分选型流式细胞仪
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6,189
May be exported as FCS file
160 22,688
89
FITC-A
PE-A
675 30,621
FITC-A
PE-A
数据显示
• • • • • 直方图（Histogram） 二维点图（Dot Plot） 等高线图（Contour Plot） 密度图（Density） 三维图（3D Plot）等
细胞生理学研究
• 细胞活性分析：Fluorescein Diacetate进入活细胞后， 被胞内酯酶讲解，生成荧光底物，活细胞会发绿色荧光
细胞膜表面标记
• • • • • 淋巴细胞亚群/活化分析 血小板分析 造血干细胞检测 肿瘤细胞标志物检测 白血病免疫分型
细胞内标记
• 细胞内细胞因子
细胞内标记
3偏转
4收集
流式细胞仪分选要素
• 分析结果精准：需要高灵敏度和分辨率-石英杯流动池 • 分选细胞纯度：需要对目标细胞的准确定位-Accudrop和Sweetspot技 术 • 分选速度：保证纯度前提下高度分选-分选速度70 ,000个细胞/秒
• 分选后活性：需要整个系统各环节对细胞的保护-石英杯流动池，自动 无菌管路清洗，温控
对数放大：按光强度的对数关系输出信号。用于大多数 荧光染色实验。
电脉冲信号类型：
高度信号H
宽度信号W 面积信号A
脉冲面积
脉冲高度 0
电压
脉冲 宽度
时间 (µ 秒)
细胞周期中粘联体区分
阈值
用于屏蔽噪音信号和碎片信号，只有高于等于阀值道数的 信号才会被送入计算机进行处理。
Area Height
Threshold
• 用同型对照或阴 性对照管调节电 压使阴性群位于 “左下角” • 用单阳性管依次 调节相邻荧光之 间补偿，如 FL1-%FL2， FL2-%FL1
流式细胞术的应用
• • • • • • 细胞生理学研究 细胞膜表面标记 细胞内标记 细胞周期分析 凋亡分析 „„ • • • • • • 染色体分选 单克隆细胞分选 肿瘤干细胞分选 转染细胞分选 免疫或免疫相关细胞分选 „„
基本概念
流式细胞术(Flow Cytometry,简称FCM)是一种快速、准 确、客观的同时检测直线流动状态中单个颗粒多项物理 及生物学特性，加以分析定量的技术，并可以对特定群 体加以分选。 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物及 人工合成微球等。 流式细胞仪(Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技 术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技 术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
模拟数字转换器
数据储存与分析系统
数据储存
List-Mode Data
Time FSC SSC FITC PE Event 1 0 60 120 39,271 39,271 89 675 Event 2 Event 3
10 30 160 650 65
FITC/PE 双染样本
39,271 30,621
Drop delay • 意义： Drop delay如果能够被准 确确定，就可以保证包裹细胞的液滴 表面不会充上相反的电荷，从而实现 最高的分选纯度及细胞得率
+ +
+
传统液滴延迟时间确定
耗时：0.5到1.5小时 辅助材料：荧光微球、荧光显微镜、 玻片、计算器
• BD 独有专利 Accudrop 技术： Accudrop微球是一种荧光微球， 被位于偏转板下方的红激光激发后，发射光可以透过侧液流监视器 前方的滤光片，用于测量drop delay。
• 直方图：显示单一参数（横坐标）与通道细胞个数（纵坐标） 。一条竖线代表一个细胞信号，多竖线累加形成峰图，一个峰 即一类细胞。 • 二维点图：一个点代表一个细胞信号。 • 等高线图：可显示数据信号的疏密程度。 • 密度图：可显示信号分布的疏密程度。 • 三维图（3D Plot）等
分选系统
1检测 Aria II的喷嘴位于检测点 的下方，因此更换喷嘴后 无需重新调整激光光路 2充电
染色体分选
肿瘤干细胞分选
转染细胞分选
流式网络资源
关键词搜索：FCM，FACS，流式 www.bdbiosciences.com www.cytometry.cn（中文）
谢谢！ 谢谢！
Band Pass
650 Short Pass (600SP) <650 nm >650 nm
550 Long Pass (650LP) >550 nm <550 nm
