蛋白纯化层析技术与工艺放大[高级课件]
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蛋白质层析技术PPT课件
2
蛋白质结构组计划
• 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三 维结构。
• 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 • 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重
组蛋白能够被纯化出来。 • 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成
功的建立。
3
蛋白质层析分离纯化机制
• 电荷不同：离子交换层析 • 大小、形状：凝胶过滤层析 • 疏水区域：疏水层析 • 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀
• FDA规定: 一个生产程序,每次必须产出相同 数量和品质的产品, 否则不会被认可;
• FDA规定: 必须进行蛋白质产品的生物活性 测定 ,测定方法必须证明是规范和有效的,并 且要确保每次生产的产品最后的活性和效 用是一致的;
• FDA规定: 产品必须有确切的可以耐受运输 时间和货架时间;
54
FDA 关于蛋白质产品的重要规定
的）
4
层析介质
• 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生
物大分子失活，没有生物化学毒性—过强 吸附、泄露。
• 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条
件下是稳定的。
• 必要的机械性能：流体中的耐压性、弹
性。
5
化学组成：亲水多孔高聚物等
亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析 溶液中加一定浓度的盐。
6
聚合物机体孔的结构
27
平台的操作（软件：知识结构）
• 实验室规模的层析应采用不大于50 µm的离 子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则 不少于 600个理论塔板。
• 精制：高效预装柱1 - 5 ml，10 µm左右粒 度，如Mono系列等。
• 通常条件下，采用15 µm的 Resource精制 也可以达到较好效果。
蛋白质结构组计划
• 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三 维结构。
• 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 • 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重
组蛋白能够被纯化出来。 • 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成
功的建立。
3
蛋白质层析分离纯化机制
• 电荷不同：离子交换层析 • 大小、形状：凝胶过滤层析 • 疏水区域：疏水层析 • 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀
• FDA规定: 一个生产程序,每次必须产出相同 数量和品质的产品, 否则不会被认可;
• FDA规定: 必须进行蛋白质产品的生物活性 测定 ,测定方法必须证明是规范和有效的,并 且要确保每次生产的产品最后的活性和效 用是一致的;
• FDA规定: 产品必须有确切的可以耐受运输 时间和货架时间;
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FDA 关于蛋白质产品的重要规定
的）
4
层析介质
• 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生
物大分子失活，没有生物化学毒性—过强 吸附、泄露。
• 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条
件下是稳定的。
• 必要的机械性能：流体中的耐压性、弹
性。
5
化学组成：亲水多孔高聚物等
亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析 溶液中加一定浓度的盐。
6
聚合物机体孔的结构
27
平台的操作（软件：知识结构）
• 实验室规模的层析应采用不大于50 µm的离 子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则 不少于 600个理论塔板。
• 精制：高效预装柱1 - 5 ml，10 µm左右粒 度，如Mono系列等。
• 通常条件下，采用15 µm的 Resource精制 也可以达到较好效果。
蛋白质化学中的层析技术PPT课件
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蛋白质化学中的层析技术PPT 课件
目
CONTENCT
录
• 层析技术简介 • 层析技术在蛋白质分离纯化中的应
用 • 层析技术原理 • 层析技术的应用实例 • 层析技术的优缺点及展望
01
层析技术简介
层析技术的定义
层析技术
