蛋白纯化层析技术与工艺放大[高级课件]
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——基于G蛋白/A蛋白的IgG的纯化
精制课件
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1. LMW Markers
2. Mouse cell culture, nonredued,diluted 1:10
3. PoolⅠ,unbound material,nonredued,diluted 1:10
环境安全性：废气废液排放，菌种的处理，选择有关试剂的替 代品
精制课件
74
知识产权的保护，专利什么时候到期？
Regulatory requirements
了解相关法律、法规、验证计划、QA和QC等
如何保证质量？确定分析方法、检测方法、如何保证工
艺稳定性。
精制课件
75
工艺放大（以蛋白纯化为例）
要考虑的问题：
4. PoolⅡ,purified mouseIgG1, nonredued,diluted 1:10
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如何除去特定的污染物
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三、 切向流过滤技术
精制课件
50
膜过滤原理
膜过滤技术，又称膜分离技术，是使用 一定孔径的过滤介质将不同物质按照大 小和形状进行选择性分级分离的物理分 离方法。
精制课件
51
膜过滤技术的优点
（1）快速高效、低能耗、硬件设备简单易 于维护；
（2）易于实现全自动化操作和线性放大 （3）膜分离操作条件温和、不涉及相变，
有利于保持生物活性分子的结构和稳定 性。
精制课件
52
过滤技术的分类
按照滤膜孔径范围可以分为常规过 滤、微滤、超滤和反渗透等
精制课件
53
精制课件
度样品的浓缩，如层析柱之间的缓冲液交换
和浓缩等。
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切向流过滤技术的选择
中空纤维滤膜可以用于微滤或超滤，用于蛋白/ 病毒等浓缩洗滤或直接处理高固含量料液；
而平板膜包常用于澄清料液的超滤浓缩，对于高 固含量高黏度样品的澄清过滤存在较大局限性， 易于堵塞流道。
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四、
Process Scale up 工艺放大
精制课件
ຫໍສະໝຸດ Baidu61
膜孔径选择
(2) 如希望目标物质充分截留，一般需选择膜孔径 小于目标物质直径1/3 – 1/5 ：例如抗体150k的浓缩 和缓冲液置换，一般选择30k或50k超滤膜实现充 分截留.
(3) 超滤膜用于细胞收集速度更快，操作更简单： 例如中空纤维750k超滤膜用于大肠杆菌或昆虫细 胞快速收集，取代离心机。
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根据滤膜流道结构形式又可分为中空纤 维柱和平板膜包
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过滤技术的选择
膜孔径选择 过滤操作方式选择 切向流过滤技术选择
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膜孔径选择
(1)如希望目标物质透过膜孔，一般选择膜 孔径大小为目标物质直径5 - 10倍以上以 降低过滤阻力，提高通透性：例如重组 抗体纯化中，CHO 细胞培养液的柱前澄 清，建议使用0.2 或0.45 µ m 中空纤维 微滤膜，可以保持单抗分子( 150 kDa ) 良好的膜通透性，实现高收率。
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分辨率: 1 选择性:
填料的性质及所带功能基团的数目、 pH值、离子强度、洗脱条件
2 柱效： 填料颗粒大小、层析柱装填效果
3 样品： 能应用的样品量即样品各成分性质
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二、
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亲和层析原理
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亲和层析的策略
配基与目标蛋白的特异性 尽可能简单 设计洗脱方案
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抗体纯化
（4）微滤膜用于蛋白澄清去除细胞碎片具有更好的 目标蛋白收率：例如中空纤维0.1µm滤膜用于较难 过滤的大肠杆菌裂解液澄清，保护层析柱。
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62
过滤操作方式选择
过滤常见的操作方式包括NFF死端过滤和CFF切 向流过滤
精制课件
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切向流过滤技术的选择
中空纤维柱和平板膜包的优缺点：
54
过滤技术的分类
按照过滤操作方式分： 死端过滤( Normal Flow Filtration ,
NFF )
切向流过滤( Cross -flow Filtration, CFF)
精制课件
55
切向流过滤
切向流过滤又称错流过滤，过滤过程中 平行于膜的切向流不断清洗冲刷膜表面， 有效的缓解膜表面滤饼层和浓差极化层 的形成，避免过滤阻力的快速增加，有 利于保持稳定的过滤流速和压力，从而 实现更高的膜过滤处理量，延长滤膜寿 命
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切向流过滤技术的选择
中空纤维滤膜具有开放式流道(Open Channel ) ，剪切力低且容尘量高，适合病 毒和蛋白等生物大分子低剪切力的温和超滤
浓缩、可直接处理高固含量高黏度的复杂料
液，如细胞菌体收集、裂解液澄清和硫酸铵 沉淀收集等应用。
平板膜包的筛网流道结构( Screen
Channel ) ，适合无固体颗粒的低黏度低浓
蛋白质层析技术和工 艺放大
曹杰
2013.05.11
精制课件
1
一、离子交换层析技术 二、亲和层析技术 三、切向流过滤技术 四、工艺放大
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一、
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阴离子交换
阳离子交换
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菌种的特性，相关论文、专利，药典，试剂等
亲和层析、离子层析、疏水层析、分子筛、超滤， 层析介质粒径大小，纯化步骤等
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载体构建优化、发酵工艺优化、纯化工艺优化、检测方法选择等
发酵工艺是否能够放大、纯化工艺是否能放大等，工艺稳定性
（1）样品、试剂：样品来源（原核或真核、 胞内或胞外等），目标蛋白的性质（等电点、
分子量、稳定性等），缓冲液（pH、溶质类 型、盐离子浓度等）
（2）介质的选择（离子、疏水、亲和填料， 介质的化学耐受性、强度，载量，不同批次 介质的稳定性）
（3）质量合格，符合GMP要求，生产成本，
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1. LMW Markers
2. Mouse cell culture, nonredued,diluted 1:10
3. PoolⅠ,unbound material,nonredued,diluted 1:10