600/100 Band Βιβλιοθήκη Baiduass (600/100) 550 - 650 nm (600?0) <550 nm & >650 nm
Transmitted Blocked
LONG (700nm)
Dichroic Filters
SHORT (500nm)
650 Short Pass (600SP) <650 nm >650 nm
550 Long Pass (650LP) >550 nm <550 nm
Transmitted Diflected 90
Fluorochromes Overview
1
2
3
电子系统
• 光电转换器：将光信号转换成电信号
光电二极管 光电倍增管（PMT）
• 放大器两种放大方式：
线性放大（lin）
对数放大（log）
线性放大：按光强度的线性关系输出信号。用于FSC， SSC， 细胞周期检测，SP细胞检测及分选等。
• 基因编码蛋白
细胞内标记
• 磷酸化蛋白： • 接收刺激后细胞的动态反应 • 刺激因子对特异位点的作用 • 检测转录后调控 • 特殊蛋白在正常及异常细胞的表达
细胞周期分析
• DNA含量分析 • DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志，有助于癌 变的早期诊断
细胞凋亡
• • • • • 早早期细胞凋亡检测-半胱氨酸蛋白酶法 早期细胞凋亡检测-Annexin-V/PI法 早期细胞凋亡检测-细胞线粒体膜蛋白法 晚期细胞凋亡检测-TUNEL法 晚晚期细胞凋亡检测-DNA含量分析法
流式细胞仪组成
• 液流系统
• 光学系统
• 电子系统
• 数据储存与分析系统
• 分选系统
液流系统
样品流速的选择
• 低流速：一般用于分辨率较高的分析，如DNA分析 • 高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，影响 分型。
光学系统
光信号
FSC detector
Freq
Fluorescence
细胞生理学研究
• 细胞相对大小和颗粒性分析
细胞生理学研究
• 细胞内PH值检测
细胞生理学研究
• Ca2+流动性检测：Ca2+是非常重要的细胞内离子，在细 胞膜到细胞浆的信号传导中起重要的作用。细胞受到刺 激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。 • 最常用的染料：Indo-1,Fluo-3,Fura red
FACSAriaⅡ 分选型流式细胞仪
BD公司生物科学部
BD公司流式细胞仪
FACSCalibur
FACSAriaII
Influx
FACSJazz
LSRII
FACSCantoII
LSRFortessa
FACSVerse
Accuri C6
BD FACSAriaII－分选型流式细胞仪
2008年最新产品
集多种专利技术和完美设计
SSC and Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
前向角散射光信号
11
侧向角散射光信号
荧光信号
Wavelengths
LONG (700nm)
Short Pass Pass Through Filters
SHORT (500nm)
Long Pass
• 仪器性能状态稳定性：质控程序的监控和调整-CS&T仪器质控程序及仪 器状态监控
高灵敏度-弱表达样本检测
Dim staining PE population visible
Dim staining
高灵敏度——稀有样本检测
待测细胞细胞群的比例 并不总是这么高 有时，很低 十万分之一
此时，灵敏度和分辨率至关重要
CS&T仪器质控程序及仪器状态监控
流式细胞术操作流程
• 样品制备 • 流式染色、检测 • 数据分析
细胞悬液的制备
• 单细胞悬液（天然，机械研磨/消化） • 5×105～1×106cells/ml，约0.5～1ml，300目筛网过滤
设置对照及染色
• 阴性对照：自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的 荧光。自发荧光信号为噪声信号。 • 同型对照：自发荧光＋非特异荧光，使用与一抗相同种属来源、相同亚 型、相同剂量的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合产生的背 景染色 • 实验样本：自发荧光＋特异荧光＋非特异荧光 • 补偿对照：双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时，使用单种荧光 素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色， 纠正荧光素发射光谱重叠，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他 的干扰荧光信号