是一种分离和纯化混合物中各组分的方法，基于各 组分在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
05
层析技术的优缺点及展望
层析技术的优点
分离效果好
层析技术能够根据分子间的吸附、分配等作用力 的差异，将混合物中的组分进行有效的分离，得 到高纯度的产物。
适用范围广
层析技术可以应用于不同性质的混合物分离，如 有机物、无机物、离子、蛋白质等，具有广泛的 适用范围。
分离过程可重复
层析技术是一种物理分离方法，不涉及化学反应 ，因此分离过程可以重复进行，适用于大规模分 离和制备。
凝胶过滤层析原理
原理概述
凝胶过滤层析是一种基于分子 大小差异的分离技术。通过不 同孔径的凝胶介质，不同大小 的分子会以不同的速度通过凝 胶，从而实现分离。
应用范围
凝胶过滤层析常用于蛋白质、 多糖等大分子物质的分离和纯 化。
技术特点
操作简便、分离效果好、分辨 率高。
离子交换层析原理
01 02
原理概述
1950年代
随着凝胶技术的发展，凝胶层 析、电泳等新型层析技术逐渐 兴起。
1970年代至今
层析技术不断改进和创新，应 用范围越来越广泛，成为生物 化学领域中重要的分离分析方 法。
层析技术的分类
根据固定相和流动相的物理状态
可分为液相层析和气相层析。液相层析又可分为液-固层析和液液层析，是生物分子分离纯化中最常用的技术。
蛋白纯化课件ppt
5. 收集洗脱液并进行检测，确 定蛋白质的纯度和浓度。
6. 对实验结果进行分析和总结 。
实验操作流程
实验前准备
确保实验器材和试剂 的清洁和完好，准备 好实验记录本。
样品处理
将蛋白质样品加入离 心机中进行离心分离 ，收集上清液。
层析分离
使用注射器将上清液 注入层析柱中，根据 蛋白质的性质选择合 适的洗脱液进行洗脱 。
3
食品加工技术优化
研究食品加工过程中蛋白质的变化和作用，优化 加工工艺。
环境监测领域
污染物的生物标志物
纯化特定环境污染物结合的蛋白，作为污染物存在的生物 标志物。
生态毒理学研究
纯化环境中的毒性蛋白，研究其对生态系统的影响和作用 机制。
生态修复与治理
利用纯化的微生物降解酶，研究环境修复和治理的新方法 。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
应用
凝胶过滤法常用于分离纯化蛋白质、 酶、核酸等生物大分子，尤其适用于 分离分子量相近的蛋白质或多肽。
CHAPTER 03
蛋白纯化的步骤
样品准备
样品来源
选择合适的生物样品，如 细胞、组织或培养液，确 保样品中目标蛋白的含量 较高。
细胞破碎
采用物理或化学方法破碎 细胞，释放细胞内的蛋白 质。
去除杂质
通过离心、过滤等方法去 除细胞碎片、颗粒物等杂 质。
粗分离
离心分离
根据蛋白质的密度和大小差异，采用离心法 进行初步分离。
沉淀与溶解
通过调节溶液的pH值、离子强度或添加有机溶剂， 使蛋白质沉淀，再通过溶解将蛋白质重新溶解在适 宜的缓冲液中。
凝胶电泳分离
利用电泳技术将蛋白质在凝胶上进行分离， 根据蛋白质的电荷和大小进行分离。
蛋白质分离纯化PPT课件
低速离心机 高速离心机 超速离心机
2021/3/12
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离心操作要领
根据待离心的溶液性质和体积选择合 适的离心管 离心管连外套管一起平衡
对称方向放入离心机中（转子对角线）
当离心速度减为零时，方可打开离心 机盖
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离心操作要领
离心前一定要配平，配平后放入离心机转子对角线
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中性盐： (NH4)2SO4、 Na2SO4、 NaCl 优点：蛋白质不变性
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1 盐析法
蛋白质分子颗粒大小和亲水程
影响因素：
度不同 相对分子质量和所带电荷不同
➢ pH值：被分离的蛋白质在其等电点附近效果最好
➢ 盐的饱和度：盐的饱和度不同析出的蛋白质也不相同
100% (NH4 )2SO4 ：主要清蛋白沉淀 50% (NH4 )2SO4 ：主要球蛋白都沉淀 33% (NH4 )2SO4：主要γ -球蛋白沉淀
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人血清中几种主要蛋白质组分*
血清蛋白 质
清蛋白
等电点 4.64
分子量 69,000
占蛋白质 总量%
57～72
α1-球蛋白 5.06
200,000
2～5
α2-球蛋白 5.06 β-球蛋白 5.12
300,000
90,000～ 150,000
4～9 6.5～12
γ-球蛋白
6.85～ 7.3
156,000～ 950,000
基本操作
玻璃仪器的洗涤
➢ 需要清洗的玻璃仪器：
试管、烧杯、比色盘、乳头吸管、层析柱等
➢ 洗涤方法：
自来水（＞7次）蒸馏水（＞3次）干燥备用
清洁标准
蛋白的分离纯化详解课件PPT
的分离。 2021/3/10
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电泳（electrophoresis）
