性能状态稳定性：质控程序的监控和调整-CS&T仪器质控程序及仪 器状态监控
高灵敏度-弱表达样本检测
Dim staining PE population visible
Dim staining
高灵敏度——稀有样本检测
待测细胞细胞群的比例 并不总是这么高 有时，很低 十万分之一
此时，灵敏度和分辨率至关重要
• 基因编码蛋白
细胞内标记
• 磷酸化蛋白： • 接收刺激后细胞的动态反应 • 刺激因子对特异位点的作用 • 检测转录后调控 • 特殊蛋白在正常及异常细胞的表达
细胞周期分析
• DNA含量分析 • DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志，有助于癌 变的早期诊断
细胞凋亡
• • • • • 早早期细胞凋亡检测-半胱氨酸蛋白酶法 早期细胞凋亡检测-Annexin-V/PI法 早期细胞凋亡检测-细胞线粒体膜蛋白法 晚期细胞凋亡检测-TUNEL法 晚晚期细胞凋亡检测-DNA含量分析法
Drop delay • 意义： Drop delay如果能够被准 确确定，就可以保证包裹细胞的液滴 表面不会充上相反的电荷，从而实现 最高的分选纯度及细胞得率
+ +
+
传统液滴延迟时间确定
耗时：0.5到1.5小时 辅助材料：荧光微球、荧光显微镜、 玻片、计算器
• BD 独有专利 Accudrop 技术： Accudrop微球是一种荧光微球， 被位于偏转板下方的红激光激发后，发射光可以透过侧液流监视器 前方的滤光片，用于测量drop delay。
FACSAriaⅡ 分选型流式细胞仪
BD公司生物科学部
BD公司流式细胞仪
FACSCalibur
FACSAriaII
Influx
FACSJazz
LSRII
FACSCantoII
LSRFortessa
FACSVerse
Accuri C6
BD FACSAriaII－分选型流式细胞仪
2008年最新产品
集多种专利技术和完美设计
流式细胞仪组成
• 液流系统
• 光学系统
• 电子系统
• 数据储存与分析系统
• 分选系统
液流系统
样品流速的选择
• 低流速：一般用于分辨率较高的分析，如DNA分析 • 高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，影响 分型。
光学系统
光信号
FSC detector
Freq
Fluorescence
模拟数字转换器
数据储存与分析系统
数据储存
List-Mode Data
Time FSC SSC FITC PE Event 1 0 60 120 39,271 39,271 89 675 Event 2 Event 3
10 30 160 650 65
FITC/PE 双染样本
39,271 30,621
Fluorochromes Overview
1
2
3
电子系统
• 光电转换器：将光信号转换成电信号
光电二极管 光电倍增管（PMT）
• 放大器两种放大方式：
线性放大（lin）
对数放大（log）
线性放大：按光强度的线性关系输出信号。用于FSC， SSC， 细胞周期检测，SP细胞检测及分选等。
Transmitted Blocked
LONG (700nm)
Dichroic Filters
SHORT (500nm)
650 Short Pass (600SP) <650 nm >650 nm
550 Long Pass (650LP) >550 nm <550 nm
Transmitted Diflected 90
细胞生理学研究
• 细胞活性分析：Fluorescein Diacetate进入活细胞后， 被胞内酯酶讲解，生成荧光底物，活细胞会发绿色荧光
细胞膜表面标记
• • • • • 淋巴细胞亚群/活化分析 血小板分析 造血干细胞检测 肿瘤细胞标志物检测 白血病免疫分型
细胞内标记
• 细胞内细胞因子
细胞内标记
染色体分选
肿瘤干细胞分选
转染细胞分选
流式网络资源
关键词搜索：FCM，FACS，流式 （中文）
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基本概念
流式细胞术(Flow Cytometry,简称FCM)是一种快速、准 确、客观的同时检测直线流动状态中单个颗粒多项物理 及生物学特性，加以分析定量的技术，并可以对特定群 体加以分选。 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物及 人工合成微球等。 流式细胞仪(Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技 术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技 术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
对数放大：按光强度的对数关系输出信号。用于大多数 荧光染色实验。
电脉冲信号类型：
高度信号H
宽度信号W 面积信号A
脉冲面积
脉冲高度 0
电压
脉冲 宽度
时间 (µ 秒)
细胞周期中粘联体区分
阈值
用于屏蔽噪音信号和碎片信号，只有高于等于阀值道数的 信号才会被送入计算机进行处理。
Area Height
Threshold
CS&T仪器质控程序及仪器状态监控
流式细胞术操作流程
• 样品制备 • 流式染色、检测 • 数据分析
细胞悬液的制备
• 单细胞悬液（天然，机械研磨/消化） • 5×105～1×106cells/ml，约0.5～1ml，300目筛网过滤
设置对照及染色
• 阴性对照：自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的 荧光。自发荧光信号为噪声信号。 • 同型对照：自发荧光＋非特异荧光，使用与一抗相同种属来源、相同亚 型、相同剂量的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合产生的背 景染色 • 实验样本：自发荧光＋特异荧光＋非特异荧光 • 补偿对照：双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时，使用单种荧光 素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色， 纠正荧光素发射光谱重叠，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他 的干扰荧光信号