环境安全性：废气废液排放，菌种的处理，选择有关试剂的替 代品
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74
知识产权的保护，专利什么时候到期？
Regulatory requirements
了解相关法律、法规、验证计划、QA和QC等
如何保证质量？确定分析方法、检测方法、如何保证工
艺稳定性。
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工艺放大（以蛋白纯化为例）
要考虑的问题：
4. PoolⅡ,purified mouseIgG1, nonredued,diluted 1:10
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如何除去特定的污染物
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三、 切向流过滤技术
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膜过滤原理
膜过滤技术，又称膜分离技术，是使用 一定孔径的过滤介质将不同物质按照大 小和形状进行选择性分级分离的物理分 离方法。
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51
膜过滤技术的优点
（1）快速高效、低能耗、硬件设备简单易 于维护；
（2）易于实现全自动化操作和线性放大 （3）膜分离操作条件温和、不涉及相变，
有利于保持生物活性分子的结构和稳定 性。
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过滤技术的分类
按照滤膜孔径范围可以分为常规过 滤、微滤、超滤和反渗透等
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度样品的浓缩，如层析柱之间的缓冲液交换
和浓缩等。
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切向流过滤技术的选择
中空纤维滤膜可以用于微滤或超滤，用于蛋白/ 病毒等浓缩洗滤或直接处理高固含量料液；
而平板膜包常用于澄清料液的超滤浓缩，对于高 固含量高黏度样品的澄清过滤存在较大局限性， 易于堵塞流道。
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四、
Process Scale up 工艺放大
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ຫໍສະໝຸດ Baidu61
膜孔径选择
(2) 如希望目标物质充分截留，一般需选择膜孔径 小于目标物质直径1/3 – 1/5 ：例如抗体150k的浓缩 和缓冲液置换，一般选择30k或50k超滤膜实现充 分截留.
(3) 超滤膜用于细胞收集速度更快，操作更简单： 例如中空纤维750k超滤膜用于大肠杆菌或昆虫细 胞快速收集，取代离心机。
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根据滤膜流道结构形式又可分为中空纤 维柱和平板膜包
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过滤技术的选择
膜孔径选择 过滤操作方式选择 切向流过滤技术选择
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膜孔径选择
(1)如希望目标物质透过膜孔，一般选择膜 孔径大小为目标物质直径5 - 10倍以上以 降低过滤阻力，提高通透性：例如重组 抗体纯化中，CHO 细胞培养液的柱前澄 清，建议使用0.2 或0.45 µ m 中空纤维 微滤膜，可以保持单抗分子( 150 kDa ) 良好的膜通透性，实现高收率。
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分辨率: 1 选择性:
填料的性质及所带功能基团的数目、 pH值、离子强度、洗脱条件
2 柱效： 填料颗粒大小、层析柱装填效果
3 样品： 能应用的样品量即样品各成分性质
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二、
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亲和层析原理
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亲和层析的策略
配基与目标蛋白的特异性 尽可能简单 设计洗脱方案
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抗体纯化
（4）微滤膜用于蛋白澄清去除细胞碎片具有更好的 目标蛋白收率：例如中空纤维0.1µm滤膜用于较难 过滤的大肠杆菌裂解液澄清，保护层析柱。
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过滤操作方式选择
过滤常见的操作方式包括NFF死端过滤和CFF切 向流过滤
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切向流过滤技术的选择
中空纤维柱和平板膜包的优缺点：
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过滤技术的分类
按照过滤操作方式分： 死端过滤( Normal Flow Filtration ,
NFF )
切向流过滤( Cross -flow Filtration, CFF)
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切向流过滤
切向流过滤又称错流过滤，过滤过程中 平行于膜的切向流不断清洗冲刷膜表面， 有效的缓解膜表面滤饼层和浓差极化层 的形成，避免过滤阻力的快速增加，有 利于保持稳定的过滤流速和压力，从而 实现更高的膜过滤处理量，延长滤膜寿 命
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切向流过滤技术的选择
中空纤维滤膜具有开放式流道(Open Channel ) ，剪切力低且容尘量高，适合病 毒和蛋白等生物大分子低剪切力的温和超滤
浓缩、可直接处理高固含量高黏度的复杂料
液，如细胞菌体收集、裂解液澄清和硫酸铵 沉淀收集等应用。
平板膜包的筛网流道结构( Screen
Channel ) ，适合无固体颗粒的低黏度低浓
蛋白质层析技术和工 艺放大
曹杰
2013.05.11
精制课件
1
一、离子交换层析技术 二、亲和层析技术 三、切向流过滤技术 四、工艺放大
精制课件
2
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3
一、
精制课件
4
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5
阴离子交换
阳离子交换
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菌种的特性，相关论文、专利，药典，试剂等
亲和层析、离子层析、疏水层析、分子筛、超滤， 层析介质粒径大小，纯化步骤等
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载体构建优化、发酵工艺优化、纯化工艺优化、检测方法选择等
发酵工艺是否能够放大、纯化工艺是否能放大等，工艺稳定性
（1）样品、试剂：样品来源（原核或真核、 胞内或胞外等），目标蛋白的性质（等电点、
分子量、稳定性等），缓冲液（pH、溶质类 型、盐离子浓度等）
（2）介质的选择（离子、疏水、亲和填料， 介质的化学耐受性、强度，载量，不同批次 介质的稳定性）
（3）质量合格，符合GMP要求，生产成本，