• 带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电 极移动的现象称为电泳。蛋白质在电场中 泳动时，受到电场力和摩擦力两种方向相 反的力的作用
• 蛋白质因带电、大小和形状不同而在直流 电场中泳动速度不同。
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常用蛋白质电泳技 术
2021/3/10
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3. 亲和层析
• 以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子 的特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗 原与抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。
• 将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之 固定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。
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各种用于抗体识别的标记
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蛋白质的纯化
• 粗分离只是使蛋白质得到浓缩和初步分离 纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大 小、分子形状、分子表面特征或分子带电 状况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。
• 常用的实验技术：层析（离子交换等）和 电泳
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1. 离子交换层析
固相支持物：纤维素、琼脂糖、葡聚糖等高分子聚 合物
• 方法：尿素变性复性从包涵体中纯 化原核表达蛋白
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二、蛋白质的分离纯化
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10
分离纯化流程
原材料的获取
预处理 （沉淀）
纯化
细胞破碎
研磨 超声 渗透压 酶 ……
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蛋白溶解
酸、碱 醇 去垢剂 尿素 ……
粗提
沉淀 相分离 分子筛 ……
精提
各种色谱 电泳分离 差速离心 ……
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
整理ppt
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
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• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
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一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
《蛋白表达纯化》课件
基础研究领域
用于解析蛋白质结构与功能、 探究生物过程和疾病机制等。
02
蛋白表达系统
原核表达系统
操作简便
原核表达系统通常在相对较低的 成本和较短的时间内实现蛋白表 达。
高表达量
原核细胞具有较高的繁殖速度， 因此可以快速获得大量的目标蛋 白。
原核表达系统
• 蛋白翻译后修饰少：原核细胞没有真核细胞复杂的翻译后 修饰机制，因此表达的蛋白通常不需要复杂的纯化步骤。
案例三：融合蛋白的表达与纯化
总结词
融合蛋白表达纯化的优势和应用
详细描述
融合蛋白是指将两个或多个蛋白质序列融合在一起形成的单一蛋白质。这种技术常用于 蛋白质标签、蛋白质相互作用研究、抗体药物等领域。融合蛋白的表达纯化具有一定的 复杂性，但通过选择合适的融合伙伴和优化表达纯化条件，可以获得高纯度和稳定性的
实验试剂的储存与使用
实验试剂应按照规定的要求进行储存， 避免因储存不当导致试剂变质或失效。
使用前应仔细核对试剂的名称、浓度、 使用过程中应控制试剂的用量，避免浪
有效期等信息，确保使用正确的试剂。
费和环境污染。
06
案例分析
案例一：重组蛋白的表达与纯化
总结词
重组蛋白表达纯化的基本流程和技术要点
详细描述
重组蛋白表达纯化是生物技术领域中常见的技术手段，主要涉及基因克隆、载体构建、转化、诱导表 达、纯化等步骤。其中，选择合适的载体和宿主细胞、优化表达条件以及纯化方案的制定是关键。
案例二：膜蛋白的表达与纯化
总结词
膜蛋白表达纯化的特殊技术和挑战
详细描述
膜蛋白是一类特殊的蛋白质，它们嵌入细胞膜中，具有跨膜结构域。膜蛋白的表达和纯化相对于可溶性蛋白具有 一定的难度。常用的表达系统包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等。纯化时需考虑保持膜蛋白的天然状态和功能。
蛋白纯化技术简介课件