传统透射光路 • 采用长通/短通滤光片 • 光信号经过一次透射，信号损失15-20% • 多色分析时，荧光检测灵敏度降低
八角形/三角形接收装置-BD专利 • 采用全反射双色光镜 • 光信号经过一次反射，信号损失仅5% • 保证多色分析时的荧光检测灵敏度
光电倍增管
长通双色反光镜
带通滤光片
• 细胞通过激光束的流速变慢，激光 照射时间更长，提高了激光激发效 率
• 流动池被光胶耦合在荧光接收物镜 上，提高了荧光收集效率，保证多 色应用中最佳的灵敏度和分辨率 • 固定光路，无需每日调节，机器随 开随用，减少人为可变性，提高实 验重复性
石英杯流动池
Cells injected
Laser
Nozzle
• 定义：Drop delay即液滴延迟时 间，指细胞通过检测区到液滴分离 的间隔时间
•
预先分选Accudrop荧光微球
•
• •
自动准确设置最佳液滴延迟时间
无需手动调节，减少人为误差 保证实验的分选纯度和得率
Sweet Spot自动监控功能
• 液滴断点监测窗口 • 自动调节振幅，维持断点稳定 • 维持最佳液滴延迟状态 • 仪器阻塞报警，保护分选样本不受污染 ，实现分选时无人看管
影响分选细胞的活性的因素：
• • • • 细胞本身 激光功率 液路系统（喷嘴） 分选系统的洁净程度及温度控制
石英杯激发保证了用小功率激 光的效率远远大于大功率空气 激发的效率，光毒性小，很好 的保证细胞活性。
稳定而零剪切力液流系统设计最大程度的保 证了细胞的活性，同时专利的喷嘴设计，进 一步保证了细胞活性。
Aria Ⅱ自动无菌消毒清洗 • 软件向导清洗自动执行 • 无菌分选结果保证，文献支持
既有样本温控系统也有收集仓温控
全自动标准化的无菌清洗流程，密闭式的上 样和分选收集仓，执行一次可以保证整个管 路系统在以后连续4天内菌量为0的最佳效果。
Cytometer Setup & Tracking System
• • • • • • 采用一管CS&T微球，方便检测 微球染料可以被任意激光激发，涵盖常 用染料荧光波谱 自动调整PMT 报告仪器性能参数：Qr，Br，CV，跟 踪仪器状态 自动调整激光延迟和面积因子 BD公司专利技术
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FITC-A
PE-A
675 30,621
FITC-A
PE-A
数据显示
• • • • • 直方图（Histogram） 二维点图（Dot Plot） 等高线图（Contour Plot） 密度图（Density） 三维图（3D Plot）等
细胞生理学研究
• 细胞活性分析：Fluorescein Diacetate进入活细胞后， 被胞内酯酶讲解，生成荧光底物，活细胞会发绿色荧光
细胞膜表面标记
• • • • • 淋巴细胞亚群/活化分析 血小板分析 造血干细胞检测 肿瘤细胞标志物检测 白血病免疫分型
细胞内标记
• 细胞内细胞因子
细胞内标记
3偏转
4收集
流式细胞仪分选要素
• 分析结果精准：需要高灵敏度和分辨率-石英杯流动池 • 分选细胞纯度：需要对目标细胞的准确定位-Accudrop和Sweetspot技 术 • 分选速度：保证纯度前提下高度分选-分选速度70 ,000个细胞/秒
• 分选后活性：需要整个系统各环节对细胞的保护-石英杯流动池，自动 无菌管路清洗，温控
对数放大：按光强度的对数关系输出信号。用于大多数 荧光染色实验。
电脉冲信号类型：
高度信号H
宽度信号W 面积信号A
脉冲面积
脉冲高度 0
电压
脉冲 宽度
时间 (µ 秒)
细胞周期中粘联体区分
阈值
用于屏蔽噪音信号和碎片信号，只有高于等于阀值道数的 信号才会被送入计算机进行处理。
Area Height
Threshold
• 用同型对照或阴 性对照管调节电 压使阴性群位于 “左下角” • 用单阳性管依次 调节相邻荧光之 间补偿，如 FL1-%FL2， FL2-%FL1
流式细胞术的应用
• • • • • • 细胞生理学研究 细胞膜表面标记 细胞内标记 细胞周期分析 凋亡分析 „„ • • • • • • 染色体分选 单克隆细胞分选 肿瘤干细胞分选 转染细胞分选 免疫或免疫相关细胞分选 „„
基本概念
流式细胞术(Flow Cytometry,简称FCM)是一种快速、准 确、客观的同时检测直线流动状态中单个颗粒多项物理 及生物学特性，加以分析定量的技术，并可以对特定群 体加以分选。 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物及 人工合成微球等。 流式细胞仪(Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技 术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技 术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。