蛋白纯化技术简介课件CATALOGUE目录•蛋白纯化技术概述•蛋白纯化技术方法•蛋白纯化步骤与流程•蛋白纯化技术挑战与解决方案•蛋白纯化技术展望与发展趋势•蛋白纯化技术案例分析CATALOGUE蛋白纯化技术概述蛋白纯化目的蛋白纯化的定义与目的各种方法基于不同的物理或化学原理，如电荷分布、分子大小、特异性结合等，实现对蛋白质的分离与纯化。
蛋白纯化技术的分类与原理原理分类蛋白纯化技术的应用领域01020304生物化学研究临床诊断制药工业食品工业CATALOGUE蛋白纯化技术方法应用盐析法在蛋白纯化中应用广泛，适用于大多数蛋白质的纯化。
原理盐析法主要是利用蛋白质在低盐浓度时溶解度降低，高盐浓度时溶解度升高的特性，通过在中间盐浓度时加热或静置，使溶解度降低的蛋白质析出。
优缺点盐析法操作简单，成本低，但有时会造成蛋白质的变性，影响其生物活性。
盐析法原理凝胶色谱法主要用于蛋白质分子量的分离和纯化。
应用优缺点原理应用优缺点030201原理应用优缺点电泳法原理应用优缺点膜分离法CATALOGUE蛋白纯化步骤与流程初步分离缓冲液置换细胞破碎粗分离阶段03疏水相互作用色谱01亲和色谱02离子交换色谱精细分离阶段质谱分析HPLC分析SDS-PAGE电泳纯度检测与鉴定阶段CATALOGUE蛋白纯化技术挑战与解决方案1 2 3亲和色谱法离子交换色谱法凝胶过滤色谱法杂蛋白的去除选择合适的纯化方法根据蛋白的性质和纯化要求，选择适合的纯化方法，以尽可能提高目标蛋白的回收率。
优化实验条件对实验条件进行优化，如pH值、温度、离子强度等，以提高目标蛋白的回收率。
多次纯化将纯化过程分为多个步骤，每个步骤针对不同的杂质进行去除，从而提高目标蛋白的回收率。
目标蛋白的回收率添加保护剂避免剧烈操作低温操作蛋白的稳定性与活性保持CATALOGUE蛋白纯化技术展望与发展趋势纳米材料新型介质新材料与技术的发展集成化自动化集成化与自动化技术进步生物药物研发蛋白纯化技术在生物药物研发中具有重要作用。
蛋白纯化层析技术和工艺放大
原理
离子交换层析基于蛋白质带电性质差 异分离蛋白质。在一定pH值下，蛋白 质带电性质不同，与离子交换剂上的 离子发生交换，从而实现分离。
应用
离子交换层析常用于分离和纯化特定 类型的蛋白质，如酶、激素和抗体等。
疏水层析
原理
疏水层析基于蛋白质疏水性差异分离蛋白质。蛋白质与疏水配体结合后，通过改变流动相的pH值或离子强度， 使蛋白质与配体间的疏水相互作用减弱而分离。
原理
层析技术基于不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡差异，从而实现分离。 目标蛋白与固定相的相互作用力较强，随着流动相的流动，逐渐从固定相中解 离并被收集。
常用蛋白纯化层析技术
凝胶过滤层析
利用不同大小的蛋白质分子在凝胶上 的扩散速度不同实现分离。常用凝胶 有Sepharose、Sephacryl等。
蛋白纯化层析技术的应用场景
生物药物研发
用于分离和纯化抗体、酶、蛋白质等生物药 物，提高药物的纯度和质量。
蛋白质组学研究
用于鉴定和分离蛋白质，促进蛋白质结构和 功能的研究。
细胞培养与分离
用于分离和纯化细胞中的蛋白质、细胞器等， 研究细胞内各组分的相互作用。
食品安全与质量控制
用于检测和纯化食品中的蛋白质，确保食品 的安全和质量。
标准化操作程序
制定标准化的操作程序，确保每批次 分离效果的稳定性和一致性。
流速与压力控制
采用先进的流速和压力控制系统，确 保分离过程中的稳定性和层析柱寿命。
放大效应评估
在小规模试验阶段对放大效应进行评 估，以便预测和解决大规模生产中可 能出现的问题。
05
未来展望与研究方向
新技术与新方法的发展
01
03
工艺放大技术
蛋白质分离纯化技术ppt课件
.
10
紫外分光光度法测定蛋白质含量的 实验原理
1.蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基含有共轭双键， 使蛋白质具有吸收近紫外光的性质。吸收高峰在280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
2.蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。 利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓 度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
.
24
考马斯亮兰G-250
实验原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白 质结合，使染料的最大吸收峰的位置(max),由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为， 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸和赖
氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
.
6
测定分两步：
① 用沸浓硫酸消化，并以硫酸铜为催化剂，使碳、氢分 别以二氧化碳及水蒸汽形态逸去，而氮转为铵盐。此 过程需时较长，可达数小时。
② 加碱，并将氨自碱液中蒸至标准酸液中，测定中和氨 所消耗的酸量，计算出样品中含氮量，再乘以6．25 （经验平均值），则得蛋白质含量。
.
7
反应：以甘氨酸为例
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶 剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度 值A280。蛋白质浓度可控制在0.1～ 1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准 石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此 可立即计算出蛋白质的大致浓度。
（二）Folin－酚试剂法（Lowry法）
实验原理:蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu2+反 应，生产紫红色蛋白质-Cu2+复合物，这一复合物 中的氨基酸残基（主要是酪氨酸、色氨酸、半胱 氨酸）还原Folin—酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸 盐，产生钼兰和钨兰复合物的深兰色（745750nm），颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
蛋白质纯化技术PPT幻灯片课件
超速离心法 (ultracentrifugation)：~60万 g ， 6万~8万 r/min。可用来测定蛋白质分子 量。
16
• 超速离心
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1.2分子形状
• 形状
▫ 蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝 胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受 到分子形状的影响。
• 方法
▫ 梯度离心 ▫ 电泳
1
蛋白质的分离纯化与鉴定
Isolation, Purification and Identification of Protein
2
分子生物学圣经—分子克隆实验指南
3
为什么要纯化蛋白质？
蛋白质是生命功能的执行者
• 理论意义：深入研究某种蛋白质的功能 以及作用机制，如信号通路中的蛋白 质…
• 应用价值---蛋白质工程 医药、工业、科研… 作为药物靶点…
25
2. 分离方法
在实验操作上，分为： •沉淀法 •离心法 •电泳法 •超滤法 •相分配法 •层析法
26
27
•Note
*不可能有一套统一的方法适用于分离纯 化所有的蛋白质，
*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分 离纯化程序，
*而且所用的主要技术手段都基本相同。
28
二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
23
1.6吸附性质
• 原理 蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、 陶瓷、塑料等。
• 方法
▫ 疏水层析
24
1.7变性和复性
• 原理
▫ 变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有 的空间结构、生物学功能及部分理化特性。
▫ 复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构 及生物学功能。
• 方法
▫ 如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中 纯化原核表达蛋白
16
• 超速离心
17
1.2分子形状
• 形状
▫ 蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝 胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受 到分子形状的影响。
• 方法
▫ 梯度离心 ▫ 电泳
1
蛋白质的分离纯化与鉴定
Isolation, Purification and Identification of Protein
2
分子生物学圣经—分子克隆实验指南
3
为什么要纯化蛋白质？
蛋白质是生命功能的执行者
• 理论意义：深入研究某种蛋白质的功能 以及作用机制，如信号通路中的蛋白 质…
• 应用价值---蛋白质工程 医药、工业、科研… 作为药物靶点…
25
2. 分离方法
在实验操作上，分为： •沉淀法 •离心法 •电泳法 •超滤法 •相分配法 •层析法
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27
•Note
*不可能有一套统一的方法适用于分离纯 化所有的蛋白质，
*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分 离纯化程序，
*而且所用的主要技术手段都基本相同。
28
二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
23
1.6吸附性质
• 原理 蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、 陶瓷、塑料等。
• 方法
▫ 疏水层析
24
1.7变性和复性
• 原理
▫ 变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有 的空间结构、生物学功能及部分理化特性。
▫ 复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构 及生物学功能。
• 方法
▫ 如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中 纯化原核表达蛋白
相关主题
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54
过滤技术的分类
按照过滤操作方式分： 死端过滤( Normal Flow Filtration ,
NFF )
切向流过滤( Cross -flow Filtration, CFF)
精制课件
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切向流过滤
切向流过滤又称错流过滤，过滤过程中 平行于膜的切向流不断清洗冲刷膜表面， 有效的缓解膜表面滤饼层和浓差极化层 的形成，避免过滤阻力的快速增加，有 利于保持稳定的过滤流速和压力，从而 实现更高的膜过滤处理量，延长滤膜寿 命
（1）样品、试剂：样品来源（原核或真核、 胞内或胞外等），目标蛋白的性质（等电点、
分子量、稳定性等），缓冲液（pH、溶质类 型、盐离子浓度等）
（2）介质的选择（离子、疏水、亲和填料， 介质的化学耐受性、强度，载量，不同批次 介质的稳定性）
（3）质量合格，符合GMP要求，生产成本，
（4）微滤膜用于蛋白澄清去除细胞碎片具有更好的 目标蛋白收率：例如中空纤维0.1µm滤膜用于较难 过滤的大肠杆菌裂解液澄清，保护层析柱。
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过滤操作方式选择
过滤常见的操作方式包括NFF死端过滤和CFF切 向流过滤
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切向流过滤技术的选择
中空纤维柱和平板膜包的优缺点：
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菌种的特性，相关论文、专利，药典，试剂等
亲和层析、离子层析、疏水层析、分子筛、超滤， 层析介质粒径大小，纯化步骤等
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载体构建优化、发酵工艺优化、纯化工艺优化、检测方法选择等
发酵工艺是否能够放大、纯化工艺是否能放大等，工艺稳定性
蛋白质层析技术和工 艺放大
曹杰
2013.05.11
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一、离子交换层析技术 二、亲和层析技术 三、切向流过滤技术 四、工艺放大
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一、
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阴离子交换
阳离子交换
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——基于G蛋白/A蛋白的IgG的纯化
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1. LMW Markers
2. Mouse cell culture, nonredued,diluted 1:10
3. PoolⅠ,unbound material,nonredued,diluted 1:10
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膜孔径选择
(2) 如希望目标物质充分截留，一般需选择膜孔径 小于目标物质直径1/3 – 1/5 ：例如抗体150k的浓缩 和缓冲液置换，一般选择30k或50k超滤膜实现充 分截留.