模拟数字转换器
数据储存与分析系统
数据储存
List-Mode Data
Time FSC SSC FITC PE Event 1 0 60 120 39,271 39,271 89 675 Event 2 Event 3
10 30 160 650 65
FITC/PE 双染样本
39,271 30,621
Drop delay • 意义： Drop delay如果能够被准 确确定，就可以保证包裹细胞的液滴 表面不会充上相反的电荷，从而实现 最高的分选纯度及细胞得率
+ +
+
传统液滴延迟时间确定
耗时：0.5到1.5小时 辅助材料：荧光微球、荧光显微镜、 玻片、计算器
• BD 独有专利 Accudrop 技术： Accudrop微球是一种荧光微球， 被位于偏转板下方的红激光激发后，发射光可以透过侧液流监视器 前方的滤光片，用于测量drop delay。
• 直方图：显示单一参数（横坐标）与通道细胞个数（纵坐标） 。一条竖线代表一个细胞信号，多竖线累加形成峰图，一个峰 即一类细胞。 • 二维点图：一个点代表一个细胞信号。 • 等高线图：可显示数据信号的疏密程度。 • 密度图：可显示信号分布的疏密程度。 • 三维图（3D Plot）等
分选系统
1检测 Aria II的喷嘴位于检测点 的下方，因此更换喷嘴后 无需重新调整激光光路 2充电
染色体分选
肿瘤干细胞分选
转染细胞分选
流式网络资源
关键词搜索：FCM，FACS，流式 www.bdbiosciences.com www.cytometry.cn（中文）
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Band Pass
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550 Long Pass (650LP) >550 nm <550 nm
600/100 Band Βιβλιοθήκη Baiduass (600/100) 550 - 650 nm (600?0) <550 nm & >650 nm
Transmitted Blocked
LONG (700nm)
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SHORT (500nm)
650 Short Pass (600SP) <650 nm >650 nm
550 Long Pass (650LP) >550 nm <550 nm
Transmitted Diflected 90
Fluorochromes Overview
1
2
3
电子系统
• 光电转换器：将光信号转换成电信号
光电二极管 光电倍增管（PMT）
• 放大器两种放大方式：
线性放大（lin）
对数放大（log）
线性放大：按光强度的线性关系输出信号。用于FSC， SSC， 细胞周期检测，SP细胞检测及分选等。
• 基因编码蛋白
细胞内标记
• 磷酸化蛋白： • 接收刺激后细胞的动态反应 • 刺激因子对特异位点的作用 • 检测转录后调控 • 特殊蛋白在正常及异常细胞的表达
细胞周期分析
• DNA含量分析 • DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志，有助于癌 变的早期诊断
细胞凋亡
• • • • • 早早期细胞凋亡检测-半胱氨酸蛋白酶法 早期细胞凋亡检测-Annexin-V/PI法 早期细胞凋亡检测-细胞线粒体膜蛋白法 晚期细胞凋亡检测-TUNEL法 晚晚期细胞凋亡检测-DNA含量分析法
流式细胞仪组成
• 液流系统
• 光学系统
• 电子系统
• 数据储存与分析系统
• 分选系统
液流系统
样品流速的选择
• 低流速：一般用于分辨率较高的分析，如DNA分析 • 高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，影响 分型。
光学系统
光信号
FSC detector
Freq
Fluorescence
细胞生理学研究
• 细胞相对大小和颗粒性分析
细胞生理学研究
• 细胞内PH值检测
细胞生理学研究
• Ca2+流动性检测：Ca2+是非常重要的细胞内离子，在细 胞膜到细胞浆的信号传导中起重要的作用。细胞受到刺 激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。 • 最常用的染料：Indo-1,Fluo-3,Fura red