(3) 超滤膜用于细胞收集速度更快，操作更简单： 例如中空纤维750k超滤膜用于大肠杆菌或昆虫细 胞快速收集，取代离心机。
4. PoolⅡ,purified mouseIgG1, nonredued,diluted 1:10
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如何除去特定的污染物
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三、 切向流过滤技术
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膜过滤原理
膜过滤技术，又称膜分离技术，是使用 一定孔径的过滤介质将不同物质按照大 小和形状进行选择性分级分离的物理分 离方法。
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分辨率: 1 选择性:
填料的性质及所带功能基团的数目、 pH值、离子强度、洗脱条件
2 柱效： 填料颗粒大小、层析柱装填效果
3 样品： 能应用的样品量即样品各成分性质
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切向流过滤技术的选择
中空纤维滤膜具有开放式流道(Open Channel ) ，剪切力低且容尘量高，适合病 毒和蛋白等生物大分子低剪切力的温和超滤
浓缩、可直接处理高固含量高黏度的复杂料
液，如细胞菌体收集、裂解液澄清和硫酸铵 沉淀收集等应用。
平板膜包的筛网流道结构( Screen
Channel ) ，适合无固体颗粒的低黏度低浓
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根据滤膜流道结构形式又可分为中空纤 维柱和平板膜包
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过滤技术的选择
膜孔径选择 过滤操作方式选择 切向流过滤技术选择
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膜孔径选择
(1)如希望目标物质透过膜孔，一般选择膜 孔径大小为目标物质直径5 - 10倍以上以 降低过滤阻力，提高通透性：例如重组 抗体纯化中，CHO 细胞培养液的柱前澄 清，建议使用0.2 或0.45 µ m 中空纤维 微滤膜，可以保持单抗分子( 150 kDa ) 良好的膜通透性，实现高收率。
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二、
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亲和层析原理
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亲和层析的策略
配基与目标蛋白的特异性 尽可能简单 设计洗脱方案
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抗体纯化
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膜过滤技术的优点
（1）快速高效、低能耗、硬件设备简单易 于维护；
（2）易于实现全自动化操作和线性放大 （3）膜分离操作条件温和、不涉及相变，
有利于保持生物活性分子的结构和稳定 性。
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过滤技术的分类
按照滤膜孔径范围可以分为常规过 滤、微滤、超滤和反渗透等
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环境安全性：废气废液排放，菌种的处理，选择有关试剂的替 代品
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知识产权的保护，专利什么时候到期？
Regulatory requirements
了解相关法律、法规、验证计划、QA和QC等
如何保证质量？确定分析方法、检测方法、如何保证工
艺稳定性。
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工艺放大（以蛋白纯化为例）
要考虑的问题：
度样品的浓缩，如层析柱之间的缓冲液交换
和浓缩等。
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切向流过滤技术的选择
中空纤维滤膜可以用于微滤或超滤，用于蛋白/ 病毒等浓缩洗滤或直接处理高固含量料液；
而平板膜包常用于澄清料液的超滤浓缩，对于高 固含量高黏度样品的澄清过滤存在较大局限性， 易于堵塞流道。
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四、
Process Scale up 工艺放大