FACSAriaⅡ 分选型流式细胞仪
BD公司生物科学部
BD公司流式细胞仪
FACSCalibur
FACSAriaII
Influx
FACSJazz
LSRII
FACSCantoII
LSRFortessa
FACSVerse
Accuri C6
BD FACSAriaII－分选型流式细胞仪
2008年最新产品
集多种专利技术和完美设计
SSC and Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
前向角散射光信号
11
侧向角散射光信号
荧光信号
Wavelengths
LONG (700nm)
Short Pass Pass Through Filters
SHORT (500nm)
Long Pass
• 仪器性能状态稳定性：质控程序的监控和调整-CS&T仪器质控程序及仪 器状态监控
高灵敏度-弱表达样本检测
Dim staining PE population visible
Dim staining
高灵敏度——稀有样本检测
待测细胞细胞群的比例 并不总是这么高 有时，很低 十万分之一
此时，灵敏度和分辨率至关重要
CS&T仪器质控程序及仪器状态监控
流式细胞术操作流程
• 样品制备 • 流式染色、检测 • 数据分析
细胞悬液的制备
• 单细胞悬液（天然，机械研磨/消化） • 5×105～1×106cells/ml，约0.5～1ml，300目筛网过滤
设置对照及染色
• 阴性对照：自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的 荧光。自发荧光信号为噪声信号。 • 同型对照：自发荧光＋非特异荧光，使用与一抗相同种属来源、相同亚 型、相同剂量的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合产生的背 景染色 • 实验样本：自发荧光＋特异荧光＋非特异荧光 • 补偿对照：双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时，使用单种荧光 素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色， 纠正荧光素发射光谱重叠，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他 的干扰荧光信号
传统透射光路 • 采用长通/短通滤光片 • 光信号经过一次透射，信号损失15-20% • 多色分析时，荧光检测灵敏度降低
八角形/三角形接收装置-BD专利 • 采用全反射双色光镜 • 光信号经过一次反射，信号损失仅5% • 保证多色分析时的荧光检测灵敏度
光电倍增管
长通双色反光镜
带通滤光片
• 细胞通过激光束的流速变慢，激光 照射时间更长，提高了激光激发效 率
• 流动池被光胶耦合在荧光接收物镜 上，提高了荧光收集效率，保证多 色应用中最佳的灵敏度和分辨率 • 固定光路，无需每日调节，机器随 开随用，减少人为可变性，提高实 验重复性
石英杯流动池
Cells injected
Laser
Nozzle
• 定义：Drop delay即液滴延迟时 间，指细胞通过检测区到液滴分离 的间隔时间
•
预先分选Accudrop荧光微球
•
• •
自动准确设置最佳液滴延迟时间
无需手动调节，减少人为误差 保证实验的分选纯度和得率
Sweet Spot自动监控功能
• 液滴断点监测窗口 • 自动调节振幅，维持断点稳定 • 维持最佳液滴延迟状态 • 仪器阻塞报警，保护分选样本不受污染 ，实现分选时无人看管
影响分选细胞的活性的因素：
• • • • 细胞本身 激光功率 液路系统（喷嘴） 分选系统的洁净程度及温度控制
石英杯激发保证了用小功率激 光的效率远远大于大功率空气 激发的效率，光毒性小，很好 的保证细胞活性。
稳定而零剪切力液流系统设计最大程度的保 证了细胞的活性，同时专利的喷嘴设计，进 一步保证了细胞活性。
Aria Ⅱ自动无菌消毒清洗 • 软件向导清洗自动执行 • 无菌分选结果保证，文献支持
既有样本温控系统也有收集仓温控
全自动标准化的无菌清洗流程，密闭式的上 样和分选收集仓，执行一次可以保证整个管 路系统在以后连续4天内菌量为0的最佳效果。
Cytometer Setup & Tracking System
• • • • • • 采用一管CS&T微球，方便检测 微球染料可以被任意激光激发，涵盖常 用染料荧光波谱 自动调整PMT 报告仪器性能参数：Qr，Br，CV，跟 踪仪器状态 自动调整激光延迟和面积因子 BD公司专利技术